I denne artikkelen har vi presentert et sett av praktiske og gjennomførbare metoder for karakteriserer sykdom-relaterte mutanter av RAF familien kinaser, som inkluderer in vitro kinase analysen, RAF co-aktivering analysen, og komplementære Split luciferase analysen.
Den raskt akselererte fibrosarcoma (RAF)-familien kinaser spille en sentral rolle i cellebiologi og deres dysfunksjon fører til kreft og utviklingsforstyrrelser. En karakterisering av sykdom-relaterte RAF mutanter vil hjelpe oss å velge passende terapeutiske strategier for behandling av disse sykdommene. Nyere studier har vist at RAF-familien kinaser har både katalysator og nukleosid aktiviteter, som er strengt regulert av dimerization. Her konstruerte vi et sett med praktiske og gjennomførbare metoder for å fastslå katalysatoren og nukleosid aktiviteter og den relative dimer affinitet/stabiliteten til RAF-familiens kinaser og mutanter. For det første har vi endret den klassiske in vitro kinase analysen ved å redusere vaskemiddel konsentrasjonen i buffere, utnytte en mild rask vask prosedyre, og ansette en glutation S-glutamyltransferase (GST) fusjon for å hindre RAF dimers fra dissociating under Rensing. Dette gjør det mulig for oss å måle katalysator for constitutively aktive RAF mutanter hensiktsmessig. Dernest har vi utviklet en roman RAF co-aktivering analysen for å evaluere nukleosid aktivitet av kinase RAF mutanter ved hjelp av N-Terminal avkortet RAF proteiner, eliminerer kravet om aktiv RAS i gjeldende protokoller og dermed oppnå en høyere Følsomhet. Til slutt genererte vi en unik komplementær splitt luciferase analysen til kvantitativt måle den relative dimer affinitet/stabilitet av ulike RAF mutanter, som er mer pålitelig og følsom i forhold til den tradisjonelle co-immunutfelling analysen. Oppsummert har disse metodene følgende fordeler: (1) bruker-vennlig; (2) i stand til å utføre effektivt uten avansert utstyr; (3) kostnadseffektiv; (4) svært følsom og reproduserbar.
RAF-familien kinaser er en nøkkelkomponent i RAS/RAF/MEK/erk signalering Cascade, som sender et signal fra RAS for å aktivere mitogen-aktivert protein kinase (MEK)1,2,3,4. Denne familien av kinaser spiller en avgjørende rolle i cellevekst, overlevelse og differensiering, og deres forandringer induserer mange sykdommer, spesielt kreft5,6,7,8. Nylig har genomisk sequencings identifisert mange sykdom-relaterte RAF mutanter som viser ulike egenskaper i signaloverføring av RAS/RAF/MEK/erk Cascade9,10,11. En forsiktig karakterisering av RAF mutanter vil hjelpe oss å forstå den molekylære mekanismer for hvordan RAF mutanter endre signalet utgang av RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, til slutt velge hensiktsmessige tilnærminger for behandling av ulike RAF mutant-drevne sykdommer.
RAF-familien kinaser inkluderer tre medlemmer, håndve, BRAF, og ARAF, som har lignende molekylære strukturer, men ulike evner til å aktivere nedstrøms signalering1,2,3,4. Blant disse paralogs har BRAF den høyeste aktiviteten i kraft av sin constitutively fosforylert NtA (N–terminalnummer acidic) motiv12,13,14, mens ARAF har lavest aktivitet som følge av sin ikke-kanoniske APE motiv15. Dette kan forklare de ulike mutasjon frekvensene av RAF paralogs i sykdommer: BRAF > HÅNDVE > ARAF. Videre, innenfor samme RAF paralog, mutasjoner i ulike områder kan utløse nedstrøms signalering i distinkte manerer, som legger et lag av kompleksitet til regulering av RAF familie kinaser. Nyere studier har vist at alle RAF kinaser har både katalysator og nukleosid aktiviteter13, 14,16,17,18. Constitutively aktive RAF mutanter slå på nedstrøms signalering direkte av phosphorylating MEK, mens kinase-Dead RAF mutanter kan transactivate sine ville-type kolleger gjennom side-til-side dimerization og aktivere MEK-ERK signalering16 ,19,20. Dimer affinitet/stabilitet er en nøkkel parameter som ikke bare fastsetter den nukleosid aktiviteten til kinase-Dead RAF mutanter, men også påvirker katalysatoren for constitutively Active RAF mutanter15,21, 22. The kinase-Dead RAF mutanter med høy dimer affinitet/stabilitet kan transactivate den endogene vill-type RAFs direkte15, mens de med mellomliggende dimer affinitet/stabilitet krever en koordinering av aktiv RAS eller en forhøyet nivå av vill-type RAF molekyler til å fungere13,15,20,21,23. Tilsvarende constitutively aktive RAF mutanter phosphorylate MEK på en dimer-avhengig måte, og de med lav dimer affinitet/stabilitet mister sin katalysatorer aktivitet in vitro på immunutfelling som bryter den svake RAF dimers15, 21,22. Dimer affinitet/stabilitet bestemmer også følsomheten til RAF mutanter til sine hemmere, og positivt relaterer til motstanden av RAF hemmere24. Derfor, for å karakterisere sykdoms relaterte RAF mutanter, er det nødvendig å måle sine katalysatorer og nukleosid aktiviteter, og dimer affinitet/stabilitet.
I de senere årene har vårt laboratorium og andre utviklet ulike metoder for å karakterisere RAF-familiens kinaser og mutanter. Ifølge vårt laboratorium og andres erfaring, tror vi at følgende tre analysene har fordeler i å definere sykdoms relaterte RAF mutanter: (1) in vitro kinase analysen som kan utføres med letthet for å oppdage katalysatoren aktivitet av constitutively aktiv RAF mutanter15; (2) RAF co-aktivisering analysen som er en pålitelig og praktisk metode for å måle nukleosid aktivitet av kinase-Dead RAF mutanter13,15,21,22,23, fra 25; (3) gratis Split luciferase analysen som har mye høyere følsomhet i å måle den relative dimer affinitet/stabilitet av RAF mutanter i motsetning til den tradisjonelle co-immunutfelling analysen, og er i stand til å gjennomføre uten avansert utstyr i kontrast til kvantitative analytiske metoder som spr (SUrface Plasmon Resonance) analyse15,22. Ved å kombinere disse tre analysene kan vi lett forstå hvordan en sykdom-relatert RAF-mutant endrer nedstrøms signalene og dermed benytter en hensiktsmessig terapeutisk strategi for å behandle sykdommen forårsaket av denne RAF-mutasjonen.
I denne artikkelen har vi presentert tre metoder for karakteriserer sykdom-relaterte RAF mutanter, som inkluderer in vitro kinase analysen, RAF co-aktivering analysen, og gratis Split luciferase analysen. Siden RAF kinaser har både katalysator aktivitet og nukleosid aktivitet, ulike RAF mutanter kan aktivere nedstrøms signalering gjennom to distinkte mekanismer13,14,16,17, <sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne erkjenne den hårete Cell leukemi Fellowship for støtte av yuan Jimin. Dette arbeidet ble støttet av Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge finansiering Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bygge bro Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), og SHF akademisk medisin Forskningsstipend (AM/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |