Summary
Denne protokol isolerer ekstracellulære vesikler (EVs) væk fra virions med høj effektivitet og udbytte ved at indarbejde EV nedbør, tæthed gradient ultracentrifugering, og partikel opsamling for at muliggøre en strømlinet arbejdsgang og en reduktion af start volumen krav, hvilket resulterer i reproducerbare præparater til brug i al forskning i EV.
Abstract
En af de store forhindringer i området for ekstracellulær vesikelprotein (EV) forskning i dag er evnen til at opnå renset EV præparater i en viral infektion indstilling. Den præsenterede metode er beregnet til at isolere EVs væk fra virions (dvs., HIV-1), giver mulighed for en højere effektivitet og udbytte i forhold til konventionelle ultracentrifugering metoder. Vores protokol indeholder tre trin: EV nedbør, tæthed gradient adskillelse, og partikel opsamling. Downstream-assays (dvs., Western blot, og PCR) kan køres direkte efter partikel opsamling. Denne metode er fordelagtig i forhold til andre isolations metoder (dvs. ultracentrifugering), da den gør det muligt at anvende minimale start volumener. Desuden er det mere brugervenlig end alternative EV isolation metoder, der kræver flere ultracentrifugering trin. Men den præsenterede metode er begrænset i sit omfang af funktionelle EV assays, da det er vanskeligt at elueres intakt EVS fra vores partikler. Desuden er denne metode skræddersyet til en strengt forskningsbaseret indstilling og vil ikke være kommercielt levedygtig.
Introduction
Forskning centreret omkring ekstracellulære vesikler (EVs), specielt exosomer, en type af EV spænder 30-120 nm og karakteriseret ved tilstedeværelsen af tre tetraspanin markører CD81, CD9, og CD63, er i vid udstrækning blevet formet af udviklingen af metoder til at isolere og rense de vesikler af interesse. Evnen til at dissekere mangesidede mekanismer er blevet hæmmet på grund af komplekse og tidskrævende teknikker, der genererer prøver bestående af en heterogen population af vesikler genereret via forskellige veje med en bred vifte af indhold, størrelser og Tætheder. Selv om dette er et problem for næsten alle EV forskning, det er af særlig betydning, når man studerer EVs i forbindelse med viral infektion, som virions og virus-lignende partikler (VLPs) kan være ens i diameter til vesikler af interesse. For eksempel er humant immundefekt virus type 1 (HIV-1) ca. 100 nm i diameter, hvilket er omtrent samme størrelse som mange typer EVs. Derfor har vi udviklet en ny EV-isolations arbejdsgang for at løse disse problemer.
Den nuværende guld standard af EV isolation er ultracentrifugering. Denne teknik gør brug af de forskellige vesikale tætheder, som gør det muligt at separere vesikler ved centrifugering med differentiel sedimentering af højere densitet partikler versus nedre tæthed partikler på hver etape 1,2. Der kræves flere Centrifugerings trin med lav hastighed for at fjerne intakte celler (300-400 x g i 10 minutter), cellerester (~ 2.000 x g i 10 min) og apoptotiske organer/store vesikler (~ 10.000 x g i 10 min). Disse indledende rensninger efterfølges af højhastigheds ultracentrifugering (100000-200000 x g for 1,5-2 timer) til sediment evt. Vaske trin udføres for yderligere at sikre EV renhed, men dette resulterer i reduktionen af antallet af isolerede EVS, hvilket sænker det samlede udbytte 3,4. Denne metodes nytte er yderligere begrænset af kravet om et stort antal celler (ca. 1 x 108) og et stort prøvevolumen (≫ 100 ml) for at opnå tilstrækkelige resultater.
For at imødegå de voksende bekymringer, er udfældning af vesikler med hydrofile polymerer blevet en nyttig teknik i de seneste år. Polyethylenglycol (PEG) eller andre relaterede nedfældnings reagenser gør det muligt for brugeren at trække vesikler, vira og protein-eller protein-RNA-aggregater i en prøve ved blot at inkube prøven med den foretrukne reagens efterfulgt af en enkelt lavhastigheds centrifugering1,2,5. Vi har tidligere rapporteret, at brugen af PEG eller relaterede metoder til at udfældes EVs i forhold til traditionelle ultracentrifugering resultater i et betydeligt højere udbytte6. Denne strategi er hurtig, nem, kræver ikke ekstra dyrt udstyr, er let skalerbar, og bevarer EV struktur. Men på grund af den promiøse karakter af denne metode, de resulterende prøver indeholder en række produkter, herunder frie proteiner, protein komplekser, en række EVs, og virions dermed kræver yderligere rensning for at opnå den ønskede population1 ,2,7,8.
