Summary
Rotte bryst spinal hemisection er en verdifull og reproduserbar modell av ensidig ryggmargsskade for å undersøke nevrale mekanismer for Locomotor utvinning og behandling effekt. Denne artikkelen inneholder en detaljert steg-for-steg-veiledning for å utføre hemisection prosedyren og for å vurdere Locomotor ytelse på en åpen Arena.
Abstract
Ryggmargsskade (SCI) forårsaker forstyrrelser i motor, sensorisk, og autonom funksjon under nivået av lesjon. Eksperimentelle dyremodeller er verdifulle verktøy for å forstå nevrale mekanismer involvert i Locomotor utvinning etter SCI og til design terapi for kliniske populasjoner. Det er flere eksperimentelle SCI modeller inkludert kontusjon, kompresjon, og transection skader som brukes i en rekke arter. En hemisection innebærer ensidig transection av ryggmargen og forstyrrer alle stigende og synkende traktater på den ene siden bare. Spinal hemisection produserer en svært selektiv og reproduserbar skade i forhold til kontusjon eller komprimering teknikker som er nyttig for å undersøke neural plastisitet i spart og skadet trasé forbundet med funksjonell utvinning. Vi presenterer en detaljert steg-for-steg protokoll for å utføre en bryst hemisection på T8 vertebrale nivå i rotte som resulterer i en innledende lammelse av hindlimb bentap på siden av lesjon med gradert spontan utvinning av Locomotor funksjon over flere Uker. Vi tilbyr også en Locomotor scoring protokoll for å vurdere funksjonell utvinning i åpen-feltet. Det Locomotor vurderingen skaffer en lineær det å bli frisk profil og kan utført begge to tidlig og gjentatte ganger etter skaden for at akkurat skjermen dyrene for passende tid meningene i hvilket å oppførsel flere spesialisert opptreden tester. Den hemisection teknikken presenteres kan lett tilpasses andre transection modeller og arter, og Locomotor vurderingen kan brukes i en rekke SCI og andre skader modeller å score Locomotor funksjon.
Introduction
Ryggmargsskade (SCI) er forbundet med alvorlige forstyrrelser i motor, sensorisk, og autonom funksjon. Eksperimentelle dyr modeller av SCI er verdifulle verktøy for å forstå anatomiske og fysiologiske hendelser involvert i SCI patologi, for å undersøke nevrale mekanismer i reparasjon og utvinning, og til skjermen for effekt og sikkerhet for potensielle terapeutiske Intervensjoner. Rotta er de fleste vanligvis anvendt Art inne SCI forskning1. Rat modeller er lave kostnader, lett å reprodusere, og et stort batteri av atferdsmessige tester er tilgjengelige for å vurdere funksjonelle resultater2. Til tross for noen forskjeller i skriftsteder, den Rat ryggmargen aksjer samlet lignende Sensorimotor funksjoner med større pattedyr, inkludert primater3,4. Rotter likeledes aksje analog fysiologisk og opptreden konsekvensene å SCI det knytte til Human5. Ikke-menneskelige primater og store dyremodeller kan gi en nærmere tilnærming av menneskelig SCI6 og er avgjørende for å bevise behandling sikkerhet og effekt før menneskelig eksperimentering, men er mindre vanlig på grunn av etiske og dyrevelferd hensyn, utgifter og regulatoriske krav7.
