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Immunology and Infection

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

Abstract

동종 골수 이식 (BMT)은 종양을 근절하기 위한 이식편 대 백혈병 (GVL) 효과로 인한 혈액학적 악성 종양에 대한 효과적인 치료법입니다. 그러나, 그것의 응용은 BMT의 중요한 합병증인 이식편 대 호스트 질병 (GVHD)의 발달에 의해 제한됩니다. GVHD는 기증자 이식편에서 T 세포가 수용자 세포에 의해 발현된 alloantigen을 인식하고 수령인 건강한 조직에 대하여 원치 않는 면역학적 공격을 탑재할 때 불러오릅니다. 따라서, 전통적인 치료는 기증자 T 세포 동호성을 억제하도록 설계되었습니다. 그러나, 이러한 접근법은 수신자의 생존이 개선되지 않도록 GVL 효과를 실질적으로 손상시다. 따라서 BMT, GVL 및 GVHD에 대한 치료 접근법의 효과를 이해하는 것이 필수적입니다. 공여자 T 세포를 자극하는 항원 제시 및 사이토카인 분비 용량으로 인해, 수용자 수지상 세포(DC)는 GVHD의 유도에 중요한 역할을 한다. 따라서 받는 DC를 대상으로 하는 것은 GVHD를 제어하기 위한 잠재적인 접근 방식이 됩니다. 이 작품은 호스트 DC가 이식 후 GVH 및 GVL 응답을 조절하는 방법을 조사하는 새로운 BMT 플랫폼에 대한 설명을 제공합니다. 또한 이식 후 GVHD 및 GVL의 생물학을 연구하는 효과적인 BMT 모델이다.

Introduction

동종 조혈 줄기 세포 이식(BMT)은 이식편 대 백혈병(GVL)효과를,통해 혈액학적 악성종양을치료하는 효과적인 치료법3. 그러나, 기증자 림프톨은 항상 수용자 조직에 대하여 원치 않는 면역학 공격을 거치고, 이식편 대 호스트 질병에게 불린 프로세스 (GVHD)4.

GVHD의 뮤린 모델은 GVHD와 GVL응답5의생물학을 연구하는 효과적인 도구입니다. 마우스는 비용 효율적인 연구 동물 모델입니다. 그들은 작고 효율적으로 개발6의초기 단계에서 분자와 생물학적 제제로 dosed. 마우스는 생물학적 경로 및 메커니즘을 연구하는 데 이상적인 유전적 조작 연구를 위한 이상적인 연구 동물이며, 이는 생물학적 경로 및 메커니즘을 연구하는 데 이상적입니다6. 여러 마우스 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) GVHD의 MHC 불일치 모델은 잘 설립되었습니다, 이러한 BALB / c에 (H2b)및 FVB (H2 q)와 FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)b5,,7. 이들은 GVHD에 영향을 미치는 개별적인 세포 모형, 유전자 및 요인의 역할을 결정하기 위하여 특히 귀중한 모형입니다. C57/BL/6 (H2b)MHC I (B6.C-H2bm1)및/또는 MHC II (B6.C-H2bm12)에서돌연변이를 가진 수령인에게 부모 기증자로부터의 이식은 MHC 클래스 I 및 클래스 II 모두에서 불일치가 급성 GVHD의 발달을 위한 중요한 요구 사항임을 밝혔다. 이는CD4+ 및 CD8+ T 세포가 질병발달7,,8에모두 필요하다는 것을 시사한다. GVHD는 또한 '프로 염증성 사이토카인 폭풍'으로 알려진 염증성 캐스케이드에관여9. 뮤린 모델에서 가장 일반적인 컨디셔닝 방법은 X 선 또는 137Cs에 의한 총 체조사(TBI)입니다. 이것은 수령인의 골수 절제로 이끌어 내고, 기증자 줄기 세포 생착을 허용하고 이식의 거부를 방지합니다. 이것은 공여자 세포에 응하여 수용자 T 세포의 증식을 제한해서 행해진다. 추가적으로, 유전 불균형은 또한 경미한 MHC 불일치10에달려 있는 질병 유도에 있는 중요한 역할을 합니다. 따라서, 골수성 조사 량은 상이한 마우스 균주(예를 들어, BALB/c→C57BL/6)에서 다양하다.

