Summary
Трансплантация против хозяина болезнь является одним из основных осложнений после аллогенной трансплантации костного мозга. Дендритные клетки играют важную роль в патогенеза болезни трансплантата против хозяина. В настоящей статье описывается новая платформа трансплантации костного мозга для изучения роли дендритных клеток в развитии трансплантата против хозяина болезни и трансплантата против лейкемии эффект.
Abstract
Аллогенная трансплантация костного мозга (BMT) является эффективной терапией гематологических злокачественных новообразований из-за трансплантата против лейкемии (GVL) эффект для искоренения опухолей. Тем не менее, его применение ограничено развитием трансплантата против хозяина болезни (GVHD), основное осложнение BMT. GVHD вызывается, когда Т-клетки в донорских трансплантатах распознаюталонантиген, выраженный клетками-реципиентами, и монтируют нежелательные иммунологические атаки против здоровых тканей реципиента. Таким образом, традиционные методы лечения предназначены для подавления донорской Т-клеточной аллореактивности. Однако эти подходы существенно ухудшают эффект GVL, чтобы выживаемость реципиента не улучшилась. Понимание влияния терапевтических подходов на BMT, GVL и GVHD, таким образом, имеет важное значение. Благодаря антиген-представлению и цитокин-секретов способности стимулировать донора Т-клеток, получатель дендритных клеток (DCs) играют значительную роль в индукции GVHD. Таким образом, таргетинг получателя DCs становится потенциальным подходом для управления GVHD. Эта работа предоставляет описание новой платформы BMT, чтобы исследовать, как принимающие DCs регулируют ответы GVH и GVL после трансплантации. Также представлена эффективная модель BMT для изучения биологии GVHD и GVL после трансплантации.
Introduction
Аллогенная гематопоатическая трансплантация стволовых клеток (BMT) является эффективной терапией для лечения гематологических злокачественных новообразований31,,2 через трансплантат-против лейкемии (GVL) эффект 3 . Тем не менее, донорские лимфоциты всегда монтировать нежелательные иммунологические атаки против тканей реципиента, процесс, называемый трансплантата против хозяина болезни (GVHD)4.
Murine модели GVHD являются эффективным инструментом для изучения биологии GVHD и GVL ответ5. Мыши являются экономически эффективной моделью исследования животных. Они небольшие и эффективно дозируются с молекулами и биопрепаратами на ранних стадиях развития6. Мыши являются идеальными исследованиями животных для генетических исследований манипуляции, потому что они генетически хорошо определены, что идеально подходит для изучения биологических путей и механизмов6. Несколько мышь основных гистосовместимости комплекса (MHC) MHC-несоответствие модели GVHD были хорошо созданы, такие как C57BL/6 (H2b) к BALB/c (H25,7d) и FVB (H2q) )b Это особенно ценные модели для определения роли отдельных типов клеток, генов и факторов, влияющих на ГВХД. Трансплантация от C57/BL/6 (H2b) родительским донорам получателям с мутациями в MHC I (B6.C-H2bm1)и/или MHC II (B6.C-H2bm12) показала, что несоответствие как в классе MHC I, так и в классе II является важным требованием для развития острого GVHD. Это говорит о том, что для развития болезни необходимы какCD4, так иCD8 - Т-клетки7,,8. GVHD также участвует в воспалительном каскаде, известном как «провоспалительный цитокиновый шторм»9. Наиболее распространенным методом кондиционирования в моделях мурина является полное облучение тела (TBI) рентгеновским снимком или 137Cs. Это приводит к абляции костного мозга реципиента, тем самым позволяя донору прививать стволовые клетки и предотвращая отторжение трансплантата. Это делается путем ограничения распространения Т-клеток реципиента в ответ на донорские клетки. Кроме того, генетическое неравенство играет важную роль в индукции заболеваний, которая также зависит от незначительных MHC-несоответствие10. Таким образом, доза миелоабливного облучения варьируется в различных штаммов мыши (например, BALB/c'C57BL/6).