Rat transection SCI modeller er utført av målrettede avbrudd i ryggmargen med en selektiv lesjon ved hjelp av en disseksjon kniv eller iridektomi saks etter en laminectomy. Sammenlignet med en fullstendig transection, delvis transection inne rotta resultater inne en færre meget streng skaden, lettere postoperativ dyr bekymre, spontan Locomotor det å bli frisk, og flere nær modeller SCI inne human hvilke er hovedsakelig ufullstendig med delvis sparing av vev som forbinder ryggmargen og supraspinal strukturer8. En ensidig hemisection forstyrrer alle stigende og synkende traktater på den ene siden, og produserer målbare og svært reproduserbar Locomotor underskudd, styrking utforskning av underliggende biologiske mekanismer. Den mest fremtredende funksjonell konsekvens av hemisection er en innledende lem lammelse på samme side og under nivået av lesjon med gradert spontan utvinning av Locomotor funksjon over flere uker9,10, 11 flere , 12. den hemisection modellen er spesielt nyttig for å undersøke neural plastisitet av skadede og gjenværende traktater og kretser forbundet med funksjonell utvinning9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Nærmere bestemt er hemisection utført på bryst nivå, det vil si over rygg kretsene som kontrollerer hindlimb bentap bevegelse, spesielt nyttig for å undersøke endringer i Locomotor kontroll. Som en ikke-lineær sammenheng eksisterer mellom lesjon alvorlighetsgrad og Locomotor utvinning etter SCI19, hensiktsmessig atferds-testing for å vurdere funksjonelle resultater er avgjørende i eksperimentelle modeller.
En allsidig akkumulator av opptreden prøver er anvendelig å vurdere spesifikk aspektene av funksjonell Locomotor det å bli frisk inne rotta2,20. Mange Locomotor prøver ikke skaffe pålitelig måler tidlig etter SCI idet rotter er også ufør å oppbacking deres kropp vekt. Et mål på spontan Locomotor ytelse som er følsom for underskudd tidlig etter skade, og krever ikke preoperativ opplæring eller spesialisert utstyr, er gunstig for å overvåke Locomotor utvinning for passende tidspunkt punkter for å supplement spesialiserte atferdsdata testing. The Martinez åpen felt vurdering10, opprinnelig utviklet for å evaluere Locomotor ytelse etter cervical sci i rotte, er en 20-punkts ordenstall score vurdere global Locomotor ytelse under spontan Overground bevegelse i en åpen-feltet. Scoring gjennomføres separat for hvert lem ved hjelp av en vurderingsmatrise som evaluerer spesifikke parametre for en rekke Locomotor tiltak inkludert bevegelse av ledd lem, vekt støtte, siffer posisjon, stepping evner, forlemen-hindlimb bentap koordinering, og hale Posisjon. Vurderings resultatet er avledet fra Beattie og Bresnahan (BBB) åpen felts skala, utformet for å evaluere Locomotor ytelse etter bryst kontusjon21. Det er tilpasset nøyaktig og pålitelig evaluere både forlemen og hindlimb bentap Locomotor funksjon, gjør det mulig for uavhengig vurdering av de ulike scoring parametre som ikke er mottagelig for den hierarkiske scoring av BBB, og gir en lineær utvinning profil10. I tillegg, i forhold til BBB, er vurderingen poengsum følsom og pålitelig i mer alvorlig skade modeller10,11,20,22. Vurderingen score har blitt brukt til å vurdere Locomotor svekkelse i rotte etter cervical10,12 og bryst9 sci alene og i kombinasjon med traumatisk hjerneskade23.
Vi presenterer her en detaljert steg-for-steg protokoll for å utføre en bryst hemisection SCI på T8 vertebrale nivå i den kvinnelige Long-Evans rotte, og for å vurdere hindlimb bentap Locomotor utvinning i åpen-feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentene beskrevet i denne artikkelen ble utført i samsvar med retningslinjene for den kanadiske Council on Animal Care og ble godkjent av etikk komiteen ved Université de Montréal.
1. bryst hemisection kirurgi
- Bruk egnet verneutstyr (hansker, maske og kappe) for å opprettholde en aseptisk miljø for kirurgi. Rengjør operasjonsområdet med alkohol kluter, og plasser sterile kirurgiske forheng over operasjonsfeltet. Sterilisere kirurgiske verktøy og plasser på operasjonsfeltet.
- Bedøve rotta under en blanding av isoflurane gass (3% induksjon, 0,5 − 3% vedlikehold) og oksygen (1 L/min). Bekreft riktig kirurgisk anestesi dybde ved å verifisere fraværet av toe klype og hornhinnen refleks svar. Kontinuerlig overvåke rotte under hele prosedyren, og justere mengden anestesi levering som kreves for å opprettholde kirurgisk bedøvelse dybde.