For at overvinde den heterogenitet af EVs opnået fra forskellige nedbør metoder, tæthed gradient ultracentrifugering (DG) udnyttes til bedre at adskille partikler baseret på deres tæthed. Denne metode udføres ved hjælp af en trinvis gradient ved hjælp af en tæthed gradient medium, såsom iodixanol eller saccharose, som giver mulighed for adskillelse af EVs fra proteiner, protein komplekser, og virus eller virus-lignende partikler (Vlp'er). Det er vigtigt at bemærke, at selv om det engang var tanken, at GD tillod en mere præcis adskillelse af EV-delpopulationer, er det nu kendt, at størrelser og tætheder af forskellige vesikler kan overlappe hinanden. For eksempel vides det, at exosomer har flotations tætheder på 1,08-1.22 g/ml9, mens vesikler isoleret fra Golgi (Copi+ eller clathrin+) har en tæthed på 1,05-1.12 g/ml og dem fra endoplasmatiske reticulum (copii+ ) sediment ved 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Desuden, hvis man ønsker at sammenligne exosomale fraktioner mod fraktioner, der indeholder virale partikler, kan dette blive vanskeligere afhængigt af tætheden af virus af interesse-der er vira andre end HIV-1, der sandsynligvis ækvibrere på samme tæthed som exosomale positive fraktioner2.
Endelig er berigelse af EV-Preps for downstream-visualisering og funktionelle analyser afgørende for EV-forskningen. Brugen af EV-berigende nanopartikler, specifikt, multi-funktionelle hydrogel partikler, der spænder 700-800 nm i diameter, er et afgørende skridt i at opnå koncentrerede EV Preps. De besidder en høj affinitet aromatisk agn, som indkapslet af en porøs ydre sigtige Shell til at fremme selektivitet. De nanopartikler, der anvendes i denne undersøgelse, omfatter to særskilte præparater med forskellige kerne lomidler (reaktiv rød 120 NT80; og Cibacron Blue F3GA NT82), som har vist sig at øge indfangningen af EVs fra forskellige reagenser og biofluider (Se tabellen over materialer )6,10,11,12,13,14,15. Partiklerne giver let berigelse af EVS fra talrige udgangsmaterialer, herunder iodixanol fraktioner, cellekultur supernatant, samt patientens biofluider såsom plasma, serum, cerebrale spinal væsker (CSF), og urin6,13 .
Den metode, der præsenteres her, forbedrer effektiviteten af de nuværende EV rensningsteknikker ved at kombinere flere teknologier; EV nedbør, tæthed gradient ultracentrifugering, og partikel opsamling, at strømline arbejdsprocessen, reducere prøvekrav, og øge udbyttet for at opnå en mere homogen EV prøve til brug i alle EV forskning. Denne metode er særlig nyttig i undersøgelsen af evt og deres indhold under virus infektion, da det omfatter et 0,22 μm filtreringstrin for at udelukke store, uønskede vesikler og Vlp'er og adskillelse af den samlede EV-population baseret på tæthed for effektivt at Isoler EVs fra virions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. filtrering og udfældning af ekstracellulære vesikler (EVs)
- For at forberede kulturen supernatanten fra inficerede eller transficeret celler (dvs. cellelinjer og/eller primærceller), kultur ca 10 ml af sene-log celler i 5 dage ved 37 °c og 5% Co2 i passende kulturmedium (dvs., rpmi eller DMEM med 10% føtal kvæg serum [FBS]).
Bemærk: Alle reagenser til kulturmedium skal være fri for EVs og kan enten købes (Se tabel over materialer) eller tilberedes in-House ved præ-ultracentrifugering af serum ved 100.000 x g for 90 min. Denne protokol har været en succes for flere almindeligt anvendte cellelinjer, herunder: Cem, jurkat, 293t, U937 (ikke-inficerede linjer), U1, j 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 og HTLV-1 inficerede linjer), flere transficeret celler, og primære myeloid og T-celler (begge inficerede og ikke-inficerede); denne protokol kan dog bruges til enhver celletype, herunder dem, der kræver særlige medie-eller kulturforhold. Tæthed af celler kan være nødvendigt at være optimeret til forskellige celletyper. Det anbefales, at den højeste tæthed anvendes med minimal celledød efter 5 dage. - Centrifuger kulturen ved 3.000 x g i 5 min. til pellet celler og kassér pellet.
