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Immunology and Infection

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

Abstract

Allogene Knochenmarktransplantation (BMT) ist eine wirksame Therapie bei hämatologischen Malignitäten aufgrund des Transplantat-versus-Leukämie-Effekts (GVL), um Tumore auszurotten. Jedoch, seine Anwendung ist durch die Entwicklung der Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD), eine große Komplikation von BMT begrenzt. GVHD wird evoziert, wenn T-Zellen in den Spendertransplantaten alloantigen erkennen, das von Empfängerzellen exprimiert wird, und unerwünschte immunologische Angriffe auf gesunde Gewebe des Empfängers durchführen. So sind traditionelle Therapien entwickelt, um Spender T-Zell Alloreaktivität zu unterdrücken. Diese Ansätze beeinträchtigen jedoch den GVL-Effekt erheblich, so dass das Überleben des Empfängers nicht verbessert wird. Das Verständnis der Auswirkungen therapeutischer Ansätze auf BMT, GVL und GVHD ist daher von wesentlicher Bedeutung. Aufgrund der Antigen-präsentations- und Zytokin-Sekretionskapazitäten zur Stimulierung von Spender-T-Zellen spielen empfänger dendritische Zellen (DCs) eine wichtige Rolle bei der Induktion von GVHD. Daher wird die Ausrichtung von Empfänger-DCs zu einem potenziellen Ansatz für die Steuerung von GVHD. Diese Arbeit bietet eine Beschreibung einer neuartigen BMT-Plattform, um zu untersuchen, wie Host DCs GVH- und GVL-Antworten nach der Transplantation regulieren. Ebenfalls vorgestellt wird ein effektives BMT-Modell zur Untersuchung der Biologie von GVHD und GVL nach der Transplantation.

Introduction

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (BMT) ist eine wirksame Therapie zur Behandlung hämatologischer Malignome1,2 durch den Transplantat-versus-Leukämie-Effekt (GVL)3. Spenderlymphozyten führen jedoch immer unerwünschte immunologische Angriffe auf Empfängergewebe ein, ein Prozess, der als Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD)4bezeichnet wird.

Murine Modelle von GVHD sind ein wirksames Werkzeug, um die Biologie der GVHD und die GVL-Antwort5zu studieren. Mäuse sind ein kostengünstiges Forschungstiermodell. Sie sind klein und effizient mit Molekülen und Biologika in frühen Phasen der Entwicklung6dosiert. Mäuse sind ideale Forschungstiere für genetische Manipulationsstudien, weil sie genetisch gut definiert sind, was ideal für die Untersuchung biologischer Pfade und Mechanismen ist6. Mehrere Maus-Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) MHC-unübereinstimmende Modelle von GVHD haben sich gut etabliert, wie C57BL/6 (H2b) zu BALB/c (H2d) und FVB (H2q)'C57BL/6 (H2b)5,7. Dies sind besonders wertvolle Modelle, um die Rolle einzelner Zelltypen, Gene und Faktoren zu bestimmen, die GVHD beeinflussen. Die Transplantation von C57/BL/6 (H2b) Elternspendern an Empfänger mit Mutationen in MHC I (B6.C-H2bm1) und/oder MHC II (B6.C-H2bm12) ergab, dass eine Diskrepanz sowohl in der MHC-Klasse I als auch in der Klasse II eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von akutem GVHD ist. Dies deutet darauf hin, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen für die Krankheitsentwicklung7,8benötigt werden. GVHD ist auch an einer entzündlichen Kaskade beteiligt, die als "pro-inflammatorischezytokine Sturm"9bekannt ist. Die häufigste Konditionierungsmethode in murinen Modellen ist die Ganzkörperbestrahlung (TBI) durch Röntgen oder 137Cs. Dies führt zur Knochenmarkablation des Empfängers, wodurch eine Spenderstammzelltransplantation ermöglicht und eine Abstoßung des Transplantats verhindert wird. Dies geschieht durch die Begrenzung der Proliferation von Empfänger-T-Zellen als Reaktion auf Spenderzellen. Darüber hinaus spielen genetische Disparitäten eine wichtige Rolle bei der Krankheitsinduktion, die auch von geringfügigen MHC-Mismatch10abhängt. Daher variiert die myeloablative Bestrahlungsdosis in verschiedenen Mausstämmen (z. B. BALB/c-C57BL/6).

Die Aktivierung von Spender-T-Zellen durch Wirtsantigen-präsentierende Zellen (APCs) ist für die GVHD-Entwicklung unerlässlich. Unter den APCs sind dendritische Zellen (DCs) die stärksten. Sie sind vererbbar in der Lage, GVHD aufgrund ihrer überlegenen Antigenaufnahme, expression ierung von T-Zell-Kostimulierenden Molekülen und der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen, die T-Zellen zu pathogenen Teilmengen polarisieren, zu induzieren. Empfänger-DCs sind entscheidend für die Erleichterung der T-Zell-Grundierung und GVHD-Induktion nach der Transplantation11,12. Dementsprechend sind DCs zu interessanten Zielen bei der Behandlung von GVHD12geworden.