- Barbere rygg stammen mellom hofte og nakke, plassere rotte på operasjonsfeltet, desinfisere snittet området med alkohol kluter og proviodine løsning, og opprettholde kjernen kroppstemperatur ved 37 ° c ved hjelp av en feedback-kontrollert oppvarming pad overvåkes av rektal Termometer.
- Plasser øye-salve på øynene for å holde dem hydrert og på nytt gjennom hele operasjonen etter behov.
- Lag en 2,5 cm snitt i huden som overliggende T6 − T10 ryggsøylen med en skalpell. Trekke tilbake huden og overfladisk fett med butt disseksjon saks.
Merk: T6 − T10 vertebrale segmenter kan identifiseres enten rostrally av milde palpasjon fra undersiden av hodeskallen som starter fra den merkbare protuberance av de 2nd vertebra24eller caudally ved palpasjon av de mest bakre flytende ribben som vil indusere bevegelse i 13th bryst ryggsøylen. - Skill paravertebral musklene sette inn på rygg aspektet av T7 − T9 virvler med butt disseksjon saks og et selvbilde retractor. Debride og fjerne eventuelle gjenværende vev ved hjelp av fine tang og bomull tippet applikatorer å avdekke spinous prosesser og vertebrale laminae.
Merk: dette, og følgende trinn er kraftig hjulpet av mikroskopisk visualisering (~ 5 − en-en). - Skjær forsiktig de fasetter (zygapophysial ledd) bilateralt på T7 og T8 ryggrad med delikate bein trimming. Skjær rygg bindevevet mellom T8 og T9 vertebrale laminae overfladisk med en skalpell (1 mm dybde) være forsiktig for ikke å skade underliggende ledningen.
- Fjern spinous prosessen av T8 vertebra med bein trimming. Med buet hemostatic tang nøye festet på T7 spinous prosessen, rotere caudal slutten av T8 laminae litt rostrally (~ 20 °), sett bein trimming under T8 lamina, og lage en midtlinjen kutt strekker seg langs lamina. Fortsett laminectomy ved å gjenta kuttene på venstre og høyre side av vertebrale lamina til de tverrgående prosessene for å eksponere ryggmargen.
Merk: Vær forsiktig med å fjerne alle bein fragmenter som er laget fra laminectomy. - Drypp lidokain (2%, 0,1 mL) i eksponert spinal kanalen og fjerne Dura overliggende den T8 spinal segmentet ved hjelp av fine tang og iridektomi saks. Gjenta lidokain administrasjon til den eksponerte ledningen og identifisere midtlinjen av ledningen ved visualisering av en senterlinje som er opprettet mellom de spinous prosessene som strekker seg mellom eksponert T7 − T9 vertebra.
Merk: sammen med de spinous prosessene på T7 og T9 kan den eksponerte rygg roten ganglia på T8 også brukes til å hjelpe til med identifisering av midtlinjen og en 30 G nål kan plasseres i midtlinjen av ledningen for å hjelpe til med den påfølgende hemisection. - Hemisect ryggmargen fra midtlinjen mot den ene siden med en dissekere kniv. Vær forsiktig så du ikke skjære gjennom den fremre spinal arterien på ventrale IDen (ikke Påfør fast press på vertebrale kroppen). Bruke iridektomi saks, nøye skjære gjennom eventuelle gjenværende vev på lesioned side av ryggmargen for å sikre ventrolateral kvadrant er hensiktsmessig transected.
- Sted sterilt saltvann-gjennomvåt hemostatic svamp (~ 6 x 2 mm) i eksponert hulrom over ryggmargen og Sutur muskel lag (4-0 polyglactin 910). Deretter Sutur huden rundt snittstedet.
- Gi tilstrekkelig smertestillende (buprenorfin 0,05 mg/kg subkutan [SC]), antibiotika (enrofloksacin, 10 mg/kg SC), og fylle opp tapte væsker med 5 CC lactated ringer løsning (intraperitoneal [IP]) umiddelbart etter operasjonen.