숙주 항원 제시 세포(APC)에 의한 공여자 T 세포의 활성화는 GVHD 발달에 필수적이다. APC 중 수지상 세포 (DC)가 가장 강력합니다. 그(것)들은 그들의 우수한 항원 장악, T 세포 공동 자극 분자의 표현 및 병원성 부세트로 T 세포를 편광하는 pro-염증성 사이토카인의 생산 때문에 GVHD를 유도할 수 승계할 수 있습니다. 수용자 DC는 이식 후 T 세포 프라이밍 및 GVHD 유도를 촉진하는 데 매우 중요합니다11,,12. 따라서, DC는 GVHD12의치료에 흥미로운 표적이되고있다.

TBI는 공여자 세포 생착을 향상시키기 위해 요구된다. TBI 효과로 인해, 수용자 DC는 이식 후 짧은 시간 동안 활성화되고생존(12). 생물 발광 또는 형광의 사용이 크게 발전했음에도 불구하고 GVHD에서 받는 DC의 역할을 연구하는 효과적인 모델을 수립하는 것은 여전히 어려운 일입니다.

공여자 T세포는 GVL 활성의 원동력이기 때문에, 스테로이드와 같은 면역억제제를 이용한 치료 전략은 종종 종양 재발 또는 감염을 유발한다13. 따라서, 대상자 DC를 타겟팅하는 것은 GVL 효과를 보존하고 감염을 피하면서 GVHD를 치료하는 다른 접근법을 제공할 수 있다.

간단히 말해서, 현재 연구는 수신자 DC에서 신호의 다른 유형이 BMT 후 GVHD 개발 및 GVL 효과를 조절하는 방법을 이해하는 플랫폼을 제공합니다.

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Protocol

실험 절차는 중앙 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. GVHD 유도

참고: 동종 골수 (BM) 세포 이식 (단계 1.2) 조사 후 24 시간 이내에 수행된다. 아래에 설명된 모든 절차는 멸균 환경에서 수행됩니다. 조직 배양 후드에서 절차를 수행하고 여과 된 시약을 사용하십시오.

