Summary
Råttan bröstkorg spinal hemisektion är en värdefull och reproducerbar modell av ensidig ryggmärgsskada för att undersöka de neurala mekanismerna för motoriska återhämtning och behandlingseffekt. Den här artikeln innehåller en detaljerad steg-för-steg-guide för att utföra hemisektionens procedur och för att bedöma rörelseresultatet i en öppen Arena.
Abstract
Ryggmärgsskada (SCI) orsakar störningar i motorisk, sensorisk och autonom funktion under nivån av lesionen. Experimentella djurmodeller är värdefulla verktyg för att förstå de neurala mekanismer som ingår i motorisk återhämtning efter SCI och för att designa terapier för kliniska populationer. Det finns flera experimentella SCI modeller inklusive kontusion, kompression, och transektion skador som används i en mängd olika arter. En hemisektion involverar den ensidiga transektionen av ryggmärgen och stör alla stigande och fallande spår på ena sidan. Spinal hemisektionen producerar en mycket selektiv och reproducerbar skada i jämförelse med kontusion eller kompressionstekniker som är användbar för att undersöka neurala plasticitet i skonade och skadade vägar i samband med funktionell återhämtning. Vi presenterar ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för att utföra en thorakal hemisektion på den T8 vertebrala nivån hos råtta som resulterar i en initial förlamning av bakbenen på sidan av lesionen med graderad spontan återhämtning av rörelsefunktionen över flera Veckor. Vi erbjuder också ett rörelseresultat protokoll för att bedöma funktionell återhämtning i det öppna fältet. Den motoriska utvärderingen ger en linjär återhämtning profil och kan utföras både tidigt och upprepade gånger efter skada för att korrekt skärm djur för lämpliga tidpunkter där för att genomföra mer specialiserade beteendemässiga tester. Den hemisektion teknik som presenteras kan lätt anpassas till andra transektion modeller och arter, och motoriska bedömningen kan användas i en mängd olika SCI och andra skade modeller att göra mål rörelse funktion.
Introduction
Ryggmärgsskada (SCI) är förknippad med allvarliga störningar i motorisk, sensorisk och autonom funktion. Experimentella djurmodeller av SCI är värdefulla verktyg för att förstå de anatomiska och fysiologiska händelser som är involverade i SCI patologi, för att undersöka de neurala mekanismerna i reparation och återhämtning, och för att screena för effekt och säkerhet av potentiella terapeutiska Insatser. Råttan är den vanligast förekommande arten i SCI Research1. Råtta modellerna är låg kostnad, lätt till reproducera, och en stor ackumulatorn av beteende proverna är tillgänglig till bedöma funktionell resultaten2. Trots vissa skillnader i tarmkanalen platser, råtta ryggmärgen aktier övergripande liknande sensomotoriska funktioner med större däggdjur, inklusive primater3,4. Råttor delar också motsvarande fysiologiska och beteendemässiga konsekvenser för SCI som relaterar till människor5. Icke-mänskliga primater och stora djurmodeller kan ge en närmare tillnärmning av Human SCI6 och är nödvändiga för att bevisa behandling säkerhet och effekt före mänskliga experiment, men är mindre vanligt förekommande på grund av etiska och djurskydd överväganden, utgifter och myndighetskrav7.
