Summary
Rotte thorax spinal hemisektion er en værdifuld og reproducerbar model af ensidig rygmarvsskade til at undersøge neurale mekanismer af bevægeapparatet opsving og behandling effektivitet. Denne artikel indeholder en detaljeret trin-for-trin guide til at udføre hemisektion procedure og til at vurdere bevægeapparatet ydeevne i en Open-felt Arena.
Abstract
Rygmarvsskade (SCI) forårsager forstyrrelser i motoriske, sensoriske og autonome funktion under læsions niveau. Eksperimentelle dyremodeller er værdifulde værktøjer til at forstå de neurale mekanismer, der er involveret i bevægeapparatet opsving efter SCI og at designe terapier for kliniske populationer. Der er flere eksperimentelle SCI modeller herunder kontusion, kompression, og transection skader, der anvendes i en bred vifte af arter. En hemisektion involverer den ensidige transektion af rygmarven og forstyrrer alle stigende og faldende skrifter på den ene side kun. Spinal hemisektion producerer en meget selektiv og reproducerbar skade i forhold til kontusion eller kompressions teknikker, der er nyttige til at undersøge neurale plasticitet i skårede og beskadigede veje forbundet med funktionel genopretning. Vi præsenterer en detaljeret trin-for-trin protokol for at udføre en thorax hemisektion på T8 vertebrale niveau i rotter, der resulterer i en indledende lammelse af bagdel på siden af læsionen med gradueret spontan helbredelse af bevægeapparatet funktion over flere Uger. Vi tilbyder også en bevægeapparatet scoring protokol til at vurdere funktionelle opsving i det åbne felt. Den bevægeapparatet vurdering giver en lineær opsving profil og kan udføres både tidligt og gentagne gange efter skade for præcist at screene dyr for passende tidspunkter til at foretage mere specialiseret adfærdsmæssige test. Den hemisektion teknik præsenteret kan let tilpasses andre transektions modeller og arter, og bevægeapparatet vurdering kan anvendes i en række sci og andre skade modeller til at score bevægeapparatet funktion.
Introduction
Rygmarvsskade (SCI) er forbundet med alvorlige forstyrrelser i motoriske, sensoriske og autonome funktion. Eksperimentelle animalske modeller af SCI er værdifulde værktøjer til at forstå de anatomiske og fysiologiske begivenheder involveret i SCI patologi, at undersøge neurale mekanismer i reparation og nyttiggørelse, og at screene for virkning og sikkerhed af potentielle terapeutiske Interventioner. Rotten er de hyppigst anvendte arter i SCI Research1. Rotte modeller er lave omkostninger, let at reproducere, og et stort batteri af adfærdsmæssige tests er tilgængelige til at vurdere funktionelle resultater2. På trods af visse forskelle i tarmkanalen, deler rotte rygmarven samlet set lignende sensorimotoriske funktioner med større pattedyr, herunder primater3,4. Rotter også dele analoge fysiologiske og adfærdsmæssige konsekvenser til SCI, der relaterer til mennesker5. Ikke-menneskelige primat og store dyremodeller kan give en tættere tilnærmelse af human SCI6 og er afgørende for at bevise behandlingens sikkerhed og effektivitet forud for humane eksperimenter, men er mindre almindeligt anvendt på grund af etiske og dyrevelfærd overvejelser, udgifter og lovmæssige krav7.