  1. 일 0: 받는 마우스를 준비합니다.
    1. BALB/c 배경(CD45.2+ H2kd+)에암컷 야생형(WT) 마우스를 사용하십시오.
    2. 귀 태그를 지정하고 TBI 전에 받는 사람을 계량합니다. 이어서, 조사 챔버에 최대 11개의 마우스를 놓고 조사기에서 보관한다. 10-15 분 동안 700 cGy의 단일 용량으로 조사하십시오.
    3. 조사된 동물을 케이지로 돌려보내 이식 전에 병원균이 없는 시설에 보관하십시오.
      참고 : 수령인의 최소 체중은 약 20 g이어야합니다. 실험 기간 동안 체중 감소를 계산하기 위해 이 무게를 참조로 사용합니다.
  2. 일 1: 기증자 마우스에서 T 세포 고갈 된 골수 (TCD-BM)를 준비합니다.
    1. CO2 질식에 의해 CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 마우스를 안락사시키고 의식이 없어질 때까지 2-3분 동안 기다립니다. 필요한 경우 보조 안락사로 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
    2. 깨끗한 작업 보드에 각 마우스를 넣어. 70 % 이소 프로판놀로 모피와 피부를 소독하십시오.
    3. 집게와 가위를 사용하여 두 다리에서 경골과 대퇴골을 수집합니다. 50 mL 원추형 튜브에 1% FCS 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 과 2 mML-글루타민(1% RPMI)을 함유한 얼음 차가운 RPMI에 넣습니다. 집게와 가위를 사용하여 모든 근육 조직을 제거하여 대퇴골과 경골 뼈를 철저히 청소하십시오. 대퇴골과 경골을 50 mL 원엽 튜브로부터 1% RPMI를 함유하는 92 mm 직경의 페트리 접시로 옮김.
    4. 가위를 사용하여 대퇴골이나 경골의 끝을 잘라냅니다. 1% RPMI 1640 배지의 25 mL로 50 mL 튜브를 채웁니다. 26G 바늘에 부착된 3 mL 주사기를 1% RPMI의 3 mL로 채우는 데 사용합니다. 이 주사기를 뼈에 삽입하고 플런저를 밀어 캐비티에서 1 % RPMI (~3 mL / 뼈)로 수집 튜브로 흘러 내십시오.
    5. 다른 공여마우스로부터 남은 경골 및 대퇴골 뼈에 대해 1.2.4단계를 반복한다. 얼음에 모든 수집 튜브를 유지합니다.
    6. 75 μm 메쉬 세포 스트레이너를 통해 골수 조각을 플러시하여 단일 세포 현탁액을 확인합니다. 50 mL 튜브에서 단일 셀 현탁액을 수집합니다.
    7. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g의 원심 분리튜브. 상급자 인해 및 폐기. 20 x 106 세포/mL에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS 완충액에서 펠릿을 다시 중단시다. 순도 염색을 위해 2 x 106 셀의 별칭을 저장하십시오.
    8. 0.05 μg/106 세포14에서 Thy 1 항체를 넣고 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 25 mL 얼음 차가운 PBS로 한 번 씻으하십시오. 0.5% BSA/10% 젊은 토끼 보수/2% DNase (멸균 H2O에서 10,000 U/mL)에서 20 x 10 6/mL에서 다시 일시 중단하십시오.6 37°C에서 45분 동안 배양하고 이전과 같이 2회 세척합니다.
      참고: T 세포는 모든 T 세포에 의해 발현되는 단백질인 Thy1에 대한 mAb 를 사용하여 고갈되지만 다른 백혈구는 그렇지 않습니다.
    9. 0.5% BSA를 포함하는 PBS 버퍼의 20 mL에서 세포를 다시 중단한다. 혈세포계를 사용하여 1 % 아세트산에서 골수 세포를 계산합니다. 세포 정제 후 유세포측정에 의한 순도 검사를 위해 2 x 106 세포의 별칭을 유지한다.
      참고: 한 기증자 마우스는 일반적으로 약 25 x 106 TCD-BM을 생성합니다.
    10. 유세포 분석기를 사용하여 성공적인 T 세포 고갈을 확인합니다. 스테인 1 x 106 세포, 단계 1.2.7에서 보존 (T 세포 고갈 전) 및 1.2.9 (T 세포 고갈 후 TCD-BM) 다음과 같은 항체와 함께: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7).
  3. 1일차: 기증자 마우스로부터 T 세포 준비
    1. CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 야생 형 (WT) 마우스를 T 세포에 대한 기증자로 사용하십시오.
    2. 1.2.1에 기재된 바와 같이 C57BL/6 마우스를이산화탄소(CO2)에의한 질식.
    3. 70% 에탄올로 마우스의 털과 피부를 깨끗하게 청소합니다. 비장과 림프절을 절제하고 주사기 플런저 및 40 μm 메쉬 스트레이너를 사용하여 비장 세포의 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 모든 비장 세포들을 수집하기 위해 1% RPMI(RPMI 를 함유하는 1% FBS)로 스트레이너와 주사기 플런저를 세척합니다.
    4. 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 세포 현탁액을 원심분리기. 상급을 폐기한 후 ACK 라싱 버퍼 5 mL(1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3,144 mM NH4Cl, pH 7.2)를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 세포 현탁액을 배양하십시오.
      참고: ACK 용해 버퍼는 적혈구를 용해하는 데 사용됩니다.
    5. 1% RPMI의 5 mL를 추가하여 라시스를 중지합니다. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g의 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.
    6. 얼음-차가운 자기 활성화 세포 선별(MACS) 버퍼(0.5% BSA, PBS에서 2mMEDTA, pH 7.2)를 준비한다. 사용하기 전에 버퍼를 탈기합니다. MACS 버퍼의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