Råtta transektion Sci modeller utförs av riktade avbrott i ryggmärgen med en selektiv lesion med hjälp av en dissektion kniv eller iridektomi sax efter en laminektomi. Jämfört med en fullständig transektion, resulterar partiell transektion i råtta i en mindre allvarlig skada, lättare postoperativ Djurvård, spontan motorisk återhämtning, och närmare modeller SCI hos människor som är övervägande ofullständig med partiell sparande av vävnad som förbinder ryggmärgen och plausibel strukturer8. En ensidig hemisektion stör alla stigande och fallande spår på ena sidan, och producerar kvantifierbara och mycket reproducerbara rörelseunderskott, vilket förbättrar utforskandet av de bakomliggande biologiska mekanismerna. Den mest framträdande funktionella konsekvensen av hemisektionen är en initial lem förlamning på samma sida och under nivån på lesionen med graderad spontan återhämtning av rörelsefunktionen under flera veckor9,10, elva , 12. hemisektionens modell är särskilt användbar för att undersöka neurala plasticitet av skadade och kvarvarande skrifter och kretsar förknippade med funktionell återhämtning9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Specifikt, hemisektion utförs på bröstkorg nivå, dvs ovanför spinal kretsar som styr bakbenet förflyttning, är särskilt användbart för att undersöka förändringar i rörelsekontroll. Som en icke-linjär relation finns mellan lesion svårighetsgrad och motoriska återhämtning efter SCI19, lämpliga beteendemässiga tester för att bedöma funktionella resultat är av största vikt i experimentella modeller.
Ett omfattande batteri av beteendemässiga tester finns för att bedöma specifika aspekter av funktionell rörelse återhämtning i råtta2,20. Många motoriska tester ger inte tillförlitliga åtgärder tidigt efter SCI eftersom råttor är för handikappade för att stödja deras kroppsvikt. Ett mått på spontan rörelse prestanda som är känsligt för underskott tidigt efter skada, och inte kräver preoperativ utbildning eller specialiserad utrustning, är fördelaktigt för att övervaka motoriska återhämtning för lämpliga tidspunkter där för att komplettera specialiserade beteendemässiga tester. Den Martinez Open-fält bedömning Poäng10, ursprungligen utvecklades för att utvärdera motoriska prestanda efter CERVIKAL Sci hos råtta, är en 20-punkt ordningstal Poäng bedöma globala rörelseresultat under spontan Overground förflyttning i en öppen-fält. Poängsättningen utförs separat för varje lem med hjälp av kriterier som utvärderar specifika parametrar för en rad rörelse åtgärder inklusive artikulär lem rörelse, vikt stöd, siffra position, steg förmåga, forelimb-bakben samordning och svans Position. Bedömningspoängen härleds från den öppna fält Skattnings skalan Basso, Beattie och Bresnahan (BBB) för att utvärdera rörelseresultatet efter thorakal kontusion21. Den är anpassad för att korrekt och tillförlitligt utvärdera både forelimb och bakbenet rörelse funktion, möjliggör oberoende bedömning av de olika Poäng parametrar som inte är mottagliga med den hierarkiska scoring av BBB, och ger en linjär återhämtning profil10. Dessutom, i jämförelse med BBB, bedömningspoängen är känslig och tillförlitlig i mer allvarliga skade modeller10,11,20,22. Bedömningspoängen har använts för att bedöma nedsatt leverfunktion hos råtta efter cervikal10,12 och bröst9 Sci ensamt och i kombination med traumatisk hjärnskada23.
Vi presenterar här en detaljerad steg-för-steg-protokollet för att utföra en thorakal hemisektionen Sci på T8 vertebrala nivån i den kvinnliga Long-Evans råtta, och för att bedöma bakbenet rörelse återhämtning i det öppna fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som beskrivs i denna artikel utfördes i enlighet med riktlinjerna från det kanadensiska rådet för djuromsorg och godkändes av etikkommittén vid Université de Montréal.
1. Thoracic hemisektionen kirurgi
- Använd lämplig skyddsutrustning (handskar, mask och klänning) för att upprätthålla en aseptisk miljö för kirurgi. Rengör det kirurgiska området med spritservetter och placera sterila kirurgiska draperier över Operations fältet. Sterilisera kirurgiska verktyg och placera på Operations fältet.
- Anesthetize råtta under en blandning av isofluran gas (3% induktion, 0.5 − 3% underhåll) och syre (1 L/min). Bekräfta korrekt kirurgisk anestesidjup genom att kontrollera frånvaron av tå nypa och korneal reflex svar. Kontinuerligt övervaka råtta under hela proceduren, och justera mängden bedövningsmedel leverans som krävs för att bibehålla kirurgisk anestesidjup.