- Filtrer kultur supernatanten ved hjælp af et sterilt 0,22 μm filter og saml filtratet i et rent rør.
- Tilsæt samme volumen af PEG nedbør reagens (1:1 ratio) til filtreret supernatant. Vend røret flere gange for at sikre en homogen blanding.
Bemærk: Må ikke vortex. - Inkuber blandingen ved 4 °C natten over (O/N).
- Centrifuge blandingen ved 1.500 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) for at give en heterogen EV-pellet.
Bemærk: EV pellet skal fremstå hvid eller off-white i farve. - Kassér den EV-depleterede kultur supernatant.
- Resuspendere EV pellet i 150 – 300 μL af 1x fosfat-bufferet saltvand uden calcium og magnesium (PBS) og holde på is.
2. opførelse af en tæthed gradient
- Bland iodixanol tæthed gradient medium med 1x PBS at skabe 11 forskellige 1 mL densitet fraktioner fra 6 til 18% iodixanol i 1,2% intervaller i separate mikrocentrifuge glas som vist i figur 1a.
- Vortex hvert rør til at blande.
- Lagtæthed fraktioner i et forrenset og tørt svingende spand ultracentrifuge rør, der starter med brøk #18 og slutter med brøk #6 som angivet i figur 1b.
Bemærk: Alle rør skal desinficeres ved hjælp af en 10% blege spray efterfulgt af skylning 3x med deioniseret vand og en endelig vask af sterilt deioniseret vand forud for lastning af gradient fraktioner. - Tilsæt resuspenderet EV pellet (300 μL) til toppen af den lagdelte gradient i ultracentrifuge røret.
- Ultracentrifuge x g ved 4 °c i 90 min.
- Fjern forsigtigt 1 mL fraktioner fra ultracentrifuge røret og Overfør hver fraktion til nye mikrocentrifuge glas.
3. tilsætning af EV-fraktioner Uved hjælp af nanopartikler
- Opret en 30% opslæmning af nanopartikler med lige store mængder NT80, NT82 og 1x PBS.
Bemærk: Blandingen skal være vortexes før brug for at sikre homogeniteten. - Der tilsættes 30 μL af gyllen til hvert mikrocentrifuge glas, som indeholder massefylde fraktioner, og som pipetter/inverterer dem flere gange for at blande.
- Roter EV-berigende nanoparti-holdige massefylde fraktion mikrocentrifuge glas O/N ved 4 °C ved ca. 20 rpm.
- Centrifuge tætheds fraktion mikrocentrifuge glas ved 20.000 x g i 5 minutter ved rt.
- Kassér væsken og vask EV pellet to gange med 1x PBS.
Bemærk: Nanopartikel pellets kan fryses ved-20 °C eller umiddelbart anvendes til forskellige downstream assays (dvs. PCR, Western blot, massespektrometri, og andre assays).
4. anbefalet klargøring af Nanoparti pellet til downstream-assays
-
For RNA-isolation
- Resuspension af pellet i 50 μL autoklave deioniseret vand behandlet med 0,001% diethylpyrocarbonat (DEPC) filtreret gennem et 0,2 μm filter og isolerer RNA i henhold til pakke producentens protokol.
-
For gel elektroforese
- Resuspension af pellet direkte i 15 μL Laemmli buffer.
- Varme prøve 3x ved 95 °C i 3 min. vortex forsigtigt og spin ned mellem hver varmecyklus.
- Centrifugerings prøven for 15 s ved 20.000 x g , og Læg alt elueret materiale direkte på gelen.
Bemærk: for at sikre de bedste resultater skal du begrænse mængden af partikler, der læsses på gelen og køre gelen ved 100 V for at sørge for, at de resterende partikler er indeholdt i brøndene.