    7. 비장 세포를 계산하고 혈전계와 1 % trypan 파란색을 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 확인합니다. 2 x 106 셀의 aliquot를 저장하여 유세포 분석으로 정제 수율을 평가합니다.
    8. MACS 버퍼에서 200 x 106/mL의 농도로 비장을 다시 일시 중단합니다. 0.03 μL의 비오틴 항 마우스-Ter-119, 0.03 μL의 비오틴 항 마우스-CD11b, 0.03 μL의 비오틴 항 마우스-CD45R, 그리고10개의 6개의 세포당 0.03 μL의 비오틴 항 마우스-DX5를 추가합니다. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
      참고: 비오틴 항마우스-테르-119, 비오틴 항마우스-CD11b, 비오틴 항마우스-CD45R, 및 비오틴 항마우스-DX5는 각각 에리스로이드, 과립구, B세포 및 NK 세포와 반응하기 위해 사용되었다. 따라서 이러한 셀 하위 집합은 다음 단계15에서고갈됩니다.
    9. 10 mL의 얼음 차가운 MACS 버퍼를 셀 서스펜션에 추가합니다. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g의 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.
    10. 100 x 106/mL의 농도로 MACS 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 비장 현탁액에 항 비오틴 마이크로비드(0.22 μL/106 세포)를 추가합니다. 잘 섞고 4 °C에서 추가로 15 분 동안 배양하십시오. 10 mL의 얼음 차가운 MACS 버퍼로 셀 서스펜션을 한 번 씻으하십시오. 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 폐기하고 상급체를 버린다.
    11. 자기장에 자기 분리 컬럼을 넣습니다. MACS 버퍼의 3mL로 열을 헹급합니다. 셀 서스펜션을 열에 놓습니다. 새로운 15 mL 원엽 튜브에서 언바운드, 농축 된 T 세포로 구성된 흐름을 수집합니다. 3 mL의 얼음 차가운 MACS 버퍼로 MS 컬럼을 씻으하십시오.
      참고: 세탁 단계를 수행하기 전에 열이 비어 있는지 확인합니다.
    12. 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 세포 현탁액을 원심분리기. MACS 버퍼의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
    13. 혈세포계를 사용하여 1 % 트라이 판 블루에서 세포를 계산합니다. 유세포측정에 의한 순도 검사를 위해 2 x 106 셀의 별칭을 저장합니다.
      참고 : 이 방법에 의해 분리 된 비장 T 세포의 평균 수율은 마우스 당 ~ 20-25 x 106 셀입니다.
    14. 유세포측정에 의한 T세포 농축의 수율을 확인한다. 스테인 1 x 106 세포, 단계 1.3.7에서 보존 (T 세포 고갈 전) 및 1.3.13 (T 세포 고갈 후 TCD-BM), 다음과 같은 항체와 함께: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7).
  4. 일 1: 기증자 T 세포와 TCD-BM조사 된 마우스를 주입.
    1. TCD-BM 및 T 세포를 PBS로 2x 세척합니다(4°C에서 5분 동안 800 x g). 주입을 위해 얼음 차가운 PBS에 있는 세포를 다시 중단하십시오. TCD BM의 경우 셀6농도를 20 x 10 6/mL로 조정하고 T 세포의 경우 4 x 10 6/mL로 조정합니다.6
    2. 가열 램프를 사용하여 동물을 가열하여 양측 꼬리 정맥의 가시성을 높입니다. 필요한 경우 마우스를 구속기 안에 놓습니다.
    3. 70% 이소프로판올을 사용하여 꼬리 표면을 청소합니다. TCD-BM(5 x 106 셀/마우스)을 T 세포 유무에 관계없이 주입합니다(0.75 x 106 셀/마우스). 주사기에 공기를 유입시키지 않도록 주의하십시오.
    4. 바늘을 제거하고 출혈을 막기 위해 주사 부위 5-10s에 직접 살균 면봉을 적용하십시오.
  5. 2-80일에 GVHD를 평가합니다.
    1. 동물의 생존을 추적합니다. 쿡(Cook)16에 의해 이전에 확립된 채점 시스템에서 적응된 GVHD의 임상 적 징후를 모니터링하고 수용인마우스의 체중을 주당 2회 모니터링한다. TBI 이전에 결정된 체중을 사용하여 체중 감소를 계산합니다.
    2. 각 마우스의 무게를 개별적으로 측정합니다. 다음과 같이 체중 감량 점수: 학년 0 = 미만 10%; 학년 1 = 10 %-20 %; 2 학년 = 20 % 이상.
    3. 받는 사람의 자세 기호 점수: 학년 0 = 아니 직감; 학년 0.5 = 약간의 직감하지만 걸을 때 곧게; 학년 1 = 동물이 걸을 때 구부러진 상태로 유지됩니다. 학년 1.5 = 동물이 똑바르지 않습니다. 학년 2.0 = 뒷발가락에 동물 스탠드.
    4. 받는 사람의 이동성 기호 점수: 학년 0 = 매우 활성; 학년 0.5 = 순진한 마우스보다 느린; 학년 1.0 = 찌를 때만 이동; 학년 1.5 = 찌를 때 약간 이동; 2.0 등급 = 찌를 때 움직이지 않습니다.
    5. 받는 사람의 피부 점수: 학년 0 = 아니 찰과상, 병변, 또는 스케일링; 학년 0.5 = 한 특정 영역에서 발적; 학년 1 = 한 영역에서 마모 또는 두 영역에서 가벼운 마모; 학년 1.5 = 두 개 이상의 영역에서 심각한 찰과상; 학년 2.0 = 심한 찰과상, 피부 균열, 말린 혈액.
    6. 받는 사람의 모피 점수 : 학년 0 = 아니 비정상적인 징후; 학년 0.5 = 목의 배 또는 목덜미의 측면에 ridging, 학년 1.0 = 배와 목의 측면을 가로 질러 ridging; 학년 1.5 = unkempt 매트 및 주름 모피; 학년 2.0 = 배와 뒷면에 심하게 매트 모피.
    7. 받는 사람의 설사 점수: 학년 0 = 아니 설사; 학년 0.5 = 경미하고 부드러운 대변; 학년 1.0 = 온화한 (노란색 대변); 학년 1.5 = 중간 (약간의 혈액을 가진 노란색 대변); 학년 2 = 심한 (밝은 노란색과 피 묻은 대변, "말린 케이크 발판"이 항문 부위에 나타납니다).