- Fjerne rotta fra anestesi. Plasser rotta i et varmt miljø under en varmepute eller lampe (~ 33 ° c) til dyret er helt våken.
- Gi supplerende analgesi daglig over de første 3 etter kirurgiske dager og kontinuerlig overvåke for tegn på smerte, vekttap, uriktig vannlating, infeksjon, problemer med sår helbredelse, eller autophagia.
2. åpen-Field testing prosedyre og Locomotor ytelse scoring
- Hånd rotter daglig for 1 uke og venne seg å arenaen for to 5-min møter tidligere å tester å akklimatisere seg å tilværelse plukket opp, mildt fra det midt i-bagasjerommet, stund inne det åpen-åker og å sikre måler reliability i løpet av tester.
- Plasser et kamera på bakkenivå vendt mot den sirkulære plexiglass åpne felt arenaen for å registrere test økter for offline-analyse (30 − 60 rammer/s minimum).
- Starte video innspillingen og sted rotta inne senteret av arenaen under svak lyset vilkårene å oppmuntre Locomotor aktivitet.
- Fortsett test økten i 4 minutter for å sikre en tilstrekkelig mengde Locomotor anfall for analyse. Plukk opp og erstatte rotter i midten av arenaen når de forblir stasjonære lenger enn 20 s for å fremme bevegelse.
- Resultat Locomotor ytelsen til den innspilte test økten ved å fylle ut vurderingsmatrisen som følger medTabell 1henhold til parametrene i følgende underseksjoner.
Merk: det er nyttig å score hver parameter separat ved gjentatt visning av den innspilte testing sesjon ved hjelp av programvare som gjør det mulig for variabel avspillingshastighet og ramme-for-frame analyse (f. eks VLC Media Player).- For ledd lem bevegelser, score hindlimb bentap felles bevegelser under spontan bevegelse separat for ankelen, kneet og hofte som enten normalt (mer enn halvparten av omfanget av bevegelse, tildelt score = 2), liten (mindre enn halvparten av omfanget av bevegelse, tildelt poengsum = 1), eller fraværende (tildelt poengsum = 0).
- For vekt oppbacking, vurdere evnen av hindlimb bentap extensor muskelen å kontrakt og oppbacking lastet kropp vekt når Lem er på bakken hver for seg for når rotta er desktop likeledes idet i løpet av aktiv bevegelse. Award en poengsum på 1 når vekt støtte er til stede og en poengsum på 0 når vekt støtte er fraværende.
Merk: stasjonær vekt støtte er ansett som en perquisite for aktiv vekt støtte. - For tall posisjon, evaluere plasseringen av hindlimb bentap sifre mens rotte er i ro og under bevegelse. Award en poengsum på 2 når hindlimb bentap sifre er utvidet, linjeavstand fra hverandre, og tonic under bevegelse i mer enn 50% av testperioden (anses normalt). Award en poengsum på 1 når sifrene forblir overveiende flexed og en poengsum på 0 når sifrene forblir overveiende atonic.
- For stepping, fullføre denne parameteren bare hvis rotte kan støtte sin kroppsvekt under stepping. Vurdere stepping ved vurdering orienteringen av hindlimb bentap pote plassering på tidspunktet for første kontakt og ved løft av fra bakken i tillegg til flyt av sving fasen under stepping.
Merk: det er 3 poeng for denne parameteren som er beskrevet i følgende underseksjoner separat evaluere: 1) aksial orientering av labben plassering på lem kontakt (rygg/plantar plassering), 2) den langsgående orientering av labben plassering ved første kontakt og underløft (parallelt med kroppen aksen eller roteres internt/eksternt), og 3) kvaliteten på lem bevegelse under swing (vanlig eller uregelmessig).- For det pote plasseringen for lem berøring, snes det aksial orienteringen av det pote plasseringen for lem berøring idet 0 når rygg plasseringene finnes inne mer enn 50% av skritt.