TBI ist erforderlich, um die Spenderzelltransplantation zu verbessern. Durch den TBI-Effekt werden Empfänger-DCs aktiviert und überleben nach der Transplantationkurzzeitig 12. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Verwendung von Biolumineszenz oder Fluoreszenz ist die Etablierung eines effektiven Modells zur Untersuchung der Rolle von Empfänger-DCs bei der GVHD nach wie vor eine Herausforderung.

Da Spender-T-Zellen die treibende Kraft für GVL-Aktivität sind, Behandlungsstrategien mit immunsuppressiven Medikamenten wie Steroiden zur Unterdrückung der T-Zell-Alloreaktivität verursachen oft Tumorrückfall oder Infektion13. Daher kann die Ausrichtung auf Empfänger-DCs einen alternativen Ansatz zur Behandlung von GVHD bieten, während der GVL-Effekt erhalten und Infektionen vermieden werden.

Kurz gesagt, die aktuelle Studie bietet eine Plattform, um zu verstehen, wie verschiedene Arten der Signalisierung in Empfänger-DCs die GVHD-Entwicklung und den GVL-Effekt nach BMT regulieren.

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Protocol

Die experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Central Florida genehmigt.

1. GVHD-Induktion

HINWEIS: Die allogene Knochenmark-Zelltransplantation (BM) (Schritt 1.2) erfolgt innerhalb von 24 h nach beeiritierter Bestrahlung. Alle unten beschriebenen Verfahren werden in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Führen Sie das Verfahren in einer Gewebekulturhaube durch und verwenden Sie gefilterte Reagenzien.