2. 공동 이식 모델

  1. 골수 유래 수지상 세포 (BM-DC)를 생성합니다.
    1. WT 또는 인자 B(fB)의 대퇴골 및 경골으로부터-/- 골수를 분리하는 단계 1.2.3-1.2.4에 기재된 바와 같이 B6 배경상에서 마우스. 세포를 800 x g에서 5 분 동안 돌이꿉지 모릅니다.
    2. 적혈구 용해를 위한 ACK 용해 완충제의 5 mL에 있는 펠릿을 다시 중단하십시오. 얼음에 5 분 동안 세포 현탁액을 배양. 세포 현탁액에 10 mL의 10 mL을 추가하여 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 용해 및 원심 분리기를 중지합니다. 상급제는 버리십시오.
    3. 배양 배지의 10 mL에서 세포 펠릿을 재중단하고(RPMI 1460 함유 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신의 100 U/mL, 2 mM l-글루타민 및 50 mM β-메르카페탄올)을 2 x 106 세포/mL의 최종 농도에 맞게 부피를 조절한다.
    4. 세포 현탁액에 20 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 추가합니다. 골수 세포를 100 x 15 mm 페트리 접시에서 37°C에서 5%CO2에서 6일 동안 배양하였다.
    5. 진행 중인 배양 배지(약 5mL)의 절반을 3일째에 40 ng/mL GM-CSF가 포함된 신선한 미디어로 교체하십시오.
    6. 배양 배지를 37°C의 수조에서 예온한다. 골수 배양 요리로부터 약 5 mL의 미디어를 수집합니다. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g의 원심 분리기. 상급제는 버리십시오. 40 ng/mL GM-CSF를 함유하는 5 mL 배양 배지에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
    7. BM-DC를 성숙시키기 위해 배양 6일째에 배지에 25 μg/mL 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가하였다.6
    8. 성숙한 BM-DC 수집: 셀 리프터를 사용하여 페트리 접시에서 DC를 부드럽게 긁어냅니다. 50 mL 원엽 튜브에 있는 모든 세포 현탁액을 수집합니다. 800 x g의원심 분리기, 4 °C에서 5 분 동안. 상급제는 버리십시오. 50 mL의 얼음 차가운 PBS로 세포 펠릿을 3 x 씻습니다. 유세포 분석에 의한 면역 표현형 분석을 위해 약 2 x 106 BM-DC를 저장합니다.
  2. BMT (DC 공동 이식 BMT)의 수지상 세포 공동 이식을 수행합니다.
    참고: FVB (H2kq)마우스를 T 세포 및 BM 세포에 대한 공여자로 사용하십시오. 조사 B6 Ly5.1 수용자 마우스의 복용량에 1,100 cGy (2 복용량, 3 h 간격). 1.1단계의 세부 정보를 참조하십시오.
    1. FVB 공여자 마우스의 대퇴골 및 경혈으로부터 BM을 분리합니다. 1.2.3-1.2.10 단계의 세부 정보를 참조하십시오.
      참고: 이 모델에서는 TCD-BM 대신 총 분리된 골수를 사용합니다.
    2. FVB 공여자 마우스의 비장 및 림프절로부터 T 세포를 정제한다. 1.3.1-1.3.13 단계의 세부 정보를 참조하십시오.
    3. 실험 과정 0일째에6BM(5 x 10 6/마우스), T 세포(0.5 x 10 6/마우스)를 BM-DC(2 x 106/마우스)로주입합니다.6
    4. 이식 후 3일째에, 유세포측정에 의한 공여자 DC 재구성을 검사한다.
      1. 받는 사람의 눈에서 혈액을 수집합니다.
      2. CD45.1/Ly5.1 B6 마우스를 3% 이소플루란 흡입으로 마취시. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
      3. 내측 캔에 멸균 유리 파이펫 튜브를 배치눈의 눈의 코의 평면에서 30-45 ° 각도로 caudally 지시. 튜브를 부드럽게 회전시키면서 압력을 가합니다.
      4. 혈액을 멸균 된 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 10 μL 헤파린 함유 튜브에 떨어 뜨립니다. 50 μL의 혈액을 5 mL 유리 흐름 튜브로 옮김.
      5. ACK 라싱 버퍼의 2mL를 추가합니다. 37°C에서 수조에서 45분 동안 배양합니다. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g의 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.
      6. 적절한 유동 염색 항체(라이브/데스 옐로우, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c 및 α-MHCII)를 포함하는 FACS 버퍼의 200 μL로 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 1 mL FACS 버퍼로 2x를 씻으소서. FACS 완충액의 200 μL에서 세포 펠릿을 재중단하고 유세포 분석에 의한 분석을 수행한다.