Merk: plantar plassering er ansett som en perquisite for scoring orienteringen av labben ved kontakt og løft (trinn 2.5.4.2), swing bevegelse (trinn 2.5.4.3) og forlemen-hindlimb bentap koordinering (trinn 2.5.5). - For labben orienteringen på lem kontakt og løft, tildele en poengsum på 2 når den langsgående labb og kropp aksene er parallelle og en poengsum på 1 når lem roteres eksternt eller internt, separat for både lem kontakt og løft.
- For swing bevegelse, tildele en poengsum på 2 når hindlimb bentap leddene beveger seg i en harmonisk og vanlig måte under swing og en poengsum på 1 når jerky eller krampaktig bevegelser av leddene oppstår under swing.
- For det pote plasseringen for lem berøring, snes det aksial orienteringen av det pote plasseringen for lem berøring idet 0 når rygg plasseringene finnes inne mer enn 50% av skritt.
- For forlemen-hindlimb bentap koordinering, Fullfør denne parameteren bare hvis 4 påfølgende trinn oppstår under testing og hvis lemmer kan aktivt støtte kroppsvekt. Tildele en poengsum på 3 når koordinering er konsistent (> 90% av trinnene), 2 når hyppige (50 − 90% av trinnene), 1 når sporadisk (< 50% av trinnene), eller 0 når fraværende (0% av trinnene).
Merk: forlemen-hindlimb bentap koordinering er definert som en vanlig veksling i stepping mellom hindlimb bentap blir scoret og forlemen på samme side av kroppen. - For halen posisjon, evaluere halen posisjon under bevegelse som enten opp (av bakken, tildelt score = 1) eller ned (berøre bakken, tildelt score = 0).
Merk: en forhøyet hale posisjon under bevegelse er en indikator på stammen stabilitet i rotte. Etter hemisection, er halen normalt holdt nær eller berøre bakken som trunk stabilitet er svekket. - Legg til individuelle poengsummer fra hver parameter for å gi en total for hver hindlimb bentap på maksimalt 20 poeng.
Merk: en poengsum på 20 indikerer normal Locomotor ytelse. Resultater < 20 representerer økende mengder Locomotor svekkelse og en poengsum på 0 indikerer lem lammelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å reproduserbar lesjoner med en høy grad av konsistens kan genereres med hemisection teknikk. Å vurdere og sammenligne lesjoner størrelser mellom eksperimentelle grupper, det maksimale arealet av lesjon som en prosentandel av den totale tverrsnitt av ryggmargen kan lett beregnes med histologiske farging av ryggmargen seksjoner. Figur 1 viser en representativ lesjon av venstre hemicord og en overlapping av andelen av maksimal lesjon område som deles mellom rotter med en gjennomsnittlig lesjon størrelse på 47,3% ± 4,0% av den tverr Seksjons ledningen området (n = 6).
Figur 1: representative spinal lesjoner. (A) Microphotograph av en koronale spinal delen på lesjon Epicenter fra en hemisected rotte beiset med cresyl fiolett (celle organer, lilla) og luxol rask blå (myelin, blå) indikerer skade på grå og hvit materie konsentrert i venstre hemicord. D, rygg; V, ventrale; L, venstre; R, høyre. Scale bar: 1 mm. (B) skjematisk overlapping av den delte andelen av maksimal lesjon område i en gruppe av rotter (n = 6). Plasseringen av krysset kiropraktor tarmkanalen i rygg funiculus på høyre side er skyggelagt i svart. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den primære konsekvens av hemisection er en innledende lammelse av hindlimb bentap på siden av lesjon i løpet av de første to til tre postoperative dager. Locomotor gjennomførelse av det flere berørt hindlimb bentap gjøre bedre rask inne rotta etter hemisection over det for det første få ukens etter skaden. Små underskudd i motsatt hindlimb bentap er ofte observert i utgangspunktet etter hemisection som kan reflektere kompensasjon for de mer berørte lem, eller underskudd som følge av mangel på postural stabilitet, vekt støtte, og konsekvent stepping. En stor og vedvarende underskudd i motsatt hindlimb bentap ville indikere en bilateral lesjon som strekker seg inn i motstanderens hemicord.