  1. Tag 0: Bereiten Sie die Empfängermäuse vor.
    1. Verwenden Sie weibliche Wildtyp-Mäuse (WT) auf einem BALB/c-Hintergrund (CD45.2+ H2kd+),10 bis 12 Wochen alt als Empfänger.
    2. Ear-Tag und wiegen Sie die Empfänger vor TBI. Dann bis zu 11 Mäuse in die Bestrahlungskammer geben und im Bestrahlungskörper aufbewahren. Bestrahlung in einer Einzeldosis von 700 cGy für 10-15 min.
    3. Zurückbestrahlte Tiere in die Käfige zurückbringen und vor der Transplantation in pathogenfreien Einrichtungen unterbringen.
      HINWEIS: Das minimale Körpergewicht der Empfänger sollte etwa 20 g betragen. Verwenden Sie dieses Gewicht als Referenz, um den Gewichtsverlust des Körpers während des Versuchszeitraums zu berechnen.
  2. Tag 1: Bereiten Sie T-Zell-erschöpftes Knochenmark (TCD-BM) von den Spendermäusen vor.
    1. Euthanisieren Sie CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 Mäuse durchCO2-Erstickung und warten Sie 2 x 3 min, bis sie bewusstlos sind. Führen Sie bei Bedarf eine zervikale Dislokation als sekundäre Euthanasie durch.
    2. Legen Sie jede Maus auf eine saubere Arbeitsplatte. Desinitieren Sie das Fell und die Haut mit 70% Isopropanol.
    3. Sammeln Sie die Tibia und Denfemur von beiden Beinen mit Zangen und Schere. Setzen Sie sie in eiskaltes RPMI mit 1% FCS und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (1% RPMI) in 50 ml konischen Röhren. Reinigen Sie den Oberschenkelknochen und die Tibiaknochen gründlich, indem Sie alle Muskelgewebe mit Zangen und Schere entfernen. Den Oberschenkelknochen und die Tibia von den 50 ml konischen Rohren auf eine Petrischale mit 92 mm Durchmesser mit 1% RPMI übertragen.
    4. Schneiden Sie mit der Schere die Enden des Oberschenkelknochens oder der Tibia. Füllen Sie ein 50 ml Rohr mit 25 ml von 1% RPMI 1640 medium. Verwenden Sie diese, um eine 3 ml Spritze zu füllen, die an einer 26 G Nadel mit 3 ml 1% RPMI befestigt ist. Setzen Sie diese Spritze in den Knochen ein und drücken Sie den Kolben, um das Knochenmark (BM) aus dem Hohlraum in das Sammelrohr mit 1% RPMI (ca. 3 ml/Knochen) zu spülen.
    5. Wiederholen Sie Schritt 1.2.4 für alle verbleibenden Tibia- und Oberschenkelknochen von anderen Spendermäusen. Halten Sie alle Sammelrohre auf Eis.
    6. Machen Sie die Einzelzellsuspension, indem Sie die Knochenmarkstücke durch ein 75 m Maschennetz-Zellsieb spülen. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension in einem 50 ml Rohr.
    7. Zentrifugenrohre bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet im PBS-Puffer mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) bei 20 x 106 Zellen/ml wieder auf. Speichern Sie ein Aliquot von 2 x 106 Zellen für Reinheitsfärbung.
    8. Thy 1-Antikörper bei 0,05 g/106 Zellen14 hinzufügen und 30 min bei 4 °C brüten. Einmal mit 25 ml eiskaltem PBS waschen. Bei 20 x 106/ml in 0,5% BSA/10% Jungkaninchenkomplement/2% DNase (10.000 U/ml in sterilemH2O) resuspendieren. 45 min bei 37 °C inkubieren und 2x wie bisher waschen.
      HINWEIS: T-Zellen werden mit einem mAb-spezifischen für Thy1, einem Protein, das von allen T-Zellen exprimiert wird, aber nicht mit anderen Leukozyten, erschöpft.
    9. Setzen Sie die Zellen in 20 ml PBS-Puffer mit 0,5% BSA aus. Zählen Sie die Knochenmarkzellen in 1% Essigsäure mit einem Hämozytometer. Halten Sie ein Aliquot von 2 x 106 Zellen für eine Reinheitsprüfung durch Durchflusszytometrie nach der Zellreinigung.
      HINWEIS: Eine Spendermaus erzeugt normalerweise etwa 25 x 106 TCD-BM.
    10. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um eine erfolgreiche Erschöpfung der T-Zellen zu bestätigen. Stain 1 x 106 Zellen, konserviert von den Schritten 1.2.7 (vor t-zellerschöpfung) und 1.2.9 (TCD-BM nach T-Zell-Erschöpfung) mit den folgenden Antikörpern: -CD3 (17A2), '-CD4 (GK1.5) und '-CD8' (53-6.7).
  3. Tag 1: Bereiten Sie T-Zellen von den Spendermäusen vor
    1. Verwenden Sie CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 Wildtyp (WT) Mäuse als Spender für T-Zellen.
    2. C57BL/6-Mäuse durch Kohlendioxid(CO2) Erstickung gemäß 1.2.1.
    3. Reinigen Sie das Fell und die Haut der Maus gründlich mit 70% Ethanol. Verbrauche Milz und Lymphknoten und trenne sie in eine einzellige Suspension von Splenozyten mit einem Spritzenkolben und 40 m Mesh-Sieben. Waschen Sie das Sieb und Spritzenkolben mit 1% RPMI (1% FBS mit RPMI-Medien), um alle Splenozyten zu sammeln.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Fügen Sie 5 ml ACK-Lysing-Puffer (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) nach dem Ablegen des Überstandes hinzu. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Der ACK-Lysepuffer wird zur Lysierung roter Blutkörperchen verwendet.
    5. Fügen Sie 5 ml 1% RPMI hinzu, um die Lyse zu stoppen. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
    6. Vorbereiten des eiskalten magnetisch aktivierten Zellsortierpuffers (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7,2). Entgasen Sie den Puffer vor der Verwendung. Setzen Sie die Zellpellets in 5 ml MACS-Puffer wieder auf.
    7. Zählen Sie die Splenozyten und überprüfen Sie mit einem Hämozytometer und 1% Trypanblau nach lebenden und abgestorbenen Zellen. Speichern Sie ein Aliquot von 2 x 106 Zellen, um die Reinigungsleistung mit der Durchflusszytometrieanalyse zu bewerten.