Rotte transektion sci modeller udføres ved den målrettede afbrydelse af rygmarven med en selektiv læsion ved hjælp af en dissektion kniv eller af saks efter en laminektomi. Sammenlignet med en komplet transekel, delvis transektion i rotter resulterer i en mindre alvorlig skade, lettere postoperative dyrs pleje, spontan bevægeapparatet opsving, og mere tæt modeller sci hos mennesker, som er overvejende ufuldstændig med delvis besparende af væv, som forbinder rygmarven og liga konstruktioner8. En ensidig hemisektion forstyrrer alle stigende og faldende skrifter på den ene side og producerer kvantificerbare og meget reproducerbare underskud, hvilket forbedrer udforskning af de underliggende biologiske mekanismer. Den mest fremtrædende funktionelle konsekvens af hemisektion er en indledende lemmer lammelse på samme side og under niveauet af læsion med gradueret spontan helbredelse af bevægeapparatet funktion over flere uger9,10, 11 , 12. hemisektion modellen er især nyttig til at undersøge neurale plasticitet af beskadigede og resterende skrifter og kredsløb forbundet med funktionel nyttiggørelse9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Specifikt, hemisektion udføres på thorax niveau, dvs over rygmarvs kredsløb, der styrer baglemmer bevægelse, er især nyttig til at undersøge ændringer i bevægeapparatet kontrol. Som en ikke-lineær forhold eksisterer mellem læsion sværhedsgrad og bevægeapparatet opsving efter sci19, passende adfærdsmæssige test til at vurdere funktionelle resultater er altafgørende i eksperimentelle modeller.
En omfattende batteri af adfærdsmæssige tests er tilgængelige til at vurdere specifikke aspekter af funktionelle bevægeapparatet opsving i rotte2,20. Mange bevægeapparatet tests giver ikke pålidelige foranstaltninger tidligt efter sci som rotter er for handicappede til at støtte deres kropsvægt. Et mål for spontan bevægelsesevne, der er følsom over for underskud tidligt efter skaden, og ikke kræver præoperativ uddannelse eller specialiseret udstyr, er gavnlig for at overvåge bevægeapparatet opsving for passende tidspunkter, hvor at supplere specialiserede adfærdsmæssige test. Martinez Open-felt Assessment score10, oprindeligt udviklet til at evaluere bevægeapparatet præstation efter cervikal sci i rotten, er en 20-punkts ordenstal vurdering af global bevægeapparatet præstation under spontan Overground bevægelse i en åbent felt. Scoring udføres separat for hver lemmer ved hjælp af en rubrik, der evaluerer specifikke parametre for en række bevægeapparatet foranstaltninger, herunder artikulær lemmer bevægelse, vægt støtte, ciffer position, stepping evner, forbimb-hindlemmer koordination, og hale Position. Assessment score er afledt af Basso, Beattie og bres, (BBB) Open-felt rating Scale designet til at evaluere bevægeapparatet ydeevne efter thorax kontusion21. Det er tilpasset til nøjagtigt og pålideligt evaluere både forbimb og baglemmer bevægeapparatet funktion, giver mulighed for uafhængig vurdering af de forskellige scoring parametre, der ikke er modtagelig med den hierarkiske scoring af BBB, og giver en lineær genopretning profil10. Desuden, i forhold til BBB, vurderingen score er følsom og pålidelig i mere alvorlige skade modeller10,11,20,22. Vurderings scoren er blevet anvendt til at vurdere bevægelseshæmning hos rotter efter cervikal10,12 og thorax9 sci alene og i kombination med traumatisk hjerneskade23.
Vi præsenterer her en detaljeret trin-for-trin protokol for at udføre en thorax hemisektion sci på T8 vertebrale niveau i den kvindelige lang-Evans rotte, og for at vurdere baglemmer bevægeapparatet opsving i det åbne felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimenter, der er beskrevet i denne artikel, blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske råd om dyrepleje og blev godkendt af den etiske komité på Université de Montréal.
1. Thoracic hemisektion kirurgi
- Bær passende beskyttelsesudstyr (handsker, maske og kjole) for at opretholde et aseptisk miljø for kirurgi. Rengør operationsområdet med spritservietter, og Placer sterile kirurgiske gardiner over operationsområdet. Steriliser kirurgiske værktøjer og Placer på operationsområdet.