Активация т-клеток донора хост антигеном, представляя клетки (APCs) имеет важное значение для развития GVHD. Среди БТР, дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными. Они наследуют способны индуцировать GVHD из-за их превосходного поглощения антигена, экспрессии Т-клеточных костимулирующих молекул, и производства провоспалительных цитокинов, которые поляризуют Т-клетки в патогенные подмножества. Получатель DCs имеют решающее значение для облегчения Т-клеток грунтовки и Индукции GVHD после трансплантации11,12. Соответственно, DCs стали интересными целями в лечении GVHD12.
TBI требуется для повышения донорской клетки прививование. Благодаря эффекту TBI, реципиент DC активируются и выживают в течение короткого времени после трансплантации12. Несмотря на значительные достижения в области использования биолюминесценции или флуоресценции, создание эффективной модели для изучения роли получателя DCs в GVHD по-прежнему является сложной задачей.
Поскольку донорские Т-клетки являются движущей силой для активности GVL, стратегии лечения с использованием иммуносупрессивных препаратов, таких как стероиды для подавления Т-клеточной аллореактивности часто вызывают рецидив опухоли или инфекции13. Таким образом, таргетинг получателя DCs может обеспечить альтернативный подход для лечения GVHD при сохранении эффекта GVL и избежать инфекции.
Короче говоря, текущее исследование предоставляет платформу, чтобы понять, как различные типы сигнализации в получатель DCs регулирует развитие GVHD и эффект GVL после BMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Центральной Флориды.
1. Индукция GVHD
ПРИМЕЧАНИЕ: Аллогенная трансплантация клеток костного мозга (БМ) (шаг 1.2) выполняется в течение 24 ч после облучения. Все описанные ниже процедуры выполняются в стерильной среде. Выполните процедуру в капюшоне культуры тканей и используйте фильтрованные реагенты.
- День 0: Подготовка получателя мышей.
- Используйте самки диких мышей типа (WT) на фоне BALB/c (CD45.2и H2kd)), 10-12 недель в качестве получателей.
- Ухо-тег и взвесить получателей до TBI. Затем поместите до 11 мышей в камеру облучения и держите его в облучении. Облучить в разовой дозе 700 cGy в течение 10-15 мин.
- Вернуть облученных животных в клетки и разместить их в патогенных учреждениях до трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная масса тела получателей должна быть около 20 г. Используйте этот вес в качестве ссылки для расчета потери веса тела в течение экспериментального периода.
- День 1: Подготовка Т-клеток истощенного костного мозга (TCD-BM) от донорских мышей.
- Эвтанизировать CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 мышей CO2 удушья и ждать 2'3 мин, пока они не будут без сознания. Выполните вывих шейки матки как вторичную эвтаназию, если это необходимо.
- Поместите каждую мышь на чистую рабочую доску. Обезвить мех и кожу с 70% изопропанола.
- Соберите голени и бедренной кости с обеих ног с помощью щипков и ножниц. Положите их в ледяной RPMI, содержащий 1% FCS и 100 U/mL пенициллин / стрептомицин и 2 мМ L-глутамин (1% RPMI) в 50 мл конических труб. Очистите бедренную кейстер и кости голени тщательно, удалив все мышечные ткани с помощью щипц и ножниц. Перенесите бедренную кость и голени из конических труб 50 мл в чашку Диаметром 92 мм, содержащую 1% RPMI.
- Используя ножницы, вырезать концы бедренной кости или голени. Заполните трубку 50 мл с 25 мл 1% RPMI 1640 средних. Используйте это, чтобы заполнить 3 мл шприц, прикрепленный к 26 G иглы с 3 мл 1% RPMI. Вставьте этот шприц в кость и нажмите поршень, чтобы смыть костный мозг (БМ) из полости в трубку сбора с 1% RPMI (3 мл / кости).
- Повторите шаг 1.2.4 для всех оставшихся костей голени и бедренной кости от других мышей-доноров. Храните все трубки коллекции на льду.
- Сделать одноклеточной подвески путем промывки костного мозга штук через 75 мкм сетки ячейки ситечко. Соберите одноклеточную подвеску в трубке 50 мл.