    8. Setzen Sie die Splenozyten in der Konzentration von 200 x 106/ml im MACS-Puffer wieder aus. Fügen Sie 0,03 l Biotin-Anti-Maus-Ter-119, 0,03 L Biotin-Anti-Maus-CD11b, 0,03 l Biotin-Anti-Maus-CD45R und 0,03 l Biotin-Anti-Maus-DX5 pro 106 Zellen hinzu. 15 min bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Biotin Anti-Maus-Ter-119, Biotin Anti-Maus-CD11b, Biotin Anti-Maus-CD45R und Biotin Anti-Maus-DX5 wurden verwendet, um mit Erythroid, Granulozyten, B-Zellen und NK-Zellen zu reagieren. Daher werden diese Zellteilmengen im folgenden Schritt15erschöpft.
    9. Fügen Sie der Zellsuspension 10 ml eiskalten MACS-Puffer hinzu. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
    10. Setzen Sie die Zellpellets im MACS-Puffer mit einer Konzentration von 100 x 106/ml wieder auf. Fügen Sie der Splenozytensuspension Antibiotin-Mikroperlen (0,22 l/106 Zellen) hinzu. Gut mischen und für weitere 15 min bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellsuspension einmal mit 10 ml eiskaltem MACS-Puffer. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
    11. Setzen Sie eine magnetische Trennsäule in das Magnetfeld. Spülen Sie die Spalte mit 3 ml MACS-Puffer. Legen Sie die Zellsuspension auf die Spalte. Sammeln Sie den Durchfluss, der aus ungebundenen, angereicherten T-Zellen besteht, in einem neuen 15 ml konischen Rohr. Waschen Sie die MS-Säule mit 3 ml eiskaltem MACS-Puffer.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spalte leer ist, bevor Sie die Waschschritte ausführen.
    12. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie das Zellpellet in 5 ml MACS-Puffer wieder auf.
    13. Zählen Sie die Zellen in 1% Trypanblau mit einem Hämozytometer. Speichern Sie ein Aliquot von 2 x 106 Zellen für eine Reinheitsprüfung durch Durchflusszytometrie.
      ANMERKUNG: Die durchschnittliche Ausbeute von Milz-T-Zellen, die durch diese Methode isoliert werden, beträgt 20 x 25 x 106 Zellen pro Maus.
    14. Bestätigen Sie die Ausbeute der T-Zell-Anreicherung durch Durchflusszytometrie. Flecken 1 x 106 Zellen, konserviert von den Schritten 1.3.7 (vor der T-Zell-Erschöpfung) und 1.3.13 (TCD-BM nach T-Zell-Erschöpfung), mit den folgenden Antikörpern: -CD3 (17A2), -CD4 (GK1.5) und '-CD8' (53-6.7).
  4. Tag 1: Injektion bestrahlter Mäuse mit Spender-T-Zellen und TCD-BM.
    1. Die TCD-BM- und T-Zellen 2x mit PBS (800 x g für 5 min bei 4 °C) waschen. Setzen Sie die Zellen in eiskaltem PBS zur Injektion aus. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 20 x 106/ml für TCD BM und 4 x 106/ml für T-Zellen ein.
    2. Erhitzen Sie das Tier mit einer Heizlampe, um die Sichtbarkeit der bilateralen Schwanzvenen zu erhöhen. Legen Sie die Maus bei Bedarf in ein Restrainer.
    3. Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes mit 70% Isopropanol. TCD-BM (5 x 106 Zellen/Maus) mit oder ohne T-Zellen (0,75 x 106 Zellen/Maus) injizieren. Achten Sie darauf, keine Luft in die Spritze einzuführen.
    4. Entfernen Sie die Nadel und tragen Sie einen antiseptischen Tupfer direkt auf die Injektionsstelle 5-10 s auf, um jegliche Blutung zu stoppen.
  5. Bewerten Sie GVHD an den Tagen 2 bis 80.
    1. Behalten Sie den Überblick über das Überleben des Tieres. Überwachen Sie die klinischen Anzeichen von GVHD, angepasst an das zuvor von Cook et al.16 festgelegte Bewertungssystem, und das Körpergewicht der Empfängermäuse 2x pro Woche. Verwenden Sie das vor dem TBI ermittelte Körpergewicht, um den Gewichtsverlust des Körpers zu berechnen.
    2. Wägen Sie jede Maus einzeln. Bewerten Sie den Gewichtsverlust wie folgt: Grad 0 = weniger als 10%; Grad 1 = 10 % bis 20 %; Grad 2 = mehr als 20%.
    3. Noten Sie das Haltungszeichen der Empfänger: Grad 0 = keine Ahnung; Grad 0,5 = leichte Ahnung, aber begradigt sich beim Gehen; Grad 1 = Tier bleibt beim Gehen geknickt; Grad 1.5 = Tier richtet sich nicht auf; Klasse 2.0 = Tierständer auf den Hinterzehen.
    4. Notieren Sie das Mobilitätszeichen der Empfänger: Note 0 = sehr aktiv; Grad 0,5 = langsamer als naive Mäuse; Grad 1.0 = bewegt sich nur, wenn er gesackt wird; Grad 1.5 = bewegt sich leicht, wenn er gestochen wird; Grad 2.0 = bewegt sich nicht, wenn er gesackt wird.
    5. Bewerten Sie die Haut der Empfänger: Grad 0 = keine Abschürfungen, Läsionen oder Skalierung; Grad 0,5 = Rötung in einem bestimmten Bereich; Grad 1 = Abrieb in einem Bereich oder leichter Abrieb in zwei Bereichen; Grad 1.5 = schwere Abschürfungen in zwei oder mehr Bereichen; Grad 2.0 = schwere Abschürfungen, rissende Haut, getrocknetes Blut.
    6. Noten Sie das Fell der Empfänger: Note 0 = keine abnormalen Anzeichen; Grad 0,5 = Auffahren an der Bauch- oder Nackenseite, Grad 1,0 = Über- oder Bauch- und Nackenseite; Grad 1.5 = ungepflegtes und gerafftes Fell; Grad 2.0 = schlecht verfilztes Fell auf Bauch und Rücken.
    7. Score den Durchfall der Empfänger: Grad 0 = kein Durchfall; Grad 0,5 = leichter und weicher Stuhl; Grad 1.0 = mild (gelber Stuhl); Grad 1.5 = mäßig (gelber Stuhl mit etwas Blut); Grad 2 = schwer (hellgelber und blutiger Stuhl, "getrocknete Kuchenhocker" erscheinen im Analbereich).

2. Cotransplantationsmodell

  1. Generieren Sie knochenmarkabgeleitete dendritische Zellen (BM-DCs).
    1. Isolieren Sie Knochenmark von den Oberschenkelknochen und Tibias von WT oder Faktor B (fB)-/- Mäuse auf dem B6-Hintergrund, wie in den Schritten 1.2.3-1.2.4 beschrieben. Drehen Sie die Zellen bei 800 x g für 5 min.
    2. Setzen Sie das Pellet in 5 ml ACK-Lysingpuffer für die Rote Blutkörperchenlyse aus. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 5 min auf Eis. Fügen Sie 10 ml 1% RPMI in die Zellsuspension ein, um die Lyse und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zu stoppen. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Die Zellpellets in 10 ml Kulturmedien (RPMI 1460 mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2 mM l-Glutamin und 50 mM-Mercaptoethanol) wieder aufsetzen und das Volumen so einstellen, dass es die Endkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml erfüllt.
    4. Fügen Sie der Zellsuspension 20 ng/ml Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) hinzu. Die Knochenmarkzellen in 100 x 15 mm Petrischalen bei 37 °C in 5%CO2 für 6 Tage kulturieren.
    5. Ersetzen Sie die Hälfte der laufenden Kulturmedien (ca. 5 ml) durch frische Medien, die 40 ng/ml GM-CSF am 3. Tag enthalten.
    6. Die Kulturmedien im Wasserbad bei 37 °C vorwärmen. Sammeln Sie ca. 5 ml der Medien aus den Knochenmarkkultur-Gerichte. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 5 ml Kulturmedien mit 40 ng/ml GM-CSF aus.
    7. Fügen Sie am 6. Tag der Kultur 25 g/ml Lipopolysaccharid (LPS) in die Medien ein, um die BM-DCs zu reifen. Speichern Sie ein Aliquot von 2 x 106 Zellen, um die Wirksamkeit der DC-Differenzierung durch Durchflusszytometrie zu bestimmen.
    8. Sammeln Sie gereifte BM-DCs: Verwenden Sie Zellheber, um DCs aus den Petri-Schalen weich zu kratzen. Sammeln Sie alle Zellsuspensionen in 50 ml konischen Röhren. Zentrifuge bei 800 x g, für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellpellets 3x mit 50 ml eiskaltem PBS. Sparen Sie etwa 2 x 106 BM-DCs für die immunologische Phänotypanalyse durch Durchflusszytometrie.
  2. Führen Sie diedritische Zell-Co-Transplantation von BMT (DC-cotransplantierende BMT) durch.
    HINWEIS: Verwenden Sie FVB -Mäuse (H2kq) als Spender für T-Zellen und BM-Zellen. Bestrahlung von B6 Ly5.1-Empfängermäusen in einer Dosis von 1.100 cGy (2 Dosen, 3 h Intervall). Weitere Informationen finden Sie in Schritt 1.1.
    1. Isolieren Sie BM von Oberschenkelknochen und Tibias der FVB-Spendermäuse. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 1.2.3 bis 1.2.10.
      HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Modell das gesamte isolierte Knochenmark anstelle von TCD-BM.
    2. Reinigen Sie T-Zellen aus den Milz- und Lymphknoten der FVB-Spendermäuse. Details finden Sie in den Schritten 1.3.1-1.3.13.
    3. INjizieren Sie BM (5 x 106/Maus), T-Zellen (0,5 x 106/Maus) mit BM-DCs (2 x 106/Maus) am Tag 0 des Experimentellen Kurses.
    4. Am 3. Tag nach der Transplantation wird die Rekonstitution der Spender-GLEICHstrom-Rekonstitution durch Durchflusszytometrie untersucht.
      1. Sammeln Sie Blut aus den Augen der Empfänger.
      2. Anästhetisieren Sie die CD45.1/Ly5.1 B6 Mäuse um 3% Isofluran-Inhalation. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf eine Zehenklemme.
      3. Legen Sie ein steriles Glaspipettenrohr in die mediale Canthus des Auges, das kauarisch in einem 30-45°-Winkel von der Nasenebene gerichtet ist. Drücken Sie beim sanften Drehen des Rohres.
      4. Lassen Sie das Blut in eine 10 L Heparin-haltige n-A-Haltigen sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen. Übertragen Sie 50 l Blut in 5 ml Glasdurchflussröhren.
      5. Fügen Sie 2 ml ACK-Lysing-Puffer hinzu. Bei 37 °C im Wasserbad für 45 min inkubieren. 2 ml FACS-Färbepuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
      6. Setzen Sie die Zellpellets mit 200 L FACS-Puffer mit geeigneten Strömungsfärbungsantikörpern (Live/Death Yellow, '-H-2Kb, '-CD45.1, '-CD45.2, '-CD11c, und '-MHCII' wieder auf. 15 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. 2x mit 1 ml FACS Puffer waschen. Setzen Sie die Zellpellets in 200 L FACS-Puffer wieder auf und führen Sie die Analyse mittels Durchflusszytometrie durch.