- Anæstetize rotten under en blanding af isoflurangas (3% induktion, 0,5 − 3% vedligeholdelse) og ilt (1 L/min). Bekræft korrekt kirurgisk anæstesidybde ved at kontrollere fraværet af tå knivspids og hornhinde refleks svar. Løbende overvåge rotten under hele proceduren, og justere mængden af bedøvelse levering som krævet for at opretholde kirurgisk anæstesidybde.
- Barberer rygstammen mellem hofte og hals, Placer rotten på operationsområdet, Desinficer incisions stedet med spritservietter og proviodine opløsning, og vedligehold kernetemperaturen ved 37 °C ved hjælp af en feedback-kontrolleret varmepude, der overvåges af rektal Termometer.
- Placer oftalmisk salve på øjnene for at holde dem hydreret og genanvende hele operationen efter behov.
- Lav en 2,5 cm indsnit i huden overliggende T6 − t10 ryghvirvler med en skalpel. Træk huden tilbage og overfladisk fedt ved hjælp af stump dissektion saks.
Bemærk: T6 − t10 vertebrale segmenter kan identificeres enten rostrally ved blid palpering af rygmarvs segmenter fra bunden af kraniet begyndende fra den mærkbare fremføring af 2nd thorax hvirvel24, eller hale palpering af de mest posterior flydende ribben, som vil fremkalde bevægelse i 13th thorax hvirvler. - Adskil de paravertebrale muskler, der indsætter på rygdelen af T7 − T9 hvirvlerne ved hjælp af stump dissektion saks og en selv opgående retractor. Debride og rydde eventuelle resterende væv ved hjælp af fine tang og bomuld tippet applikatorer at udsætte de spinale processer og vertebrale laminae.
Bemærk: dette, og følgende trin er i høj grad hjulpet af mikroskopisk visualisering (~ 5 − 15x). - Skær forsigtigt facetter (zygapophysiale samlinger) bilateralt på T7 og T8 ryghvirvler med sarte knogle klippere. Skær rygbindevæv mellem T8 og T9 vertebrale tynde overfladisk med en skalpel (1 mm dybde) og pas på ikke at beskadige underlægnings snoren.
- Fjern den spinale proces af T8 hvirvel med bentrimmere. Med buede hæostatiske pincet omhyggeligt fastspændt på T7 spinøs proces, drej den hale ende af T8 tynde lidt rostrally (~ 20 °), Indsæt knogle trimmerne under T8 lamina, og lav en midterlinje, der strækker sig langs lamina. Fortsæt laminektomi ved at gentage udskæringerne på venstre og højre side af vertebrale lamina mediale til tværgående processer for at udsætte rygmarven.
Bemærk: Vær omhyggelig med at fjerne alle knoglefragmenter skabt fra laminektomi. - Dryp lidocain (2%, 0,1 ml) i den eksponerede spinal kanal og fjern Dura overliggende T8 spinal segmentet ved hjælp af fine tang og af saks. Gentagen administration af lidocain til den udsatte ledning og identifikation af ledningens midterlinje ved visualisering af en midterlinje, der er skabt mellem de spinale processer, som strækker sig mellem eksponerede T7-T9-hvirvlen.
Bemærk: sammen med de spinale processer på T7 og T9 kan de udsatte dorsalrodsganglier på T8 også bruges til at støtte identifikation af midterlinjen, og en 30 G nål kan placeres i midterlinjen af ledningen for at hjælpe med den efterfølgende hemisection. - Hemisect rygmarven fra midterlinjen mod den ene side med en dissekere kniv. Vær omhyggelig med ikke at skære gennem den forreste rygmarvs arterie på den ventrale side (ikke anvende fast pres til rygsøjlen). Ved hjælp af af saks skæres forsigtigt gennem eventuelt resterende væv på den læsionerede side af rygmarven for at sikre, at den ventrolaterale kvadrant er korrekt transected.
- Placer steril saltvand-gennemblødt hæmostatisk svamp (~ 6 x 2 mm) i den udsatte hulrum over rygmarven og sutur muskel lagene (4-0 afpolyglactin 910). Næste, sutur huden omkring incisionstedet.