- Центрифуги трубки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирируй и отбрасывай супернатант. Приостановить гранулы в буфере PBS, содержащий 0,5% бычьего сыворотки альбумина (BSA) на 20 x 106 клеток/мл. Сохранить aliquot 2 х 106 клеток для очистки чистоты.
- Добавить антитела Thy 1 при 0,05 мкг/106 клеток14 и инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. Вымойте один раз с 25 мл ледяной PBS. Resuspend на 20 x 106/mLв 0.5% BSA/10% молодой дополнение кролика/2% DNase (10,000 U/mL в стерильных H2O). Инкубировать в течение 45 мин при 37 градусах По Цельсию и мыть 2x, как раньше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Т-клетки истощаются с помощью mAb, специфичный для Thy1, белка, выраженного всеми Т-клетками, но не другими лейкоцитами. - Resuspend клетки в 20 мл pbS буфера, содержащего 0,5% BSA. Подсчитайте клетки костного мозга в 1% уксусной кислоты с помощью геоцитометра. Держите aliquot 2 х 106 клеток для проверки чистоты по течению цитометрии после очистки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна донорская мышь обычно генерирует около 25 х 106 TCD-BM. - Используйте цитометрию потока, чтобы подтвердить успешное истощение Т-клеток. Пятно 1 х 106 клеток, сохраненных от шагов 1.2.7 (до истощения Т-клеток) и 1.2.9 (TCD-BM после истощения Т-клеток) со следующими антителами: q-CD3 (17A2), q-CD4 (GK1.5) и К-CD8 (53-6,7).
- День 1: Подготовка Т-клеток от мышей-доноров
- Используйте в качестве доноров для Т-клеток мышей CD45.2и H2kb' C57BL/6 диких типов (WT).
- Эвтаназия C57BL/6 мышей при углекислом газе (CO2) удушье, как описано в 1.2.1.
- Тщательно очистите мех и кожу мыши с помощью 70% этанола. Акцизные селезенки и лимфатические узлы и отделить их на одну клеточную подвеску спленоцитов с помощью шприца поршень и 40 мкм сетки strainers. Вымойте ситечко и шприц поршень с 1% RPMI (1% FBS, содержащий RPMI СМИ), чтобы собрать все спленоциты.
- Центрифуги яточной подвески при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Добавьте 5 мл lysing буфера ACK (1 мМ Na2EDTA, 10 мМ KHCO3,144 мМ NH4Cl, pH 7.2) после отбрасывания супернатанта. Инкубировать клеточную подвеску в течение 5 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: ACK лиза буфер используется для лиза красных кровяных телец. - Добавьте 5 мл 1% RPMI, чтобы остановить лиза. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант.
- Подготовка ледяной магнитно-активированной сортировки ячейки (MACS) буфер (0.5% BSA, 2 мМ EDTA в PBS, pH 7.2). Дега буфер перед использованием. Отрежь пеллеты клеток в 5 мл буфера MACS.
- Подсчитайте спленоциты и проверьте живые и мертвые клетки с помощью гемоситометра и 1% трипан синий. Сохранить аликвот 2 х 106 клеток для оценки урожайности очистки с циклометрии анализа потока.
- Приостановите спленоциты в концентрации 2006х 10 6/мл в буфере MACS. Добавьте 0,03 л биотина против мыши-Тер-119, 0,03 л биотина против мыши-CD11b, 0,03 л биотина против мыши-CD45R и 0,03 л биотин анти-мышки-DX5 на 106 клеток. Инкубировать в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R, и biotin anti-mouse-DX5 были использованы для того чтобы прореагировать с эритроидами, granulocytes, B-клетками, и клетками NK соответственно. Таким образом, эти подмножества клеток истощаются в следующем шаге15. - Добавьте 10 мл ледяного буфера MACS в суспензию ячейки. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант.
- Приостанавливать действие клеточных гранул в буфере MACS в6концентрации 100 x 10 6/мл. Добавьте антибиотиновые микробусы (0,22 л/106 клеток) к суспензии. Хорошо перемешайте и инкубировать еще 15 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте суспензию ячейки один раз с 10 мл ледяного буфера MACS. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию и отбрасывайте супернатант.
