Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore
Summary
Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l’attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell’UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.
Abstract
Il sistema ubiquitina-proteasoma è un regolatore chiave della degradazione delle proteine e una varietà di altri processi cellulari negli eucarioti. Nel cervello, gli aumenti dell’attività onniquitina-proteasomico sono fondamentali per la plasticità sinaptica e la formazione della memoria e i cambiamenti aberranti in questo sistema sono associati a una varietà di disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici. Uno dei problemi nello studio del funzionamento dell’ubiquitina-proteasoma nel cervello è che è presente in tutti i compartimenti cellulari, in cui i bersagli proteici, il ruolo funzionale e i meccanismi di regolazione possono variare ampiamente. Di conseguenza, la capacità di confrontare direttamente il targeting delle proteine dell’ubiquitina cerebrale e l’attività catalitica proteasosa in diversi compartimenti subcellulari all’interno dello stesso animale è fondamentale per comprendere appieno come l’UPS contribuisce alla plasticità sinaptica, memoria e malattia. Il metodo qui descritto consente la raccolta di frazioni sinaptiche nucleari, citoplasmatiche e grezze dallo stesso cervello di roditore (ratto), seguite dalla quantificazione simultanea dell’attività catalitica proteasome (indirettamente, fornendo attività del nucleo proteasome solo) e l’etichettatura della proteina ubiquitina specifica del collegamento. Così, il metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente i cambiamenti subcellulari nell’attività ubiquitina-proteasomesome in diverse regioni del cervello nello stesso animale durante plasticità sinaptica, formazione della memoria e diversi stati di malattia. Questo metodo può essere utilizzato anche per valutare la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all’interno dello stesso animale.
Introduction
Il sistema onniquitina-proteasoso (UPS) è una complessa rete di strutture proteiche e legamenti interconnessi che controlla la degradazione della maggior parte delle proteine di breve durata nelle cellule1. In questo sistema, le proteine sono contrassegnate per la degradazione o altri processi cellulari / destini dal piccolo modificatore ubiquitin. Una proteina bersaglio può acquisire 1-7 modifiche dell’ubiquitina, che possono collegarsi in uno dei sette siti di lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) o la methionina N-terminale (M1; come noto come lineare) nella precedente ubiquitina2. Alcuni di questi tag di poliubiquitina sono specifici per degradazione (K48)3, mentre altri sono in gran parte indipendenti dal processo di degradazione delle proteine (M1)4,5,6. Pertanto, il processo di ubiquitinazione delle proteine è incredibilmente complesso e la capacità di quantificare i cambiamenti in un tag poliubiquitin specifico è fondamentale per comprendere in ultima analisi il ruolo di quella data modifica nel funzionamento cellulare. Complicando ulteriormente lo studio di questo sistema, il proteasome, cheè la struttura catalitica dell’UPS 7, degrada le proteine ma può anche essere coinvolto in altri processi non proteolitici8,9. Non sorprende quindi, dalla sua scoperta iniziale, l’attività ubiquitina-proteasosa normale e aberrante è stata implicata nella formazione della memoria a lungo termine e in una varietà di stati di malattia, tra cui molti disturbi10,11. Di conseguenza, i metodi in grado di quantificare in modo efficace ed efficiente l’attività dell’UPS nel cervello sono fondamentali per comprendere in ultima analisi come questo sistema è disregolato negli stati di malattia e l’eventuale sviluppo di opzioni di trattamento rivolte all’ubiquitina e/o funzionamento proteasome.
Ci sono una serie di problemi nella quantificazione dell’attività di ubiquitina-proteasososo nel tessuto cerebrale da ratti e topi, che sono i sistemi modello più comuni utilizzati per studiare la funzione UPS, tra cui 1) la diversità delle modifiche dell’ubiquitina, e 2) distribuzione e regolazione differenziale dell’UPS funzionante attraverso scomparti subcellulari12,13,14. Per esempio, molte delle prime dimostrazioni della funzione ubiquitina-proteasosomico nel cervello durante la formazione della memoria utilizzato lisato intere cellule e indicato aumenti dipendenti dal tempo in entrambi l’ubiquitinazione delle proteine e l’attività proteasomiana15, 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20. Tuttavia, recentemente abbiamo scoperto che l’attività di ubiquitina-proteasososo variava ampiamente attraverso i compartimenti subcellulari in risposta all’apprendimento, con aumenti simultanei in alcune regioni e diminuzioni in altre, un modello che differiva in modo significativo da quanto descritto in precedenza in lisati intericellulari 21. Ciò è coerente con la limitazione di un approccio a tutta la cellula, in quanto non può dissociare il contributo dei cambiamenti nell’attività UPS in diversi compartimenti subcellulari. Anche se studi più recenti hanno impiegato protocolli di frazione sinaptica per studiare l’UPS specificamente nelle sinapsi in risposta all’apprendimento22,23,24, i metodi utilizzati occllude la capacità di misurare cambiamenti nucleari e citoplasmaici dell’ubiquitina-proteasososo nello stesso animale. Ciò si traduce in un bisogno inutile di ripetere gli esperimenti più volte, raccogliendo una frazione subcellulare diversa in ciascuno. Questo non solo comporta una maggiore perdita di vite umane, ma elimina la capacità di confrontare direttamente l’attività UPS attraverso diversi compartimenti subcellulari in risposta a un determinato evento o durante uno stato di malattia specifico. Considerando che gli obiettivi proteici dell’ubiquitina e del proteasoso variano ampiamente in tutta la cellula, comprendere come la segnalazione onniquitina-proteasome sia diversa nei compartimenti subcellulari distinti è fondamentale per identificare il ruolo funzionale dell’UPS neurologico durante la formazione della memoria e disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici.
Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato una procedura in cui le frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche potrebbero essere raccolte per una determinata regione cerebrale dallo stesso animale21. Inoltre, per tenere conto della quantità limitata di proteine che si può ottenere raccogliendo più frazioni subcellulari dallo stesso campione, abbiamo ottimizzato protocolli stabiliti in precedenza per analisi dell’attività proteasome in vitro e proteine in cellule lisci raccolte dal tessuto cerebrale del roditore. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di raccogliere e confrontare direttamente i cambiamenti dipendenti dall’apprendimento nell’attività proteasosa, K48, K63, M1 e i livelli complessivi di poliubiquitinazione proteica nel nucleo e nel citoplasma e nelle sinapsi nell’amigdala laterale dei ratti. In questo articolo viene descritta in dettaglio la procedura (Figura 1), che potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione di come l’UPS è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine e in vari stati di malattia. Tuttavia, va notato che l’attività proteasome in vitro discussa nel nostro protocollo, anche se ampiamente utilizzata, non misura direttamente l’attività di complessi proteasome 26S completi. Piuttosto, questo saggio misura l’attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l’attività del nucleo stesso rispetto all’intero complesso proteasome 26S.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, dimostriamo un metodo efficiente per quantificare i cambiamenti nell’attività onniquitina-proteasoma attraverso diversi compartimenti subcellulari nello stesso animale. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di misurare i cambiamenti subcellulari nell’attività del sistema ubiquitina-proteasoma sono stati limitati a un singolo compartimento per campione, con conseguente necessità di ripetere gli esperimenti. Questo porta a costi significativi e perdita di vita animale. Il nostro protocollo allevia questo prob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio del College of Agricultural and Life Sciences e il College of Science di Virginia Tech.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
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