- Raka rygg stammen mellan höft och hals, placera råtta på det kirurgiska området, desinficera snittet platsen med spritkompresser och proviodin lösning, och upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° c med hjälp av en feedback-kontrollerad värme pad övervakas av rektal Termometer.
- Placera oftalmisk salva på ögonen för att hålla dem hydrerade och återapplicera under hela operationen som krävs.
- Gör en 2,5 cm snitt i huden överlägga T6 − T10 Kotor med en skalpell. Dra tillbaka huden och ytligt fett med hjälp av trubbiga dissektion sax.
Obs: den T6 − T10 vertebrala segment kan identifieras antingen rostrally av mild palpation av dorsala spinal segment från basen av skallen från den märkbara förhöjning av den 2nd bröstkotan24, eller caudally av palpation av de mest bakre flytande revbenen som kommer att framkalla rörelse i 13: e bröstkorg Kotor. - Separera paravertebral muskler sätter på rygg aspekten av T7 − T9 Kotor med hjälp av trubbiga dissektion sax och en självhållande upprullningsdon. Debride och rensa kvarvarande vävnad med hjälp av fina pinkoppar och bomull tippade applikatorer att exponera spinösa processer och kotlaminae.
Obs: detta, och följande steg är kraftigt med hjälp av mikroskopisk visualisering (~ 5 − 15x). - Försiktigt skära fasetterna (zygapophysial lederna) bilateralt på T7 och T8 Kotor med känsliga ben trimmers. Skär den dorsala bindväv mellan T8 och T9 kotlaminae ytligt med en skalpell (1 mm djup) är noga med att inte skada den underliggande sladden.
- Ta bort den spinösa processen av T8 kotan med ben trimmers. Med böjda hemostatiska pinpett försiktigt spänns fast på T7 krabbornas mätras processen, rotera caudal slutet av T8 lameller något rostrally (~ 20 °), sätt in ben trimmers under T8 lamina, och göra en mittlinjen skära sträcker sig längs lamina. Fortsätt laminektomi genom att upprepa nedskärningar på vänster och höger sida av vertebrala lamina mediala till tvärgående processer för att exponera ryggmärgen.
Obs: var noga med att ta bort alla benfragment som skapats från laminektomi. - DROPP lidokain (2%, 0,1 ml) i den exponerade ryggmärgskanalen och ta bort Dura överliggande den T8 spinal segmentet med hjälp av fina pinpett och iridektomi sax. Upprepa lidokain administration till den exponerade sladden och identifiera mittlinjen av sladden genom visualisering av en centrumlinje skapas mellan spinösa processer som sträcker sig mellan exponerade T7 − T9-kotan.
Obs: tillsammans med spinliga processer på T7 och T9, de exponerade dorsala root ganglier på T8 kan också användas för att underlätta identifiering av mittlinjen och en 30 G nål kan placeras i mittlinjen av sladden till stöd med den efterföljande hemisektion. - Hemisect ryggmärgen från mittlinjen mot den ena sidan med en dissekera kniv. Var noga med att inte skära igenom den främre spinal artären på den ventrala sidan (inte tillämpa fast tryck på ryggraden kroppen). Använda iridektomi sax, försiktigt skära igenom kvarvarande vävnad på den bort sidan av ryggmärgen för att säkerställa ventrolaterala kvadranten är lämpligt transected.
- Placera steril saltlösning-indränkt hemostatisk svamp (~ 6 x 2 mm) i den exponerade håligheten ovanför ryggmärgen och sutur muskeln lagren (4-0 Polyglactin 910). Nästa, sutur huden runt snittet webbplatsen.