- Поместите магнитную отделяющую колонку в магнитное поле. Промыть столбец с 3 мл буфера MACS. Опустите подвеску ячейки на столбец. Соберите поток через состоящий из несвязанных, обогащенных Т-клеток, в новой 15 мл конической трубки. Вымойте колонку MS с 3 мл ледяного буфера MACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что столбец пуст перед выполнением стирки. - Центрифуги яточной подвески при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Отрежь пеллетку ячейки в 5 мл буфера MACS.
- Подсчитайте клетки в 1% трипан синий с помощью гемоцитометра. Сохранить aliquot 2 х 106 клеток для проверки чистоты по потоку цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя урожайность селезенки Т-клеток, изолированных этим методом, составляет 20-25 х 106 ячеек на мышь. - Подтвердите выход Т-клеточного обогащения цитометрией потока. Пятно 1 х 106 клеток, сохраненных от шагов 1.3.7 (до истощения Т-клеток) и 1.3.13 (TCD-BM после истощения Т-клеток), со следующими антителами: q-CD3 (17A2), q-CD4 (GK1.5) и К-CD8 (53-6.7).
- День 1: Впрыскивать облученных мышей с донорскими Т-клетками и ТКД-БМ.
- Вымойте TCD-BM и Т-клетки 2x с PBS (800 х г в течение 5 мин при 4 C). Приостанавливайте действие клеток в ледяном PBS для инъекций. Отрегулируйте концентрацию клеток6до 20 x 10 6/мл для ТКД БМ и 4 х 106/млдля Т-клеток.
- Нагрейте животное с помощью нагревательной лампы, чтобы увеличить видимость двусторонних хвостовых вен. При необходимости поместите мышь в удерживатель.
- Очистите поверхность хвоста с помощью 70% изопропанола. Впрысните TCD-BM (5 x 106 клеток/мышь) с или без T-клеток (0.75 x 106 ячеек/мышь). Будьте осторожны, чтобы не ввести воздух в шприц.
- Снимите иглу и нанесите антисептический тампон непосредственно к месту инъекции 5–10 с, чтобы остановить кровотечение.
- Оцените GVHD в дни 2–80.
- Следите за выживанием животных. Мониторинг клинических признаков GVHD адаптированы из системы скоринга, установленной ранее Кук и др.16 и массы тела мышей-реципиента 2x в неделю. Используйте вес тела определяется до TBI для расчета потери веса тела.
- Взвешивать каждую мышь по отдельности. Оценка потери веса следующим образом: класс 0 и менее 10%; 1-й класс - 10%-20%; 2 класс - более 20%.
- Оценка знака осанки получателей: оценка 0 - нет предчувствия; сорт 0,5 - небольшое предчувствие, но выпрямляется при ходьбе; 1-й класс - животное остается сгорбившись при ходьбе; сорт 1.5 - животное не выпрямляет; класс 2.0 - животное стоит на задних носовых ясниках.
- Оценка знака мобильности получателей: оценка 0 и очень активная; сорт 0,5 - медленнее, чем наивные мыши; сорт 1.0 - перемещается только тогда, когда ткнул; сорт 1.5 - слегка перемещается при ткнуле; класс 2.0 - не двигается, когда ткнул.
- Оценка кожи получателей: класс 0 - без ссадин, поражений или масштабирования; сорт 0,5 - покраснение в одной конкретной области; 1-й класс - ссадины в одной области или легкая ссадины в двух областях; 1.5 - серьезные ссадины в двух или более областях; 2.0 - тяжелые ссадины, растрескивание кожи, высохшая кровь.
- Оценка меха получателей: оценка 0 - нет ненормальных признаков; класс 0,5 - преодоление на стороне живота или затылка, класс 1.0 - преодоление поперек или стороны живота и шеи; класс 1.5 - неопрятный спутанный и ржавый мех; класса 2.0 - плохо спутанный мех на животе и спине.