- Give tilstrækkelig analgetisk (buprenorphin 0,05 mg/kg subkutant [s.c.]), antibiotikum (enrofloxacin, 10 mg/kg s.c.) og genopfylde tabte væsker med 5 cc lactat ringer's Solution (intraperitoneal [IP]) umiddelbart efter operationen.
- Tag rotten ud af anæstesi. Rotten placeres i et varmt miljø under en varmepude eller lampe (~ 33 °C), indtil dyret er helt vågen.
- Give supplerende analgesi dagligt over de første 3 post-kirurgiske dage og løbende overvåge for tegn på smerte, vægttab, forkert vandladning, infektion, problemer med sårheling, eller autophagia.
2. test af åbne felter og præstations scoring for bevægelsesforløb
- Håndtere rotter dagligt i 1 uge og habituerer dem til arenaen for to 5-min sessioner forud for testning at akklimatisere til at blive afhentet, forsigtigt fra midten af stammen, mens i det åbne felt og for at sikre måling pålidelighed under testen.
- Placer et kamera i stueetagen, der vender mod den cirkulære plexiglas åben felt Arena, for at registrere test sessioner til offline analyse (30 − 60 frames/s minimum).
- Begynd videooptagelse og Placer rotten i midten af arenaen under svage lysforhold for at opmuntre bevægelsesaktivitet.
- Fortsæt test sessionen i 4 min for at sikre en tilstrækkelig mængde af bevægelses anfald til analyse. Afhente og erstatte rotter i midten af arenaen, når de forbliver stationær i længere end 20 s at fremme bevægelse.
- Resultat af den indspillede test session ved at udfylde rubrikTabel 1i henhold til parametrene i de følgende undersektioner.
Bemærk: det er nyttigt at score hver parameter separat ved gentagen visning af den indspillede test session ved hjælp af software, der giver mulighed for variabel afspilningshastighed og frame-by-frame analyse (f. eks VLC Media Player).- For artikulære lemmer bevægelser, score baglemmer fælles bevægelser under spontan bevægelse separat for ankel, knæ, og hofte som enten normal (mere end halvdelen af bevægelsesområdet, tildelt score = 2), lille (mindre end halvdelen af bevægelsesområdet, tildelt score = 1) eller fraværende (tildelt score = 0).
- For vægt støtte, evaluere muligheden for baglemmer extensor muskler til kontrakt og støtte belastet kropsvægt, når lemmer er på jorden separat for når rotten er stationær såvel som under aktiv bevægelse. Tildele en score på 1, når vægten støtte er til stede, og en score på 0, når vægten støtte er fraværende.
Bemærk: stationær vægt støtte anses for at være en perquisite for aktiv vægt støtte. - For ciffer position, evaluere placeringen af baglemmer cifre, mens rotten er stationær og under bevægelse. Tildele en score på 2, når bagdelen cifre forlænges, fordelt adskilt fra hinanden, og tonic under bevægelse i mere end 50% af testperioden (betragtes som normal). Tildele en score på 1, når cifre forbliver overvejende bøjet og en score på 0, når cifre stadig overvejende atonisk.
- For stepping, fuldføre denne parameter, hvis rotten kan understøtte sin kropsvægt under stepping. Vurder stepping ved at bedømme retningen af baglemmer Paw placering på tidspunktet for første kontakt og ved løft fra jorden ud over fluiditet af swing fase under stepping.
Bemærk: der er 3 point for denne parameter beskrevet i de følgende undersektioner, som evalueres separat: 1) den aksiale retning af pote placering ved lemmer kontakt (dorsal/plantar placering), 2) den langsgående orientering af Paw placering ved første kontakt og under løft (parallelt med karrosseri aksen eller roteret internt/eksternt) og 3) kvaliteten af ekstremitets bevægelse under sving (regelmæssig eller uregelmæssig).- For pote placering ved lemmer kontakt, score den aksiale retning af pote placering i lemmer kontakt som 0 når dorsale placeringer forekommer i mere end 50% af trin.