- Ge adekvat analgetikum (buprenorfin 0,05 mg/kg subkutan [s.c.]), antibiotika (enrofloxacin, 10 mg/kg s.c.) och fyll på förlorad vätska med 5 CC laktat Ringers lösning (intraperitoneal [i.p.]) omedelbart efter operationen.
- Ta bort råttan från anestesi. Placera råttan i en varm miljö under en värmedyna eller lampa (~ 33 ° c) tills djuret är helt vaken.
- Ge kompletterande analgesi dagligen under de första 3 post-kirurgiska dagar och kontinuerligt övervaka för tecken på smärta, viktminskning, felaktig micturition, infektion, problem med sårläkning, eller autophagia.
2. öppen fält testförfarande och rörelseresultat scoring
- Hantera råttor dagligen för 1 vecka och vänja dem till arenan för två 5-min sessioner innan du testar att acklimatisera sig att plockas upp, försiktigt från mitten av stammen, medan det öppna fältet och för att säkerställa mätning tillförlitlighet under provningen.
- Placera en kamera på marknivå mot det cirkulära plexiglaset Open-Field Arena för att spela in testsessioner för offlineanalys (30 − 60 bildrutor/s minimum).
- Börja videoinspelning och placera råtta i mitten av arenan under svagt ljusförhållanden för att uppmuntra rörelseaktivitet.
- Fortsätt Testsessionen för 4 min för att säkerställa en tillräcklig mängd rörelse anfall för analys. Plocka upp och ersätta råttor i mitten av arenan när de förblir stillastående längre än 20 s för att främja förflyttning.
- Poäng rörelseresultatet för den inspelade Testsessionen genom att fylla i de kriterier som anges iTabell 1enligt parametrarna i nedanstående underavsnitt.
ANMÄRKNINGAR: det är bra att poäng varje parameter separat genom upprepad visning av den inspelade Testsessionen med hjälp av programvara som möjliggör variabel uppspelningshastighet och bild Rute analys (t. ex., VLC Media Player).- För artikulära extremiteter rörelser, Poäng bakbenen gemensamma rörelser under spontan förflyttning separat för fotleden, knä, och höft som antingen normala (mer än hälften av rörelseomfång, tilldelas poäng = 2), liten (mindre än hälften av rörelseomfång, tilldelas Poäng = 1), eller frånvarande (belönad Poäng = 0).
- För vikt stöd, utvärdera förmågan av bakbenet extensor muskler att kontraktet och stöd laddad kroppsvikt när extremiteten är på marken separat för när råttan är stillastående samt under aktiv förflyttning. Tilldela en poäng av 1 när vikt stöd är närvarande och en poäng på 0 när vikt stöd är frånvarande.
Obs: stationär vikt stöd anses vara en naturaförmån för aktivvikt stöd. - För siffer position, utvärdera positionen för bakextremitets siffror medan råttan är stillastående och under förflyttning. Tilldela en poäng av 2 när bakbenet siffror förlängs, fördelade från varandra, och tonic under förflyttning i mer än 50% av testperioden (anses normalt). Tilldela en poäng på 1 när siffrorna förblir övervägande böjda och en poäng på 0 när siffrorna är huvudsakligen atonic.
- För att kliva, Fyll i denna parameter endast om råttan kan stödja dess kroppsvikt under stegning. Utvärdera Stepping genom att betygsätta orienteringen av bakbenet Paw placering vid tidpunkten för den första kontakten och vid lyft från marken förutom fluiditet av Swing fasen under stegning.
Obs: det finns 3 Poäng för denna parameter som beskrivs i följande underavsnitt separat utvärdera: 1) den axiella orienteringen av Paw placering vid lem kontakt (Dorsal/plantar placering), 2) den longitudinella orienteringen av Paw placering vid första kontakt och under lyft (parallellt med kroppen axeln eller roteras internt/externt), och 3) kvaliteten på lem rörelse under swing (regelbunden eller oregelbunden).- För Paw placering vid lem kontakt, värdering axiella orientering av Paw placeringen vid lem kontakt som 0 när dorsala placeringar förekommer i mer än 50% av stegen.
Obs: plantar placering anses vara en naturaförmån för poängsättningen av tass vid kontakt och lyft (steg 2.5.4.2), Swing rörelse (steg 2.5.4.3) och forelimb-bakben samordning (steg 2.5.5). - För Paw orientering vid lem kontakt och lyft, tilldela en poäng på 2 när den längsgående tass och kropps axlar är parallella och en poäng på 1 när extremiteten roteras externt eller internt, separat för både lem kontakt och lyft.
- För Swing rörelsen, tilldela en poäng på 2 när bakbenet lederna rör sig i en harmonisk och regelbunden sätt under swing och en poäng på 1 när ryckig eller krampig rörelser i lederna inträffar under swing.
- För Paw placering vid lem kontakt, värdering axiella orientering av Paw placeringen vid lem kontakt som 0 när dorsala placeringar förekommer i mer än 50% av stegen.
- För forelimb-bakben samordning, Fyll i denna parameter endast om 4 på varandra följande steg inträffar under provningen och om extremiteterna kan aktivt stödja kroppsvikt. Tilldela en poäng på 3 när samordningen är konsekvent (> 90% av stegen), 2 när det är vanligt (50 − 90% av stegen), 1 när enstaka (< 50% av stegen), eller 0 när frånvarande (0% av steg).
Anmärkning: forelimb-bakben samordning definieras som en regelbunden Alternerings i att kliva mellan bakbenen som görs och forelimb på samma sida av kroppen. - För tail position, utvärdera svansen position under förflyttning som antingen upp (från marken, tilldelas poäng = 1) eller ner (vidrör marken, tilldelas Poäng = 0).
Anmärkning: en upphöjd svans position under förflyttning är en indikator på bål stabiliteten hos råtta. Efter hemisektion, är svansen normalt hålls nära eller vidrör marken som bålen stabilitet försämras. - Lägg till enskilda Poäng från varje parameter för att ge en total för varje bakdel av högst 20 poäng.
Anmärkning: en poäng på 20 indikerar normal rörelse prestanda. Poäng < 20 representerar ökande mängder av motoriska nedsatt leverfunktion och en poäng på 0 indikerar lem förlamning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbara lesioner med hög grad av konsistens kan genereras med hemisektionsteknik. För att bedöma och jämföra lesioner storlekar mellan experimentella grupper, den maximala arean av lesionen som en procentandel av det totala tvärsnittet av ryggmärgen kan lätt beräknas med histologisk färgning av ryggmärgen avsnitt. Figur 1 visar en representativ lesion av vänster hemicord och en överlagring av den andel av maximal lesionsarea som delas mellan råttor med en genomsnittlig lesionsstorlek på 47,3% ± 4,0% av tvärsnitts området (n = 6).
Figur 1: representativa spinal lesioner. (A) mikrofotografi av en Koronal spinal sektion vid lesion epicentrum från en hemisekerad råtta färgas med cresyl violett (cell kroppar, lila) och Luxol fast Blue (myelin, blå) indikerar skador på grå och vit materia koncentrerad till vänster hemicord. D, dorsal; V, ventral; L, vänster; R, höger. Skalbar: 1 mm. (B) Schematisk överlagring av den delade andelen av maximalt lesionsområde i en grupp råttor (n = 6). Placeringen av korsade kortikospinal tarmkanalen i dorsala funiculus på höger sida är skuggad i svart. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den primära konsekvensen av hemisektionen är en initial förlamning av bakbenen på sidan av lesionen under de första två till tre postoperativa dagarna. Motoriska prestanda hos de mer drabbade bakbenen förbättras snabbt hos råtta efter hemisektion under de första veckorna efter skada. Små underskott i motsatt bakben är vanligen observeras initialt efter den hemisektion som kan återspegla ersättning för de mer drabbade extremiteterna, eller underskott till följd av bristande postural stabilitet, vikt stöd, och konsekvent Stepping. En stor och ihållande underskott i motsatt bakben skulle tyda på en bilateral lesion som sträcker sig in i motsatta hemicord.