-
For trypsin fordøjelse
- Resuspension af pellet i 20 μL urinstof før alkylering og trypsinisering af prøven. Nanopartikler kan pelleteres ved en 14.000 x g centrifugering ved rt i 10 min. prøve, der indeholder det trypsinerede peptid, kan overføres til en ren opsamlings slange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG nedbør øger EV udbytte
Vores kombination tilgang til EV isolation er betydeligt mere effektiv med hensyn til EV opsving i forhold til traditionelle ultracentrifugering, som det fremgår af 90% reduktion i mængden af udgangsmateriale, der kræves. Ultracentrifugering, den nuværende guld standard i EV isolation, kræver ca. 100 mL kultur supernatanten at producere en passende EV prep for downstream assays, mens vores roman protokol kræver kun 10 mL. Denne reduktion er muliggjort ved brug af PEG EV-udfældnings reagens, som giver en signifikant stigning i EV-udbyttet målt ved nanosporings analyse (NTA). Resultaterne i figur 2a, som tidligere er blevet offentliggjort6, indikerer, at når der anvendes 10 ml kultur supernatanten peg nedbør resulterede i inddrivelse af 7,27 x 1010 EVS, som var ca 500-fold mere end antallet af evt genvundet fra samme udgangsmateriale ved hjælp af ultracentrifugering (1,45 x 108). Øget effektivitet af isolationen af exosomer, en specifik EV subtype, blev også observeret som tydeligt ved øget niveauer af velkarakteriserede exosomvesikler markør proteiner, CD81, CD63, og CD9. Western blot analyse sammenligner EV Preps produceret fra enten ultracentrifugering eller EV nedbør ved hjælp af en PEG nedbør reagens er vist i figur 2b. Disse resultater viser en 3.000-fold stigning i CD81, en 4-fold stigning i CD63, og en 40-fold stigning i CD9 som målt ved densitetsmåling analyse. Tilsammen tyder disse resultater på, at den skitserede protokol ikke kun øger det samlede EV-udbytte, men også øger genfinding af exosomer i forhold til ultracentrifugering.
Karakterisering af EVs og adskillelse af EVs væk fra HIV 1-virus
For at karakterisere de vesikler, der er til stede i hver fraktion efter nanopartikel-berigelse, blev EVs isoleret fra ikke-inficeret CEM eller HIV 1-inficerede U1-cellekultur supernatanten ved hjælp af den skitserede protokol og karakteriseret ved hjælp af Western blot af hver nanopartikel-beriget iodixanol fraktion. Dataene i figur 3a viser vores tidligere offentliggjorte resultater, som viser tilstedeværelsen eller fraværet af tre exosomale tetraspaniner (CD81, CD63 og CD9) i hver FRAKTION (Cem-celler; øverste panel). Resultaterne indikerer, at exosomer, som defineret ved tilstedeværelsen af alle tre tetraspaniner inden for fraktionen, findes i tre forskellige populationer: EXO #1 som omfatter fraktioner 10.8-12.0, EXO #2 som omfatter fraktioner 15,6-16,8, og EXO # 3, som omfatter kun 18,0-brøken. På trods af tilstedeværelsen af tre forskellige populationer, kan protokollen ikke udelukke muligheden for tilstedeværelsen af yderligere typer af EVs inden for hver fraktion. Desuden udelukker disse resultater ikke endeligt muligheden for, at der er vesikler i disse populationer, som er positive for en kombination af de testede tetraspanin-markører. Disse EVs kan derefter adskilles yderligere ved yderligere rensnings strategier.
Den hastigt udviklende felt af EV/exosome forskning er eksploderet siden deres opdagelse og har resulteret i mange nyfundne funktioner og applikationer til disse vesikler. Især deres rolle som intracellulære budbringere i ikke kun normal fysiologi, men også i sygdom har ført til brugen af betydelige ressourcer til at dissekere virkningerne og nytten af ekstracellulære vesikler, specifikt exosomer, på recipient cellerne16 , 17 , 18. talrige undersøgelser har impliceret EVS i patogenesen af en række forskellige infektioner, herunder HIV-16,10,12,19,20,21 , 22. størrelses ligheden mellem EVS og virions udgør imidlertid en potentiel hindring for fastlæggelsen af disse EV-medierede mekanismer. For at løse denne bekymring, har vi designet vores protokol til at gennemføre en tæthed gradient til effektivt at adskille EV populationer fra virions. Til dette formål, cellekultur supernatanten fra HIV-1 inficerede celler blev udsat for den præsenterede protokol og analyseret af Western blot for tilstedeværelsen af HIV-1 gag p24 at afgøre, hvilken fraktion eller fraktioner indeholdt HIV-1 virions. Resultaterne vist i figur 3a (midterste panel) viser lokaliseringen af p24 i tre uafhængige betingelser: i fravær af en induktor, i nærværelse af en induktor (phorbols 12-myristate 13-acetat; PMA), og i nærværelse af PMA og antiretroviral kombinationsbehandling (cART), standardbehandling for HIV-1. Disse data indikerer, at HIV-1-virus er lokaliseret til fraktion 16,8 som målt ved tilstedeværelsen af p24 og dets uncleaved polyprotein Pr55. Desuden, når cellerne er udsat for cART, som omfatter indinavir, en proteasehæmmer, som forhindrer spaltning af Pr55 til p24, ingen p24 blev påvist i nogen fraktion. I stedet blev kun Pr55 detekteret og var til stede i 16,8-18.0 fraktioner, hvilket indikerer et skift af virus til mere tætte fraktioner. Lignende resultater blev opnået ved hjælp af primære makrofager (lavere panel). Selv om den beskrevne protokol resulterer i co-sedimentation af EXO #2 og EXO #3 populationer med virus, den EXO #1 population (fraktioner 10.8-12.0) forblev virusfri, giver mulighed for downstream-assays fri for virus forurening.