3. GVHD/GVL Modelle von BMT

  1. Führen Sie die GVHD/GVL-Induktion durch.
    1. Kultur die Luziferase transduzierte A20 B Zelllymphom in RPMI Kulturmedien.
    2. Bestrahlung BALB/c Hintergrund WT oder Ly5.1 Empfänger bei 700 cGy (Einzeldosis). Weitere Informationen finden Sie in Schritt 1.1.
    3. Isolieren Sie TCD-BM von den Oberschenkelknochen und Tibias von B6. Ly5.1 Spendermäuse. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 1.2.1-1.2.10.
    4. Reinigen Sie T-Zellen von Milz und Lymphknoten der C57BL/6 Spendermäuse. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 1.3.1-1.3.15.
    5. Waschen Sie das A20-Lymphom 2x mit 25 ml PBS. Setzen Sie die Zellpellets in 10 ml eiskaltem PBS wieder auf. Nehmen Sie eine Zellsuspension aliquot (10 l) und zählen Sie die Zellen mit 1% Trypan blau und einem Hämozytometer. Passen Sie die Zellkonzentration auf 20.000 Zellen/ml an.
    6. Injizieren Sie TCD-BM (5 x 106/Maus) mit oder ohne T-Zellen (0,75 x 106/Maus) und A20-Lymphom (5.000 Zellen/Maus).
    7. Follow-up auf den Empfänger Überleben, GVHD klinische Symptome, und Körpergewichtsverlust während des experimentellen Kurses. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 1.5.
  2. Führen Sie biolumineszierende Bildgebung durch.
    1. Überwachen Sie das Tumorwachstum beim transplantierten Empfänger, indem Sie die Empfängermäuse mit 4 mg D-Luciferin injizieren. Inkubieren Sie für 5 min, um sicherzustellen, dass Luziferin mit Luziferase reagiert.
    2. Anästhetisieren Sie die Maus mit 3% Isofluran in der Kammer eines Biolumineszenz-Imagers und Bild der Empfänger für 5 min im Feld D und die Belichtungszeit von 1 min.
    3. Analysieren Sie Daten mit bildanalysierender Software. Ändern Sie die Skalierung der Pseudofarbbilder, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
      HINWEIS: Alle Bilder müssen experimenteübergreifend im gleichen Maßstab sein.
    4. Verwenden Sie die Bildanalyse-Software, um die Interessengebiete zu bestimmen und die Signaldichte zu quantifizieren, indem Sie den Fluss (Photonen/s) berechnen, der aus jeder Interessenregion emittiert wird.

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Representative Results

Das große MHC-Mismatched-B6-Modell (H2kb)-BALB/C (H2kd) entsprach eng der GVHD-Entwicklung nach der Transplantation (Abbildung 2). Alle sechs zuvor von Cooke et al.16 festgestellten GVHD-Symptome traten bei den mit WT-B6-T-Zellen transplantierten Empfängern auf, nicht jedoch bei den Empfängern, die mit BM allein transplantiert wurden (Schritt 1.5), die die GVHD-negative Gruppe darstellten. In diesem Modell gibt es zwei Phasen in der GVHD-Entwicklung. Erstens liegt der Höhepunkt der Schwere etwa 11 Tage nach der Transplantation, gefolgt von einer Verringerung der klinischen Werte und der Körpergewichtsregeneration bis zu 16 Tagen. In dieser Phase treiben mehrere Mechanismen wie bestrahlungsinduzierte Entzündungen und Transplantationssyndrom die Krankheit Pathogenität und GVHD an. Die Empfänger erliegen dem GVHD etwa 30 bis 40 Tage nach der Transplantation.