Et eksempel på en Locomotor for ytelses scoring er gitt i tabell 1.
Tabell 1: eksempel på resultat ark. Eksempel på locomotor for ytelses scoring. For hver parameter vises de mulige resultatene i parentes. Jeg, interne; E, ekstern; P, parallell; FL-HL, forlemen-hindlimb bentap. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Den gang løpet av representative endringer i Locomotor ytelse i intakt tilstand og over de første fem ukene etter en venstre side hemisection i separate grupper av rotter (n = 6 per gruppe) er avbildet i figur 2.
Figur 2: Representative tid løpet av endringer i hindlimb bentap Locomotor ytelse i åpen-feltet i intakt tilstand og i fem uker etter en venstre side bryst hemisection. Ytelsen til venstre hindlimb bentap (A) er signifikant svekket fra intakte verdier i løpet av de første tre ukene etter hemisection, og av de riktige Hindlimb bentap (B) i løpet av den første uken etter hemisection. Data tegnes som gruppe gjennomsnitt ± standardavvik (SD; n = 6 per gruppe). Statistiske analyser ble utført med Kruskal-Wallis ikke-parametriske tester supplert med Dunn flere sammenlignings tester for å vurdere gruppe forskjellene mellom tids punkt. *p < 0,05, * * *p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stor styrke av det hemisection teknikk er det selektivitet og reproduserbarhet av det lesjon hvilke innlede å nedsatte variasjon inne histologiske og opptreden fenotyper imellom dyrene25. For å sikre en ensidig lesjon på riktig spinal nivå, er nøyaktig identifisering av både riktig vertebrale segmentet og ryggmargen midtlinjen kritisk. Som det kan være en tendens til ryggmargen å rotere i retning av kuttet under hemisection prosedyren, kan det være fordelaktig å stabilisere ledningen forsiktig med fine pinsett plassert på hver side under prosedyren. Plassere rotte i en stereotaxic ramme med halen forsiktig tapet under lys spenning kan hjelpe med stabilitet og riktig vertebrale justering under inngrepet. En spinal klemme festet til stereotaxic ramme og en spinous prosess kan også brukes til å forbedre stabiliteten i vertebrale kolonnen, men vi finner at dens tilstedeværelse kan begrense tilgangen til ledningen med kirurgiske verktøy og krever klosset tilnærming vinkler under Kirurgi. Det er også viktig å fjerne eventuelle bein fragmenter igjen i rygg kanalen fra laminectomy som de kan forårsake uønsket komprimering skade på ledningen og fremme sekundær skade.
Rotter bør stadig observert under operasjonen for å overvåke nødvendige vitale tegn som kjernetemperatur og pust, som nedkjøling er en ledende årsak til dødelighet både under anestesi administrasjon og i utgangspunktet etter operasjonen. Regulering av kjernen kroppstemperatur med en rektal sonde og feedback-kontrollerte oppvarming pad kan i stor grad unngå temperatur komplikasjoner. En puls oximeter kan også brukes til å overvåke blod oksygenering og hjertefrekvens for å regulere anestesi dybden. Vi finner at væske etterfylling umiddelbart etter operasjonen med melkes ringer løsning varmet til kroppstemperatur resulterer i en raskere utvinning tid for rotte å våkne etter operasjonen, gjenvinne autonom kontroll av kroppstemperatur, og kunne drikke og spise.