Denne form for adskillelse af virus væk fra EVs giver os mulighed for at løse muligheden for stykker af virus ind EVs eller blive udskillet fra inficerede celler som frit protein. Resultater i figur 3b indikerer, at hiv-1 NEF-protein kan findes i exo-#1 populationen ud over exo-#2 og exo-#3 populationer. NEF vises også i 6,0-brøken, hvilket indikerer, at NEF potentielt kan udskilles fra inficerede celler som et frit protein og inden for en EV. Derudover findes HIV-1 Vpr-protein i 6,0-fraktionen, mens HIV-1 TAT-proteinet overvejende findes i 6,0-fraktionen, men også optræder i fraktioner 7.2-9.6. Vi tester i øjeblikket alle fraktioner for tilstedeværelsen af TAT protein af ELISA. Disse resultater indikerer, at både TAT og Vpr kan udskilles fra inficerede celler, sandsynligvis som frie proteiner, mens TAT også kunne inkorporeres i evt. Kollektivt, disse data indikerer, at vores metode til EV isolation kan med held isolere exosomerne (EXO #1) væk fra HIV-1 virions (EXO #2 og #3), og at EVS fra HIV-1-inficerede celler indeholder nogle HIV-1 proteiner, som kan påvirke HIV-1 patogenesen.
Karakterisering af EVs og adskillelse af evt væk fra andre vira
For at anvende denne protokol til andre virale infektion modeller, vi har karakteriseret vesikler fra celler inficeret med flere forskellige vira. Figur 3c viser en illustration af tidligere opnåede vesikle og virus fordelinger efter nedbør, separation og tilsætning i henhold til den beskrevne protokol. Som tidligere vist i figur 3aer EXOSOMER (CD9+CD63+CD81+) til stede i tre forskellige populationer (EXO #1, fraktioner 10.8-12.0; EXO #2, fraktioner 15,6-16,8, og EXO # 3, 18,0 fraktion) og HIV-1-virus lokaliserer til den højere densitet 16,8 og 18,0 fraktioner (Lanes 10-11). Ikke overraskende, når man anvender denne protokol til at karakterisere EVs frigivet fra Human T-lymfotropic virus type 1 (HTLV-1), en retrovirus, der er kendt for at forårsage kræft hos voksne, vi observerede resultater svarende til HIV 1-relaterede EVs. Det tredje panel i fig. 3c viser, at HTLV-1-virussen primært var lokaliseret til den højeste tætheds fraktion (18,0) og i mindre grad fraktionerne 13,2-16,8, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af HTLV-1 matrix protein (P19). Desuden har vi tidligere konstateret, at HTLV-1 transaktiverende protein, skat, som er fraværende fra HTLV-1 virion, er til stede inden for exosomer frigivet fra HTLV-1 inficerede celler15,23. Dataene i figur 3c viser, at skatten var til stede i de lavere tætheds fraktioner (6,0-12,0), hvoraf to har vist at indeholde exosomer (10,8 og 12,0).