Mindestens 85 % der BM unterschieden sich in DCs (Abbildung 3A). Interessanterweise verbesserte die Transplantation mit fB-/- DCs das Überleben des Empfängers und den klinischen Wert von GVHD (Abbildung 3B,C). Angesichts der Tatsache, dass fB-/- DCs weniger Antigen-Präsentationskapazität haben, die durch niedrigere MHCII-Expression und reduzierte kostimulierende Rezeptorexpression17nachgewiesen werden, kann das Co-Transplantationsprotokoll ausreichen, um verschiedene Signalisierungen oder Ziele in Empfänger-DCs in der GVHD-Entwicklung nach BMT zu untersuchen.

Die T-Zellreinheit betrug 90% nach der Anreicherung (Abbildung 4A). Luziferase-transduced A20 B Zelllymphom ermöglicht die Überwachung des Tumorwachstums bei lebenden Tieren (Abbildung 4B). In diesem Modell, wenn die Empfänger ohne Signal und eine hohe GVHD klinische Punktzahl starben, wurde festgestellt, dass sie an GVHD starben. Alle WT BALB/c-Empfänger, die ALLEIN BM plus A20 erhielten, starben an einem Tumorrückfall (Abbildung 3B). Im Gegensatz dazu, wenn das Tier an höherer Signaldichte starb, wurde festgestellt, dass es an einem Tumorrückfall starb. Wie in Abbildung 3Bgezeigt, starben WT BALB/c-Empfänger, die mit BM- und T-Zellen von ACC1fl/fl B6-Spender (ACC1+/+ T-Zellen) transplantiert wurden, an GVHD. Wenn Tiere mit Krankheitssignalen starben, wurde der Schluss gezogen, dass sie an GVHD und Tumorrückfall starben. Die Tiere, die BM- und T-Zellen vom ACC1fl/fl x CD4 cre B6 Spender (ACC1-/- T-Zellen) erhielten, starben sowohl an GVHD als auch an Tumorrückfällen (Abbildung 3B). Tiere können wieder in den Käfig gelegt werden, um zu einem späteren Zeitpunkt abgebildet oder für ex vivo-Bildgebung eingeschläfert zu werden. Mit der Software kann die Tumormasse im Tier auch einzeln analysiert werden (Abbildung 3B).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der BMT-Prozedur. (A) Schema für MHC-nicht übereinstimmendes B6-BALB/c BMT-Modell. (B) Schema für die Gleichstrom-Ko-Transplantation des FVB-B6-Modells. (C) Schema für das Modell B6-BALB/c GVHD/GVL. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Hauptmodell MHC-nicht übereinstimmendes B6-BALB/c GVHD. BALB/c-Mäuse wurden tödlich bestrahlt und mit 5 x 106 BM allein oder mit 0,75 x 106 T-Zellen transplantiert. (A) Überlebensdaten, (B) Körpergewichtsverlust und (C) klinische Score-Daten der Empfänger von BM allein oder mit T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: DC-Co-Transplantation HCT-Modell. BM wurde von WT- undfB-/- B6-Mäusen isoliert und durch Kultivierung mit GM-CSF in DCs differenziert. (A) Die Reinheit der DCs wurde durch Durchflusszytometrie durch Färbung mit CD11c und MHCII untersucht. Tödlich bestrahlte B6-Empfänger wurden von den FVB-Spendern mit BM (3 x 106/Maus) plus gereinigten T-Zellen (1 x 106/Maus) transplantiert. Die Empfänger erhielten auch 2 x 106 WT oder fB-/- B6 BM-DCs Zellen am Tag der Transplantation. Das Überleben (B) und der klinische Score (C) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Major-MHC nicht übereinstimmendes B6-BALB/c GVHD/GVL-Modell. WT BALB/c-Empfänger wurden mit TCD-BM (5 x 106/Maus) allein oder mit ACC1+/+ T-Zellen oder ACC1+/+ T-Zellen (1 x 106/Maus) transplantiert, die von B6-Hintergrundspendermäusen isoliert wurden. Darüber hinaus erhielten die Empfänger zum Zeitpunkt der Transplantation 2 x 103 A20-luc. Die T-Zell-Reinheit wurde durch Durchflusszytometrie durch Färbung mit Live-/Todesgelb-, CD3-, CD4- und CD8-Flow-Antikörpern (A) untersucht. Die Empfänger wurden auf das Tumorwachstum überwacht, das durch die Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) (B) bestimmt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Verwendung von Stammzellen für eine bestimmte Person ist ein effektiver Ansatz zur Behandlung von fortgeschrittenen und resistenten Krebsarten18. Kleine Molekülpharmazeutika sind jedoch seit langem ein Hauptfokus der personalisierten Krebstherapie. Andererseits kann in der Zelltherapie eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Spender und Wirt die Behandlungsergebnisse entscheidend beeinflussen, wie z.B. die Entwicklung von GVHD nach BMT1.