Post-kirurgisk overvåking av rotte er viktig etter hemisection kirurgi, spesielt for tegn på feil vannlating, smerte, infeksjon, vekttap, problemer med såret healing, eller autophagia. Konsultasjon med veterinær ansatte for evaluering og behandling er avgjørende i situasjoner med post-kirurgiske komplikasjoner. Spesielt kan akutt spinal sjokk eller utilsiktede bilaterale lesjoner forstyrre vannlating som kan føre til potensielt fatale infeksjoner. Forsiktig dataskjerm blæren av rotta etter kirurgi og manuelt annullere tre timene per dag hvis i sin helhet av mild trykk fra det ventrale side av blæren synkende caudally. Vi bruker kvinnelige Long-Evans rotter som de har en betydelig kortere og rettere urinrør enn menn som fører til en raskere utbruddet av en automatisk urin blære, enklere vannlating, og lavere forekomst av urinveisinfeksjoner2. Vekt bør også overvåkes og et tap > 20% fra Baseline garanterer etterforskning av mat og vanninntak. Tennene bør sjekkes for malocclusion, magen for ileus og rotter gitt passende supplerende væsker og ernæring som hydrogel eller en flytende diett. En cyste kan sjelden danne under snittet området som kan tømmes trygt med en sprøyte uten komplikasjoner i samråd med veterinær ansatte.
The Martinez åpen felt Locomotor vurdering prosedyre gir en enkel teknikk som ikke krever noe spesialisert utstyr, preoperativ trening, eller mat deprivasjon av dyret til å utføre. Vurderingen kan utføres så tidlig som dyret gjenoppretter fra anestesi og kan brukes til skjermen dyr for passende utvinning indekser (f. eks, gjenvinning av kroppsvekt støtte) når strengere og spesifikke Locomotor testing kan suppleres som automatisert gange vurdering av Overground bevegelse26,27,28, Kinematisk analyser under tredemølle bevegelse29,30,31,32, Grid Walking33, og stigen rung walking9,34. Viktigere, mens BBB skala har vist seg å ikke være lineær med Locomotor utvinning som score tendens til å klynge rundt visse verdier19, den Martinez åpen-feltet Locomotor vurdering gir en lineær scoring profil under gjenopprettingsprosessen 10. for å sikre pålitelige atferdsdata, er det viktig å minimere antall confounders under testing og analyse. For å bidra til å redusere variasjonen under testingen, bør øktene forekomme på samme tidspunkt på dagen, i samme rom og av samme eksperimentator. Den åpnefelt vurderingen kan utføres på en pålitelig måte i løpet av gjentatte økter9,10,11,12,23, men rotter kan bli habituated for miljøet over tid og redusere sin aktivitet under testing resulterer i en utilstrekkelig mengde Locomotor anfall for analyse. Å seire over immobilitet i løpet av tester, rotter det være igjen i ro for lengere enn 20 sekunder er plukket opp og erstattet inne senteret av arenaen å fremme bevegelse. Dessuten, inkluderer en cinerascens inne arenaen i løpet av tester det er Fair for legitimasjonen kanne hjelpe fremme Locomotor aktivitet inne prøven rotten. For å sikre pålitelighet i Locomotor scoring to raters, fortrinnsvis blindet, bør gjennomføre analysene som tidligere beskrevet10.
Som konklusjon, beskriver vi metoder for å gjennomføre en bryst ryggmargen hemisection i rotte og vurdere spontan hindlimb bentap Locomotor ytelse i en åpen-feltet Arena. Selv om en prosedyre for å gjennomføre lateral hemisections ble beskrevet, kan teknikken være lett tilpasses til å utføre enten rygg hemisections35, forskjøvet vekslende hemisections36,37eller full transections 38 avhengig av ønsket lesjon plassering og mengden spart synkende supraspinal innervasjon. Viktigere, kan teknikken også brukes i større dyremodeller, inkludert katter39,40,41 og ikke-menneskelige primater6,42 med sammenlignbare underskudd observert mellom små og store dyr, noe som gjør det nyttig for å undersøke både nevrobiologiske mekanismer for utvinning og for prekliniske terapeutisk testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institutes for Health Research (CIHR; MOP-142288) til m. m. ble støttet av en lønns pris fra fonds de Recherche Québec santé (FRQS), og en ble støttet av et fellesskap fra FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
- Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
- Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
- Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
- Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
- Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
- Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
- Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
- Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
- Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
- Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
- Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
- Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
- Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
- Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
- Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).