Dernæst testede vi isolations protokollen i forbindelse med større og mindre vira som Ebola virus (EBOV) og Zika virus (ZIKV), som henholdsvis HIV-1 og HTLV-1 virions er både retrovira og meget ens i diameter. Ved hjælp af VLP som en surrogat biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) model af EBOV montage og udgang, fandt vi, at VLP, som er ca. 1 μm i længden, lokaliserer til den højeste tæthed fraktion (18,0) i fravær af 0,22 μm filtrering (midterste panel, figur 3c). Desuden, når VP40, EBOV matrix protein, udtrykkes ved høje niveauer, det udskilles fra cellen gennem flere forskellige mekanismer resulterer i tilstedeværelsen af VP40 i hver tæthed fraktion, herunder dem, som exosomer er lokaliseret13 , 14. i modsætning hertil er zikv virions signifikant mindre end hiv-1 virions, der måler ca. 40 nm i diameter. Det repræsentative diagram i det nederste panel af figur 3c viser tilstedeværelsen af zikv virions i både lav densitet (6.0-8.4) og høj densitet (15,6-18.0) fraktioner, tyder på tilstedeværelsen af både gratis virus og EV-indkapslet virus, hhv.
Figur 1: Opførelse af en iodixanol-massefylde gradient. A) de relative mængder af iodixanol og PBS udnyttes til at skabe hver tætheds fraktion (brøk #). Brøken # betegner den procentdel af iodixanol, der indgår i hver fraktion. Deres relative tæthed og placering i gradienten er afbildet fra tungeste til letteste. (B) placeringen af tætheds fraktioner (6.0-18) i ultracentrifuge tube er vist (venstre side) samt placeringen af de tre EV populationer (EXO #1, EXO #2, EXO #3), EXO-lignende vesikler, og protein komplekser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: peg nedbør reagens øger EV udbytte. (A) for at sammenligne EV-genvinding blev EVS isoleret fra 5 d HIV 1-inficerede monocyt (U1) kultur supernatanten (10 ml) ved hjælp af traditionelle ultracentrifugering (100.000 x g) eller peg-udfældnings reagens (inkubation ved et 1:1-forhold). EVs fra begge berigelses procedurer blev analyseret ved hjælp af nanosporings analyse for at vurdere den resulterende EV-koncentration som beskrevet i DeMarino, et al.6. NTA blev målt ved 11 uafhængige stillinger i teknisk triplicat. De blå bjælker repræsenterer et gennemsnit af de 33 målinger ± S.D. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en tosidet elevs t-test; p < 0,001. B. EVS fra 5-dages Cem Culture supernatanten ved hjælp af enten ULTRACENTRIFUGERING (UC) eller peg nedbør efterfulgt af iodixanol tæthed adskillelse. Ultracentrifugering blev udført ved hjælp af 100 mL kultur supernatanten (Lane 1) mens PEG nedbør og efterfølgende iodixanol fraktionering blev udført ved hjælp af 10 mL kultur supernatanten (Lane 2). Den totale EV-pellet opnået fra ultracentrifugering og 10,8-fraktionen fra PEG/iodixanol-separationen blev analyseret af Western blot for tilstedeværelsen af exosomale markør proteiner (CD81, CD63 og CD9) med actin som kontrol. Af klarhedshensyn vises udvalgte baner fra samme skamplet med identiske eksponeringer i panel B. Dette tal er blevet ændret fra DeMarino, et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: isolering af EVS væk fra vira. A) femdages kultur supernatanter fra ikke-inficerede Cem-celler (toppanel), HIV-1 (BA-L; MOI: 0,01) inficerede U1-celler (± PMA-og ± cART-behandling; midterste panel) eller HIV 1-inficerede primære makrofager (bundpanel) blev inkuberet med PEG-udfældnings reagens ved 4 °C natten over. EVs blev udskilt i fraktioner ved hjælp af en iodixanol-massefylde gradient. EVs fra alle fraktioner blev beriget med NT80/82 partikler natten over ved 4 °C. CEM nanopellets blev analyseret ved hjælp af Western blot for tilstedeværelsen af exosomale markør proteiner CD81, CD63 og CD9. U1 (± PMA og ± cART behandling) og HIV-1 inficerede primære makrofager blev analyseret for tilstedeværelsen af HIV-1 gag protein (p24 og Pr55, spaltet og uncleaved HIV-1 gag polyprotein, henholdsvis), samt CD63. Blots blev probed for actin som en kontrol. Ægte exosomvesikler populationer (CD81+CD63+CD9+) er skitseret med rødt. Dette tal er blevet ændret fra DeMarino, et al.6 (B) 5-dages kultur supernatanter fra inficerede U1-celler blev inkuberet med peg-udfældnings reagens ved 4 °c natten over. EVs blev udskilt i fraktioner ved hjælp af en iodixanol-massefylde gradient. EVs fra alle fraktioner blev beriget med NT80/82 partikler natten over ved 4 °C. Fraktioner blev kørt på en Western blot for tilstedeværelsen af HIV-1 NEF, Vpr, og TAT. Actin blev brugt som kontrol. Ægte exosomvesikler populationer (CD81+CD63+CD9+) er skitseret med rødt som tidligere defineret i demarino, et al.6 (C) repræsentativ illustration af tidligere karakteriserede EV-separations profiler fra fire forskellige vira: HIV-1, HTLV-1, EBOV, og ZIKV. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: arbejdsgang for protokol. Den roman workflow kombinerer flere teknikker, herunder filtrering, EV nedbør ved hjælp af PEG nedbør reagens, iodixanol tæthed gradient separation, og nanopartikel berigelse af EVs. Udnyttelsen af denne protokol adskiller EVs fra forskellige vira og giver en lille volumen prøve til downstream-assays, herunder qPCR, Western blot, massespektrometri, RNA-sekvensering, cytokinanalyse, ELISA og cellebaserede assays. Dette tal er blevet ændret fra DeMarino, et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den skitserede metode giver mulighed for forbedret EV-udbytte og adskillelse af virus fra EVs ved hjælp af en kombination tilgang til isolation. Relativt store mængder af udgangsmateriale (dvs. celle supernatant) kan filtreres før EV-isolation ved udfældning, GD separation og tilsætning af nanopartikel, hvilket resulterer i et endeligt volumen på ~ 30 μL, hvilket giver mulighed for umiddelbar brug i en række downstream-assays. Brugen af nanopartikel berigelse er afgørende, da disse EV-berigende nanopartikler i forhold til traditionelle ultracentrifugering har vist sig at fange vesikler mere effektivt, hvilket giver en større end eller lig med mængden af vesikler fra 1 mL kultur supernatanten sammenlignet med 10 mL ultracentrifuged kultur supernatanten15. Samlet set omfatter den beskrevne protokol kombinationen af flere velkendte teknikker og bør derfor frembyder begrænsede vanskeligheder. Men inkorporering af EV-berigende nanopartikler introducerer en ny teknik, som kan kræve fejlfinding og/eller modifikationer for at opnå ønskværdige resultater afhængigt af downstream-analysen eller biologisk mål af interesse. Vi anbefaler, at nanopartikler inkuberet med filtrerede cellekultur supernatanter natten over. Hvis målproteinet eller RNA af interesse er af lav overflod i modelsystemet, kan protokollen tilpasses for at øge inkubationstiden for at sikre opsamling af målet. Anvendelsen af nanopartikler i downstream-assays kan typisk opnås ved at suspendere pellet i den ønskede prøve buffer for hver analyse. For eksempel kan nanopartikler resuspenderes direkte i Laemmli buffer til Western blot-analyse. Det tilfangetagne materiale skal derefter mere effektivt eluppes fra nanopartiklerne i SDS via opvarmning og vortexning cyklusser. For at opnå tilstrækkelig adskillelse af protein, bør der udvises forsigtighed for at begrænse mængden af nanopartikler indlæst i gelen, og gelen skal køres på ca. 100 V for at sikre, at eventuelle resterende partikler er indeholdt i brøndene. Til visualisering af lavmolekylære proteiner opnår en overnatning våd overførsel optimale resultater. Selv om brugen af nanopartikler resulterer i signifikant berigelse af vesikle populationer, skal der tages yderligere skridt til at elueres fanget materiale fra partiklerne. Desuden kan eluering af materialet potentielt begrænse nytten af EVs i downstream funktionelle assays, da mange elueringsbuffere kan beskadige EV-membranens integritet. Yderligere forskning er nødvendig for at konstruere en strategi for at muliggøre fjernelse af intakte vesikler fra nanopartikler post inkubation. En anden ulempe ved disse partikler er den nuværende mangel på karakterisering. Den ydre skal af partiklen er designet til at udelukke høj molekylvægt molekyler. Der finder dog ikke specifik målretning af partiklerne til evt sted, og som følge heraf kan mange forstyrrende faktorer og baggrunds signaler potentielt være til stede i downstream-analyser.