Bemærk: plantar placering anses for en perquisite for at score retningen af pote ved kontakt og løft (trin 2.5.4.2), Swing bevægelse (trin 2.5.4.3) og forbimb-hindlem koordination (trin 2.5.5). - For Paw orientering ved lemmer kontakt og løft, tildele en score på 2, når den langsgående pote og krop akser er parallelle og en score på 1, når ekstremiteten er roteret eksternt eller internt, separat for både lemmer kontakt og løft.
- For swing bevægelsen, tildele en score på 2, når hindlemmer leddene bevæge sig i en harmonisk og regelmæssig måde under Swing og en score på 1, når rykvise eller krampagtige bevægelser af leddene opstår under swing.
- For pote placering ved lemmer kontakt, score den aksiale retning af pote placering i lemmer kontakt som 0 når dorsale placeringer forekommer i mere end 50% af trin.
- Udfør kun denne parameter, hvis der er 4 på hinanden følgende trin under afprøvningen, og hvis lemmerne aktivt kan understøtte kropsvægten. Tildele en score på 3 når koordineringen er konsistent (> 90% af trin), 2 når hyppig (50 − 90% af trin), 1 når lejlighedsvis (< 50% af trin), eller 0 når fraværende (0% af trin).
BEMÆRKNING: Forbimb-hindlemmer koordination er defineret som en regelmæssig vekslen mellem den bagdel, der er scoret og forbimb på samme side af kroppen. - For hale position, evaluere hale position under bevægelse som enten op (fra jorden, tildelt score = 1) eller ned (rører jorden, tildelt score = 0).
Bemærk: en forhøjet hale position under bevægelse er en indikator for kroppens stabilitet i rotter. Efter hemisection er halen normalt holdes tæt på eller rører jorden som trunk stabilitet er forringet. - Tilføj de enkelte scorer fra hver parameter for at give en total for hver bagende på højst 20 point.
Bemærk: en score på 20 indikerer normal bevægelsesevne. Scores < 20 repræsenterer stigende mængder af bevægelseshæmning og en score på 0 indikerer lemmer lammelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbare læsioner med en høj grad af konsistens kan genereres med hemisektion teknik. For at vurdere og sammenligne læsioner størrelser mellem eksperimentelle grupper, det maksimale område af læsion som en procentdel af den samlede tværsnit af rygmarven kan let beregnes med histologisk farvning af rygmarvs sektioner. Figur 1 viser en repræsentativ læsion af den venstre hemicord og en overlejring af den andel af det maksimale læsionsområde, der deles mellem rotter med en gennemsnitlig læsions tørrelse på 47,3% ± 4,0% af tværsnits lednings arealet (n = 6).
Figur 1: repræsentative rygmarvs læsioner. (A) mikrofotografi af en koronal spinal sektion ved læsions epicentret fra en hemisected rotte farvet med cresylacetat violet (celle legemer, lilla) og Luxol hurtig blå (myelin, blå), der indikerer beskadigelse af den grå og hvide substans koncentreret i venstre hemicord. D, dorsal; V, ventral; L, venstre; R, højre. Skala bjælke: 1 mm.B) skematisk overlejring af den fælles andel af det maksimale læsionsområde i en gruppe af rotter (n = 6). Placeringen af den krydsede kortikospinal-tarmkanalen i dorsale funiculus på højre side er skygget i sort. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den primære konsekvens af hemisektion er en indledende lammelse af bagben på siden af læsionen i de første to til tre postoperative dage. Bevægelsesevne af de mere påvirkede baglemmer forbedrer hurtigt i rotter efter hemisektion i løbet af de første par uger efter skaden. Små underskud i det modsatte bagled er almindeligt observeret i første omgang efter hemisektion, der kan afspejle kompensation for de mere berørte lemmer, eller underskud som følge af manglende postural stabilitet, vægt støtte, og konsekvent stepping. Et stort og vedvarende underskud i den modsatte bagrand ville indikere en bilateral læsion, der strækker sig ind i den modstridende hemicord.