Wichtige MHC-unübertroffene Mausmodelle von BMT sind ein wertvolles Werkzeug, um die Biologie von GVHD zu verstehen und die Wirksamkeit von Medikamenten in seiner Behandlung zu testen. Unter ihnen sind C57BL/6 (H2b) zu BALB/c (H2d) und FVB (H2q)-C57BL/6 (H2b) etablierte Modelle5,7. Diese Modelle enthalten entweder myeloablative Strahlungskonditionierung als Einzeldosis (BALB/c) oder eine fraktionierte Dosis (C57BL/6), in der 3–8 Stunden Intervalle erforderlich sind, um die Darmtoxizität zu verringern5. Beide Modelle sind sowohl von CD8+ als auch von CD4+ T-Zellen abhängig. In diesen Modellen sind GVHD Schweregrad und Überleben die wichtigsten gemessenen Ergebnisse, und der transplantierte Empfänger hat eine konsistente schnelle Kinetik und 100% Penetranz. Um die T-Zell-Migration und -Expansion zu überwachen, sollten T-Zellen von luziferase-transduced Spendermäusen für die In-vivobiolumineszenz-Bildgebung19verwendet werden. Während jedoch 90 % der durchgeführten BMT MHC-matched sind, ähnelt das B6-BALB/c-Modell nicht perfekt der klinischen Situation. Die Entdeckung des MHC und der kleineren Histokompatibilitätsantigene (miHAs) hat wesentlich dazu beigetragen, das Feld von BMT10voranzubringen. Kleinere MHC-unpassende GVHD-Mausmodelle imitieren patienten GVHD20genauer. Konditionierungsintensität, um Spenderzelltransplantation zu induzieren verursacht Gewebeschäden und kann das GVHD-Ergebnis beeinflussen21. Konditionierungsschemata in murinen Modellen beinhalten oft TBI im Gegensatz zur Chemotherapie in klinischen Umgebungen22,23. Daher wurde ein immunsuppressives Chemotherapie-Modell verwendet, um eine reduzierte bedingte Intensität in Kliniken nachzuahmen. Das Mausmodell war C57BL/6 (H2b) zu BALB/c (H2d) und transplantierte Empfänger entwickelten klinische und histologische Symptome im Zusammenhang mit GVHD24.

Der potenzielle Vorteil des kotransplantierten Protokolls besteht darin, die Rolle der Empfänger-DCs zu testen, ohne speziell von CD11c-Mäusen abhängig zu sein. Da die BM-DC-Generation ex vivo durchgeführt wurde, kann dieses Protokoll auch angewendet werden, um die Rolle anderer Zelltypen wie Makrophagen oder Neutrophilen in GVHD einfach durch Ändern der Kulturbedingungen zu testen. Die Verwendung von CD45.1+ B6-Mäusen als Empfänger ermöglicht es Forschern, BM-DCs (CD45.2+ CD11c+) von Empfänger-DCs (CD45.1+ CD11c+) durch Strömungsanalyse zu unterscheiden. Die flexible Anzahl der zellen, die ex vivo erzeugt und in die transplantierten Empfänger übernommen werden, ist ein weiterer Vorteil des Co-Transplantationsprotokolls. Darüber hinaus ermöglicht es uns die Ex-vivo-Kultur, die potenziellen Medikamente zur Kontrolle von GVHD zu untersuchen.

Die Fähigkeit, Tumormuster in vivo zu verfolgen, ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Potenzial hat zu testen, ob ein Medikament die GVL-Aktivität beeinflussen kann. Mit diesem GVHD/GVL-Modell können Tumorprogression und Metastasen bei lebenden Tieren überwacht werden16. Darüber hinaus kann diese Einstellung verwendet werden, um den GVL-Effekt bei mehreren Krebsarten zu testen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Studie wird unterstützt durch das Start-up-Stipendium des University of Central Florida College of Medicine (an HN), das Start-up-Stipendium des University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center (an HL), das United States NIH Grant #1P20CA210300-01 und das vietnamesische Gesundheitsministerium Grant #4694/QD-BYT (zu PTH). Wir danken Dr. Xue-zhong Yu von der Medical University of South Carolina für die Bereitstellung von Materialien für die Studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 157 hämatopoetische Stammzelltransplantation Knochenmarktransplantation Transplantat-versus-Host-Krankheit Transplantat-versus-Leukämie dendritische Zellen dendritische Zell-Kotransplantation
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Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

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