कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह दिखाना है कि लाइव कोशिकाओं में सतह रिसेप्टर गतिशीलता को चार आयामी रूप से कल्पना करने के लिए जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें। यहां सीडी 4+ प्राथमिक टी कोशिकाओं पर टी सेल रिसेप्टर्स दिखाए जाते हैं।
Abstract
एक कोशिका के सिग्नलिंग और कार्य गतिशील संरचनाओं और इसकी सतह रिसेप्टर्स की बातचीत से तय होते हैं। सीटू में इन रिसेप्टर्स के संरचना-कार्य संबंध को वास्तव में समझने के लिए, हमें पर्याप्त स्थानिक संकल्प के साथ लाइव सेल सतह पर उन्हें कल्पना और ट्रैक करने की आवश्यकता है। यहां हम दिखाते हैं कि लाइव सेल झिल्ली पर टी-सेल रिसेप्टर्स (टीसीआरएस) चार-आयामी (4डी, अंतरिक्ष और समय) के लिए हाल ही में विकसित जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएलएम) का उपयोग कैसे करें। टी कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की मुख्य प्रभावक कोशिकाओं में से एक हैं, और यहां हमने टी कोशिकाओं का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया ताकि यह दिखाया जा सके कि इन कोशिकाओं के सिग्नलिंग और कार्य टीसीआरएस की गतिशीलता और बातचीत से प्रेरितहैं। एलएलएम अभूतपूर्व स्थानिक संकल्प के साथ 4डी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इसलिए इस माइक्रोस्कोपी तकनीक को आम तौर पर जीव विज्ञान में विभिन्न कोशिकाओं के सतह या इंट्रासेलुलर अणुओं की एक विस्तृत सरणी पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
वास्तविक समय में त्रि-आयामी कोशिका सतह पर अणुओं की तस्करी और विसारित की सटीक गतिशीलता को हल करने के लिए एक पहेली रही है । माइक्रोस्कोपी हमेशा गति, संवेदनशीलता और संकल्प का संतुलन रहा है; यदि किसी भी एक या दो को अधिकतम किया जाता है, तो तीसरे को कम किया जाता है। इसलिए, छोटे आकार और अपार गति के कारण, जिसके साथ सतह रिसेप्टर्स चलते हैं, उनकी गतिशीलता पर नज़र रखना सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक प्रमुख तकनीकी चुनौती बनी हुई है। उदाहरण के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी1,2,3का उपयोग करके कई अध्ययन किए गए हैं, जिसमें उच्च अस्थायी संकल्प है, लेकिन केवल टी-सेल झिल्ली (~ 100 एनएम) का एक बहुत पतला टुकड़ा छवि कर सकता है, और इसलिए कोशिका में दूर हो रही घटनाओं को याद करता है। इन TIRF छवियों को भी केवल सेल के एक द्वि आयामी अनुभाग दिखा । इसके विपरीत, स्टॉचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म)4,फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम)5,और उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (एसटीईडी)6जैसी सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक, प्रकाश की एबी विच्छेदन सीमा को दूर कर सकती है। इन तकनीकों में उच्च स्थानिक संकल्प (~ 20 एनएम संकल्प)4,5,6,7है, लेकिन वे अक्सर पूर्ण द्वि-आयामी (2डी) या त्रि-आयामी (3 डी) छवि प्राप्त करने में कई मिनट लगते हैं, और इसलिए लौकिक संकल्प खो जाता है। इसके अलावा, तूफान और हथेली जैसी तकनीकें जो निमिष संकेतों पर भरोसा करती हैं,8,9कीगिनती में अशुद्धियां हो सकती हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अब तक का उच्चतम संकल्प (50 बजे तक संकल्प)10है; यह भी केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FIB-SEM) के साथ तीन आयामी आयोजित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप 3 एनएम XY और 500 एनएम जेड संकल्प11तक है । हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के किसी भी रूप कठोर नमूना तैयारकरने की आवश्यकता है और केवल निश्चित कोशिकाओं या ऊतकों के साथ आयोजित किया जा सकता है, समय के साथ लाइव नमूनों इमेजिंग की संभावना को नष्ट करने ।