3. BMT의 GVHD / GVL 모델

  1. GVHD/GVL 유도를 수행합니다.
    1. 루시퍼라제는 RPMI 배양 배지에서 A20 B 세포 림프종을 트랜스듀듀어했다.
    2. 700 cGy (단일 용량)에서 BALB/c 배경 WT 또는 Ly5.1 수용자를 조사합니다. 1.1단계의 세부 정보를 참조하십시오.
    3. B6의 대퇴골과 경성에서 TCD-BM을 분리하십시오. Ly5.1 기증자 마우스. 1.2.1-1.2.10 단계의 세부 정보를 참조하십시오.
    4. C57BL/6 공여자 마우스의 비장과 림프절에서 T 세포를 정화합니다. 1.3.1-1.3.15 단계의 세부 정보를 참조하십시오.
    5. PBS의 25 mL로 A20 림프종 2x를 씻으소서. 얼음 차가운 PBS의 10 mL에 세포 펠릿을 다시 중단. 세포 현탁액 aliquot (10 μL)를 취하고 1% 트라이판 블루 및 혈세포계를 사용하여 세포를 계산한다. 세포 농도를 20,000 셀/mL로 조정합니다.
    6. TCD-BM (5 x 106/마우스)과 T 세포 (0.75 x 106/ 마우스) 및 A20 림프종 (5,000 세포 / 마우스)이있거나없는 경우를 주입하십시오.
    7. 실험 과정 동안 수용자 생존, GVHD 임상 징후 및 체중 감소에 대한 후속 조치. 1.5단계의 세부 정보를 참조하십시오.
  2. 생물 발광 이미징을 수행합니다.
    1. D-luciferin의 4 mg으로 받는 마우스를 주입 하 여 이식 된 받는 사람에 종양 성장을 모니터링. 루시퍼린이 루시퍼라제와 반응하도록 5분 동안 배양합니다.
    2. 생물 발광 이미저의 챔버에서 3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 현장 D에서 5분 동안 수신자를 이미지화하고 1분의 노출 시간을 가하였다.
    3. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 최상의 결과를 얻으려면 의사 색상 이미지의 배율을 변경합니다.
      참고: 모든 그림은 실험 에서 동일한 축척이어야 합니다.
    4. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역을 결정하고 관심 있는 각 영역에서 방출되는 플럭스(광자/s)를 계산하여 신호 밀도를 정량화합니다.

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Representative Results

주요 MHC-불일치 B6 (H2kbb)-BALB/C (H2kd)모델은 이식 후 GVHD 개발에 밀접하게 대응하였다(그림2). Cooke et al.16에 의해 이전에 확립된 모든 6개의 GVHD 임상 징후는 WT-B6 T 세포로 이식된 수용자에서 발생하지만, GVHD 음성 군을 나타내는 BM 단독으로 이식된 수용자(단계 1.5)에서는 발생하지 않았다. 이 모델에는 GVHD 개발에 두 단계가 있습니다. 첫째, 중증도의 피크는 이식 후 약 11일, 임상 점수 및 체중 회복의 감소가 16일까지 이다. 이 단계에서는, 조사 유도한 염증 및 생착 증후군과 같은 몇몇 기계장치는 질병 병원성 및 GVHD를 구동합니다. 수령인은 이식 후 약 30-40일 동안 GVHD에 균일하게 굴복합니다.

BM의 85% 이상이 DC로 분화하였다(도3A). 흥미롭게도,fB-/-DC를 가진 이식은 수용자 생존 및 GVHD 임상 점수를 향상하였다(도3B,C). fB-/- DC가 낮은 MHCII 발현 및 감소된 동동 수용체발현(17)에의해 입증된 항원 제시 용량이 적다는 것을 감안할 때, 공동 이식 프로토콜은 BMT 후 GVHD 개발에서 수용자 DC에서 다양한 신호 전달 또는 표적을 검사하기에 충분할 수 있다.

T 세포 순도는 농축 후 90%였다(도4A). 루시퍼라제-트랜스듀래스 A20 B 세포 림프종은 살아있는 동물의 종양 성장을 모니터링할 수있다(그림 4B). 이 모델에서, 수령인이 어떤 신호와 높은 GVHD 임상 점수없이 사망한 경우, GVHD로 사망했다고 결론을 내렸다. BM 단독으로 받은 모든 WT BALB/c 수용자와 A20을 받은 모든 수신자는 종양 재발로사망했다(도 3B). 대조적으로, 동물이 더 높은 신호 밀도로 죽으면 종양 재발로 사망했다는 결론을 내렸습니다. 도 3B에서 입증된 바와같이,ACC1fl/fl B6 공여자(ACC1+++ T세포)로부터 BM 및 T세포로 이식된 WT BALB/c 수용자는 GVHD로 사망했다.+/+ 동물이 질병의 신호로 죽으면 GVHD와 종양 재발로 사망했다는 결론을 내렸습니다. ACC1fl/fl x CD4 cre B6 공여자(ACC1-/--/- T 세포)로부터 BM 및 T 세포를 받은 동물은 GVHD 및 종양 재발 모두에서 사망했다(도3B). 동물은 나중에 촬영되거나 생체 내 이미징을 위해 안락사될 케이지에 다시 배치될 수 있다. 소프트웨어를 사용하여, 동물 내의 종양 덩어리도 개별적으로 분석할 수있다(도 3B).

Figure 1
그림 1: BMT 프로시저의 개략적 표현. (A)MHC 불일치 B6→BALB/c BMT 모델에 대한 구성표. (B)DC 공동 이식 FVB →B6 모델에 대한 계획. (C)B6→BALB/c GVHD/GVL 모델용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 주요 MHC 불일치 B6→BALB/c GVHD 모델. BALB/c 마우스를 5 x 106 BM 단독으로 또는 0.75 x 106 T 세포로 치사적으로 조사하고 이식하였다. (a)생존 데이터,(B)체중 감소 및(C)BM 단독 또는 T 세포의 수령인의 임상 점수 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: DC 공동 이식 HCT 모델. BM은 WT 및fB-/- B6 마우스로부터 분리되었고, GM-CSF로 배양함으로써 DC로 분화하였다. (A)DC의 순도는 CD11c 및 MHCII로 염색하여 유세포측정에 의해 조사되었다. Lethally 조사된 B6 수용자는 FVB 공여자로부터 BM(3 x 106/마우스)플러스 정제 된 T 세포 (1 x 106/마우스)로 이식하였다. 수령인은 또한 이식 당일 2 x 106 WT 또는 fB-/- B6 BM-DC 세포를 받았다. 생존(B)및 임상점수(C)가도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 메이저-MHC 불일치 B6→BALB/c GVHD/GVL 모델. WT BALB/c 수용자는 TCD-BM(5 x 10 6/마우스)으로 단독으로 또는 ACC1+/+ T 세포 또는 ACC1+/+ T 세포(1 x 106/마우스)를B6 배경 공여자 마우스로부터 분리하여 이식하였다.6 또한, 수령인은 이식 시 2 x 103 A20-luc를 받았다. T 세포 순도는 살아있는/죽음 황색, CD3, CD4 및 CD8 유동항체(A)로염색을 통해 유세포측정에 의해 조사되었다. 수용자는 전신 생물 발광 이미징(BLI)(B)에 의해 결정된B종양 성장을 모니터링하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

특정 개인에 맞게 줄기 세포의 사용은 고급 및 내성 암을 치료하는 효과적인 접근 이다18. 작은 분자 약제는, 그러나, 개인화한 암 치료의 1 차적인 초점으로 오래 남아 있습니다. 한편, 세포 치료에서 기증자와 숙주 간의 다수 상호작용은 BMT1후 GVHD의 발달과 같은 치료 결과에 결정적으로 영향을 미칠 수 있다.

BMT의 주요 MHC 불일치 마우스 모형은 GVHD의 생물학을 이해하고 그것의 처리에 있는 약의 효험을 시험에 있는 귀중한 공구입니다. 그 중, C57BL/6 (H2b)TO BALB/c (H2d)및 FVB (H2 q)→C57BL/6 (H2b)는잘 정립된 모델q5,,7. 이 모형은 단 하나 복용량으로 골수성 방사선 컨디셔닝을 통합합니다 (BALB/c) 또는 분별된 복용량 (C57BL/6) 있는 3-8 시간 간격은 창자 독성을 감소시키기 위하여 요구되는5. 두 모델 모두 CD8+ 및 CD4+ T 셀모두에 의존합니다. 이 모형에서, GVHD 엄격 및 생존은 측정된 주요 결과이고, 이식된 수신자는 일관된 급속한 역학 및 100% 침투가 있습니다. T 세포 이동 및 확장을 모니터링하기 위해, 루시퍼라제-트랜스듀싱된 공여자 마우스로부터의 T 세포는 생체생물발광이미징(19)에사용되어야 한다. 그러나, 수행 된 BMT의 90 %가 MHC 일치하는 동안, B6-BALB / c 모델은 임상 상황과 완벽하게 유사하지 않습니다. MHC및 경미한 조직 적합성 항원 (miHa)의 발견은 BMT10의필드를 전진시키기에 크게 기여했습니다. 사소한 MHC 불일치 GVHD 마우스 모델은 더 밀접하게 환자 GVHD20을모방. 공여자 세포 생착을 유도하는 컨디셔닝 강도는 조직 손상을 일으키고 GVHD 결과21에영향을 미칠 수 있다. 뮤린 모델의 컨디셔닝 요법은 종종 임상 설정22,,23에서화학 요법과 는 대조적으로 TBI를 수반한다. 따라서, 면역 억제 화학 요법 모델은 클리닉에서 감소 된 조건부 강도를 모방하는 데 사용되었습니다. 마우스 모델은 C57BL/6(H2b)to BALB/c (H2d)였으며,GVHD24와관련된 임상 및 조직학적 증상을 개발한 이식된 수혜자이다.

공동 이식 된 프로토콜의 잠재적인 장점은 CD11c 고갈 된 마우스에 특별히 의존하지 않고 받는 사람 DC의 역할을 테스트하는 것입니다. BM-DC 생성이 생체 외에서 수행되었기 때문에, 이 프로토콜은 또한 단순히 배양 조건을 수정함으로써 GVHD에서 대식세포 또는 호중구와 같은 다른 세포 유형의 역할을 시험하기 위해 적용될 수 있다. CD45.1+ B6 마우스를 수령인으로 사용하면 연구원은 유량 분석에 따라 받는 사람 DC(CD45.1+ CD11c+)와 BM-DC(CD45.2+ CD11c+)를구별할 수 있습니다. 생체 외에서 생성된 세포의 유연한 수및 입양된 수용자로의 이식은 공동 이식 프로토콜의 또 다른 이점이다. 더욱이, 생체 내 배양은 우리가 GVHD를 통제하는 잠재적인 약을 검열하는 것을 허용합니다.

생체 내에서 종양 패턴을 추적하는 능력은 약물이 GVL 활동에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트 할 수있는 잠재력을 가지고있는 강력한 도구입니다. 이러한 GVHD/GVL 모델을 사용하여, 종양 진행 및 전이를 살아있는동물(16)에서모니터링할 수 있다. 또한, 이 설정은 다중 암에 있는 GVL 효력을 시험하기 위해 이용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 의학의 중앙 플로리다 대학 의과 대학 창업 보조금의 대학에 의해 지원된다 (HN에), 피츠버그 의료 센터 힐만 암 센터 스타트 업 보조금의 대학 (HL에), 미국 NIH 그랜트 #1P20CA210300-01 및 건강 보조금 #4694 / QD-BYT의 베트남 정부 (PTH에). 우리는 연구를 위한 자료를 제공한 사우스 캐롤라이나 의과 대학에 박사 Xue-zhong Yu 에게 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

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References

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Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

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