I tabel 1 findes et eksempel på en præstation, der scorer i bevægeapparatet.
Tabel 1: prøve scorings blad. Prøve bevægeapparatet ydeevne scoring rubrik. For hver parameter er de mulige scorer angivet i parentes. I, intern; E, ekstern; P, parallel; FL-HL, forbimb-bagben. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tidsforløbet for repræsentative ændringer i bevægelses ydeevnen i intakt tilstand og i de første fem uger efter en venstre side hemisektion i separate grupper af rotter (n = 6 pr. gruppe) er afbildet i figur 2.
Figur 2: Repræsentativ tidsforløb af ændringer i baglemmer bevægelsesevne i det åbne felt i intakt tilstand og i fem uger efter en venstre side thorax hemisection. Ydeevnen af venstre bagled (A) er signifikant forringet fra intakte værdier i de første tre uger efter hemisection, og af den rette Bagled (B) i den første uge efter hemisection. Data afbildes som gruppe middelværdien ± standardafvigelse (SD; n = 6 pr. gruppe). Der blev udført statistiske analyser med Kruskal-Wallis ikke-parametriske tests suppleret med Dunns multiple sammenligningstests for at vurdere gruppe forskelle mellem tidspunkter. *p < 0,05, * * *p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stor styrke af hemisektion teknik er selektivitet og reproducerbarhed af læsion, som fører til reduceret variabilitet i histologiske og adfærdsmæssige fænotyper mellem dyr25. For at sikre en ensidig læsion på et passende spinal niveau er nøjagtig identifikation af både det korrekte vertebrale segment og rygmarvs midterlinjen kritisk. Da der kan være en tendens til rygmarven til at rotere i retning af snittet under hemisektion procedure, det kan være gavnligt at stabilisere ledningen delikat med fine pincet placeret på begge sider under proceduren. Anbringelse af rotten i en stereotaxisk ramme med halen forsigtigt tapede under lys spænding kan hjælpe med stabilitet og korrekt vertebrale justering under proceduren. En rygmarvs klemme fastgjort til stereotaxisk ramme og en spinøs proces kan også bruges til at øge stabiliteten af rygsøjlen, men vi finder, at dens tilstedeværelse kan begrænse adgangen til ledningen med kirurgiske værktøjer og kræver akavede indflyvnings vinkler under Kirurgi. Det er også vigtigt at fjerne eventuelle knoglefragmenter tilbage i rygmarvskanalen fra laminektomi, da de kan forårsage uønsket komprimering skade på ledningen og fremme sekundære skader.
Rotter bør konstant observeres under operationen for at overvåge nødvendige vitale tegn såsom kernetemperatur og vejrtrækning, som hypotermi er en førende årsag til dødelighed både under anæstesi administration og i første omgang efter operationen. Regulering af kroppens kernetemperatur med en rektal sonde og feedback-kontrolleret varme pad kan i høj grad undgå temperatur komplikationer. En puls-pulsoximeter kan også bruges til at overvåge blodets iltning og puls for at regulere bedøvelses dybden. Vi finder, at væske genopfyldning umiddelbart efter operationen med lactat ringer's løsning opvarmes til kropstemperatur resulterer i en hurtigere restitutionstid for rotten at vække efter operationen, genvinde autonom kontrol af kropstemperatur, og være i stand til at drikke og spise.