Ett exempel på en prestanda bedömning för Rörelseresultat anges i tabell 1.
Tabell 1: exempel på poängsättnings blad. Exempel på prestanda bedömningskriterier för rörelseresultat. För varje parameter anges möjliga poäng inom parentes. I, inre; E, extern; P, parallell; FL-HL, forelimb-bakben. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tidsförloppet för representativa förändringar i rörelseresultatet i intakt tillstånd och under de första fem veckorna efter en vänstersida hemisektion i separata grupper av råttor (n = 6 per grupp) avbildas i figur 2.
Figur 2: Representativ tidsförlopp för förändringar i bakbenet rörelse prestanda i det öppna fältet i intakt tillstånd och i fem veckor efter en vänster sida bröstkorg hemisektion. Utförandet av den vänstra bakbenen (a) är signifikant nedsatt från intakt värden under de första tre veckorna efter hemisektion, och av den högra bakbenen (B) under den första veckan efter hemisektion. Data ritas som grupp medelvärde ± standardavvikelse (SD; n = 6 per grupp). Statistiska analyser utfördes med Kruskal-Wallis icke-parametriska tester kompletterade med Dunns multipla jämförelsetester för att bedöma gruppskillnader mellan tidspunkter. *p < 0,05, * * *p < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stor styrka av hemisektion tekniken är selektivitet och reproducerbarhet av lesionen som leder till minskad variation i histologiska och beteendemässiga fenotyper mellan djur25. För att säkerställa en ensidig lesion på lämplig spinal nivå, noggrann identifiering av både rätt vertebrala segmentet och ryggmärgen mittlinjen är kritisk. Eftersom det kan finnas en tendens för ryggmärgen att rotera i riktning mot snittet under hemisektionen förfarandet, kan det vara fördelaktigt att stabilisera sladden försiktigt med fin tång placeras på vardera sidan under förfarandet. Placera råtta i en stereotaxic ram med svansen försiktigt tejpade under ljus spänning kan hjälpa till med stabilitet och ordentlig vertebrala anpassningen under förfarandet. En ryggrads klämma fäst vid stereotaxic-ramen och en spinös process kan också användas för att öka stabiliteten i ryggraden, men vi finner att dess närvaro kan begränsa tillgången till sladden med kirurgiska verktyg och kräver obekväma inflygnings vinklar under Kirurgi. Det är också viktigt att ta bort eventuella benfragment kvar i ryggmärgskanalen från laminektomi eftersom de kan orsaka oönskade komprimering skada på sladden och främja sekundära skador.
Råttor bör ständigt observeras under operationen för att övervaka nödvändiga vitala tecken såsom kärntemperatur och andning, som hypotermi är en ledande orsak till dödlighet både under anestesi administration och initialt efter operationen. Reglering av kroppstemperaturen med en rektal sond och feedback-kontrollerad värme pad kan kraftigt undvika temperatur komplikationer. En pulsoximeter kan också användas för att övervaka blodets syresättning och hjärtfrekvens för att reglera anestesidjupet. Vi finner att vätskepåfyllnad omedelbart efter operationen med laktat Ringers lösning värms till kroppstemperatur resulterar i en snabbare återhämtningstid för råtta att vakna efter operationen, återfå autonom kontroll av kroppstemperatur, och kunna dricka och äta.