Den beskrevne metode skal primært anvendes til laboratorieformål. Vi har for nylig udviklet alternative metoder til at udvide mulighederne i vores kombinations tilgang til yderligere teknikker til isolering af EVs fra små, tålmodige biofluider såsom plasma og CSF og storstilet kommerciel EV-produktion. Til isolering af EVs væk fra virus i patientmateriale har vi indarbejdet brugen af størrelses udelukkelse kromatografi (SEC) kolonner, som udnyttes i stedet for en tæthed gradient. Disse søjler er gavnlige i, at de er til engangsbrug og derfor er ideelle i høj indeslutning laboratorier. Men, SEC kolonner adskille partikler efter størrelse, derfor, det følger, at denne type separation kun gælder for adskillelse af store eller meget små vira, såsom EBOV (~ 1 μm) eller ZIKV (~ 40 nm) henholdsvis fra EVs eller adskillelse væk fra gratis protein. Med hensyn til EV-produktion i stor skala har nylige fremskridt inden for filtrerings baserede metoder, nemlig tangentielle flow filtrering (TFF), gjort det muligt at isolere EVs effektivt fra store prøvevolumener. TFF har historisk set været anvendt til rensning af nanodimensionerede biomolekyler, herunder vira, og gennem optimering af protokoller er dette system med succes blevet tilpasset til isolation af EVS24,25. Under TFF-processen løber prøvevæsken kortvarigt over overfladen af en semi gennemtrængelig membran, som selektivt bevarer vesikler baseret på størrelse og molekylvægt, hvilket giver mulighed for adskillelse af evt væk fra frie proteiner og andre kontaminerende biomolekyler26. Sammenlignet med ultracentrifugering, er det blevet rapporteret, at TFF resulterer i højere udbytter, mindre aggregering, og reducerer Lot-to-Lot variabilitet af EVs27. Desuden er brugen af TFF for god fremstillingspraksis (GMP)-grade isolering af EVs til terapeutisk anvendelse også blevet rapporteret28. På grund af sin skalerbarhed og reproducerbarhed, denne teknologi giver et stort potentiale for fremtidige EV forskning.
Vira kommer i forskellige størrelser og tætheder, derfor afhængigt af den pågældende virus, optimering af denne protokol kan være påkrævet. For meget store vira som Ebola (~ 1 μm eller større i længden), kan enkel filtrering udnyttes til at fjerne det store flertal af virions og store kontaminerende organer såsom vlps og apoptotiske organer14. Dette giver mulighed for det meste af adskillelsen af virus væk fra EVs at være eksekverbar på forsiden af rensning. Men, i tilfælde af mindre vira såsom enterovirus (~ 30 nm), Zikavirus (~ 40 nm), hepatitis B virus (~ 42 nm), hepatitis C virus (~ 55 nm), og andre, den fraktion, hvor virions sediment skal bestemmes før yderligere downstream funktionelle Analyser. Man kan ikke altid tilnærme den sandsynlige fraktion af sedimentering baseret på partikel diameteren alene. For eksempel er poliovirus, som er 30 nm i diameter, også kendt for at være indkapslet i sekretoriske autophagosomes29,30,31,32,33, og derfor vil sandsynligvis blive fundet på højre side af gradient (tættere fraktioner) i stedet for venstre (mindre tætte fraktioner). Mens vi har optimeret denne protokol i tilfælde af HIV-1, HTLV-1, og EBOV VLPs, yderligere vira skal karakterisering at finjustere protokollen for deres specifikke rensning væk fra EVs.
Den protokol, som er skitseret her (figur 4), giver for første gang brugeren mulighed for at adskille EVS fra virus med forbedret effektivitet og mindre mængder af udgangsmateriale sammenlignet med guldstandarden for EV-isolation, ultracentrifugering. Denne metode kan let tilpasses til de forhold ved hånden, herunder varierende prøvestørrelser, krævede udbytter, udgangsmateriale type (dvs., kultur supernatanten versus patientmateriale), og forskellige forskellige vira i forskellige størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L. er tilknyttet Ceres Nanosciences Inc., der producerer reagenser og/eller instrumenter, der anvendes i denne artikel. Alle andre forfattere erklærer ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle medlemmer af Kashanchi Lab, især Gwen Cox. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed (NIH) tilskud (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, og NS099029 til F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