Post-kirurgisk overvågning af rotter er afgørende efter hemisektion kirurgi, især for tegn på forkert vandladning, smerte, infektion, vægttab, problemer med sårheling, eller autophagia. Konsultation med veterinærpersonale til evaluering og behandling er afgørende i situationer med post-kirurgiske komplikationer. Især kan akut rygmarvs chok eller utilsigtede bilaterale læsioner interferere med vandladning, der kan føre til potentielt dødelige infektioner. Nøje overvåge blæren af rotter efter operationen og manuelt void tre gange om dagen, hvis fuld ved forsigtigt tryk fra den ventrale side af blæren faldende hale. Vi bruger kvindelige lang-Evans rotter, da de har en betydeligt kortere og mere lige urinrøret end mænd, der fører til en hurtigere indtræden af en automatisk urinblære, lettere vandladning, og lavere satser for urinvejsinfektioner2. Vægte bør også overvåges, og et tab > 20% fra baseline berettiger undersøgelse af fødevarer og vandindtag. Tænderne skal kontrolleres for malokklusion, maven for ileus, og rotter givet passende supplerende væsker og ernæring såsom hydrogel eller en flydende kost. En cyste kan sjældent dannes under incisionstedet, der kan drænes sikkert med en sprøjte uden komplikation i samråd med veterinærpersonale.
Martinez Open-Field bevægeapparatet-vurderingsproceduren giver en enkel teknik, der ikke kræver specialiseret udstyr, præoperativ træning eller fødevare berøvelse af dyret til at udføre. Vurderingen kan udføres så tidligt som dyret genindvinder fra anæstesi og kan bruges til at screene dyr for passende opsving indekser (f. eks, inddrivelse af kropsvægt støtte), når mere stringent og specifikke bevægeapparatet testning kan suppleres, såsom automatiseret gangart-vurdering af Overground Locomotion26,27,28, kinematiske analyser underløbe bånd bevægelse29,30,31,32, Grid Walking33, og stigen Rung Walking9,34. Vigtigere, mens BBB skalaen har vist sig ikke at være lineær med bevægeapparatet opsving som scorer tendens til at klynge omkring visse værdier19, den Martinez Open-Field bevægeapparatet vurdering giver en lineær scoring profil under inddrivelse proces 10. for at sikre pålidelige adfærdsmæssige data er det vigtigt at minimere antallet af konfoundere under testning og analyse. For at reducere variabiliteten under testen, bør sessioner ske på samme tidspunkt af dagen, i samme rum, og ved samme eksperimententer. Den åbne felt vurdering kan udføres pålideligt over gentagne sessioner9,10,11,12,23, men rotter kan blive vænnet til miljøet over tid og reducere deres aktivitet under testning, hvilket resulterer i en utilstrækkelig mængde af bevægelses anfald til analyse. For at overvinde immobilitet under testning, er rotter, der forbliver stationære i længere tid end 20 sekunder, afhentet og erstattet i midten af arenaen for at fremme bevægelse. Derudover, herunder en conspecific i arenaen under test, der er markeret til identifikation kan bidrage til at fremme bevægelsesaktivitet i testen rotte. For at sikre pålidelighed i bevægeapparatet skal to ratere, fortrinsvis blændet, foretage analyserne som tidligere beskrevet10.
Afslutningsvis beskriver vi metoder til at gennemføre en thorax rygmarv hemisektion i rotter og vurdere spontan baglemmer bevægelsesevne i en åben felt Arena. Selv om en procedure for udførelse af laterale hemisections blev beskrevet, teknikken kan let tilpasses til at udføre enten dorsale hemisections35, forskudt vekslende hemisections36,37, eller fuld transektioner 38 afhængigt af den ønskede læsion placering og mængden af sparet faldende liga innervation. Det er vigtigt, at teknikken også kan anvendes i større dyremodeller, herunder katte39,40,41 og ikke-menneskelige primater6,42 med sammenlignelige underskud observeret mellem små og store dyr, hvilket gør det nyttigt for at undersøge både de neurobiologiske mekanismer for nyttiggørelse og for præklinisk terapeutisk testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR; MOP-142288) til M.M. M.M. blev støttet af en lønpris fra fonds de Recherche Québec Santé (FRQS), og A. R. B blev støttet af et stipendium fra FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
- Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
- Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
- Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
- Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
- Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
- Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
- Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
- Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
- Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
- Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
- Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
- Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
- Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
- Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
- Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).