Post-kirurgisk övervakning av råtta är viktigt efter hemisektionen kirurgi, särskilt för tecken på felaktig micturition, smärta, infektion, viktminskning, problem med sårläkning, eller autophagia. Samråd med veterinärpersonal för utvärdering och behandling är avgörande i situationer med postoperativa komplikationer. I synnerhet, akut spinal chock eller oavsiktliga bilaterala lesioner kan störa urinering som kan leda till potentiellt dödliga infektioner. Noggrant övervaka urinblåsan av råtta efter operationen och manuellt annullera tre gånger per dag om full av milt tryck från den ventrala sidan av urinblåsan fallande caudally. Vi använder kvinnliga lång Evans råttor eftersom de har en betydligt kortare och rakare urinröret än män som leder till en snabbare debut av en automatisk urinblåsa, lättare micturition, och lägre priser på urinvägsinfektioner2. Vikter bör också övervakas och en förlust > 20% från baslinjen teckningsoptioner undersökning av mat och vattenintag. Tänderna bör kontrolleras för malocklusion, buken för ileus, och råttor ges lämpliga kompletterande vätskor och näring som hydrogel eller en flytande diet. En cysta kan sällan bildas under snittet webbplats som kan tömmas säkert med en spruta utan komplikation i samråd med veterinärpersonal.
Den Martinez Open-Field rörelse bedömningsförfarande ger en enkel teknik som inte kräver någon specialiserad utrustning, preoperativ utbildning, eller mat berövande av djuret att utföra. Bedömningen kan utföras så tidigt som djuret återhämtar sig från anestesi och kan användas för att avskärma djur för lämpliga återvinnings index (t. ex. återhämtning av kropps vikts stöd) när strängare och specifik motorisk testning kan kompletteras såsom automatiserad gång bedömning av Overground förflyttning26,27,28, kinematiska analyser under löpbandet förflyttning29,30,31,32, Grid Walking33, och stege Rung Walking9,34. Viktigare, medan BBB skalan har visat sig inte vara linjär med motoriska återhämtning som Poäng tenderar att klustret runt vissa värden19, Martinez Open-Field Rörelseresultat bedömning ger en linjär scoring profil under återhämtningsprocessen 10. för att säkerställa tillförlitlig beteendemässig data, är det viktigt att minimera antalet störfaktorer under testning och analys. För att minska variationen under testning, sessioner bör ske vid samma tidpunkt på dagen, i samma rum, och av samma försöksledaren. Den öppna fält bedömningen kan utföras på ett tillförlitligt sätt under upprepade sessioner9,10,11,12,23, men råttor kan vänja sig vid miljön under minska sin aktivitet under provningen, vilket resulterar i otillräcklig mängd rörelse anfall för analys. För att övervinna orörlighet under provningen, råttor som förblir stillastående längre än 20 sekunder plockas upp och ersätts i mitten av arenan för att främja förflyttning. Dessutom, inklusive en art i arenan under testning som är märkt för identifiering kan bidra till att främja rörelseaktivitet i test råtta. För att säkerställa tillförlitligheten i rörelseresultatet två bedömare, helst förblindade, bör genomföra analyserna som tidigare beskrivits10.
Sammanfattningsvis beskriver vi metoder för att genomföra en bröstkorg ryggmärgen hemisektion i råtta och bedömning av spontan bakbenet Rörelseresultat i en öppen Arena. Även om ett förfarande för att utföra laterala hemisektioner beskrevs, kan tekniken lätt anpassas för att utföra antingen dorsala hemisections35, vacklade alternerande hemisections36,37, eller full transections 38 beroende på önskad lesion plats och mängden skonade fallande plausibel innervation. Viktigt, tekniken kan också användas i större djurmodeller, inklusive katter39,40,41 och icke-mänskliga primater6,42 med jämförbara underskott observerats mellan små och stora djur, vilket gör det användbart för att undersöka både de neurobiologiska mekanismerna för återhämtning och för prekliniska terapeutiska tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av de kanadensiska instituten för hälsoforskning (CIHR; MOP-142288) till M.M. M.M. stöddes av en löne utmärkelse från fonds de Recherche Québec santé (FRQS), och A. R. B stöddes av ett stipendium från FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
- Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
- Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
- Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
- Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
- Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
- Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
- Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
- Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
- Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
- Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
- Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
- Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
- Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
- Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
- Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).