अपने सच्चे शारीरिक 3 डी प्रकृति में जीवित कोशिकाओं में सतह और इंट्रासेलुलर अणुओं की गतिशीलता की पहचान करने के लिए आवश्यक उच्च स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के लिए तकनीक केवल हाल ही में विकसित की जा रही है। इन तकनीकों में से एक जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएलएम)12है, जो फोटोब्लीचिंग को काफी कम करने के लिए एक संरचित प्रकाश शीट का उपयोग करता है। नोबेल पुरस्कार विजेता एरिक बेतजिग द्वारा 2014 में विकसित, उच्च अक्षीय संकल्प, कम फोटोब्लीचिंग और पृष्ठभूमि शोर, और एक साथ देखने के क्षेत्र में सैकड़ों विमानों की छवि बनाने की क्षमता एलएलएस माइक्रोस्कोप को वाइडफील्ड, टीआईआरटी एफ और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप12,13,14,15,16, 17,18,19से बेहतर बनाती है। यह चार आयामी (एक्स, वाई, जेड और समय) इमेजिंग तकनीक, जबकि अभी भी विवर्तन सीमित (~ 200 एनएम XYZ रिज़ॉल्यूशन) में अविश्वसनीय अस्थायी संकल्प है (हमने लगभग 100 एफपीएस की फ्रेम दर हासिल की है, जिसके परिणामस्वरूप 3 डी स्थानिक अधिग्रहण के लिए प्रति फ्रेम 0.85 सेकंड के साथ 3 डी पुनर्निर्मित सेल छवि है)।
LLSM आम तौर पर एकल अणु और एकल कोशिका स्तर पर किसी भी कोशिका के भीतर किसी भी अणुओं के वास्तविक समय गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में अत्यधिक गतिशील कोशिकाओं में उन । उदाहरण के लिए, हम यहां दिखाते हैं कि टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एलएलएम का उपयोग कैसे करें। टी कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रभावक कोशिकाएं हैं। टीसीआरएस एंटीजन-पेश कोशिकाओं (एपीसी) की सतह पर प्रदर्शित पेप्टाइड-एमएचसी (पीएमएचसी) लिगांड को पहचानने के लिए जिम्मेदार हैं, जो टी सेल के चयन, विकास, भेदभाव, भाग्य और कार्य को निर्धारित करता है। यह मान्यता टी कोशिकाओं और एपीसी के बीच इंटरफ़ेस पर होती है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीयकृत रिसेप्टर क्लस्टरिंग जिसे इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स कहा जाता है। हालांकि यह ज्ञात है कि इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स में टीसीआरएस टी-सेल प्रभावक कार्य के लिए अनिवार्य हैं, फिर भी अज्ञात सिनेप्स के लिए वास्तविक समय टीसीआर तस्करी के अंतर्निहित तंत्र हैं। एलएलएम ने हमें वास्तविक समय में टीसीआरएस की गतिशीलता को परिणामी पीएमएचसी-टीसीआर इंटरैक्शन(चित्रा 1)के साथ सिनैप्स के लिए तस्करी करने से पहले और बाद में कल्पना करने की अनुमति दी है। इसलिए एलएलएम का उपयोग टीसीआरएस की प्रारंभिक गतिशीलता के वर्तमान प्रश्नों को हल करने और यह समझने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया जा सकता है कि एक कोशिका स्वयं और विदेशी एंटीजन के बीच कैसे अलग होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल को 5C से अलग सीडी 4+ टी कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। एलएलएम उपकरण पर C7 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग किया जाता है, और इसलिए अन्य सेल सिस्टम और एलएलएम को अलग-अलग अनुकूल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम शिकागो विश्वविद्यालय में डॉ व्यातास बिंदोकास से सलाह और मार्गदर्शन स्वीकार करना चाहते हैं । हम जाली प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप का समर्थन और रखरखाव के लिए शिकागो विश्वविद्यालय में एकीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एनआईएच न्यू इनोवेटर अवार्ड 1DP2AI144245 और एनएसएफ करियर अवार्ड 1653782 (जेएच) ने सपोर्ट किया। जेआर को एनएसएफ ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
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