- Оценка диареи получателей: класс 0 и без диареи; сорт 0,5 - легкий и мягкий стул; сорт 1.0 - мягкий (желтый стул); 1,5 - умеренный (желтый стул с небольшим количеством крови); класс 2 - тяжелый (светло-желтый и кровавый стул, "сушеный торт стул" появляются на анальной области).
2. Модель котрансплантации
- Генерация дендритных клеток костного мозга (BM-DCs).
- Изолировать костный мозг от бедренной кости и tibias WT или фактор B (fB)-/- мыши на фоне B6, как описано в шагах 1.2.3'1.2.4. Спин клетки на 800 х г в течение 5 мин.
- Приостановите гранулы в 5 мл lysing буфера ACK для лиза красных кровяных телец. Инкубировать клеточную подвеску на 5 мин на льду. Добавьте 10 мл 1% RPMI к суспензии клетки, чтобы остановить лисис и центрифугу при 800 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
- Повторное использование клеточных гранул в 10 мл культурных носителей (RPMI 1460, содержащих 10% FBS, 100 U/mL пенициллина/стрептомицина, 2 мМ л-глютамина и 50 мМ-меркаптоэтанола) и отрегулируйте объем, чтобы соответствовать конечной концентрации 2 х 106 клеток/мл.
- Добавьте 20 нг/мЛ гранулоцитов-макрофаг колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) в клеточной подвеске. Культура клеток костного мозга в 100 х 15 мм Петри блюда при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 в течение 6 дней.
- Замените половину текущих культурных носителей (около 5 мл) свежими носителями, содержащими 40 нг/мл GM-CSF на 3-й день.
- Разогреть культуры средств массовой информации в водяной бане на 37 градусов по Цельсию. Соберите около 5 мл средств массовой информации из костного мозга культуры блюд. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант. Отрептить клеточные гранулы в среду 5 мл культурных носителей, содержащих 40 нг/мл GM-CSF.
- Добавить 25 мкг/мл липополисахарида (LPS) в средствах массовой информации на 6-й день культуры для созревания BM-DCs. Сохранить aliquot 2 х 106 клеток, чтобы определить эффективность ДИфференциации DC по потоку цитометрии.
- Соберите созрели BM-DCs: Используйте подъемники для мягкого соскребать DCs из посуды Петри. Соберите все клеточные суспензии в конические трубки 50 мл. Центрифуга при 800 х г,в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Вымойте клеточные гранулы 3x с 50 мл ледяной PBS. Сохранить около 2 х 106 BM-DCs для иммунологического анализа фенотипа с помощью цитометрии потока.
- Выполните дендритную клеточную котрансплантацию БМТ (DC-котрансплантационирующая BMT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте FVB (H2kq) мышей в качестве доноров для Т-клеток и БМ-клеток. Облучение B6 Ly5.1 мышей-реципиентов в дозе 1100 cGy (2 дозы, 3 ч интервал). Подробности смотрите в шаге 1.1.- Изолировать БМ от бедренной кости и tibias из FVB донора мышей. Подробности смотрите в шагах 1.2.3-1.2.10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте общий изолированный костный мозг вместо TCD-BM в этой модели. - Очистка Т-клеток от селезенок и лимфатических узлов мышей-доноров FVB. Подробности смотрите в шагах 1.3.1-1.3.13.
- Впрыскивает БМ (5 x 106/мышь), Т-клетки (0,5 х 106/мышь) с БМ-Код (2 x 106/мышь) в день 0 экспериментального курса.
- На 3-й день после трансплантации, изучить донора DC восстановления потокциометрии.
- Собирайте кровь из глаз получателей.
- Анестезия CD45.1/Ly5.1 B6 мышей на 3% изолюранинга. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
- Поместите стерильную стеклянную трубку пипетки в медиальной кантоны глаза, направленной caudally под углом 30-45 "от плоскости носа. Нанесите давление при мягкой вращении трубки.
- Опустите кровь в 10 йл гепариносодержащих стерильных 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Перенесите 50 л крови в трубы потока стекла 5 мл.
- Добавьте 2 мл lysing буфера ACK. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в водяной бане в течение 45 мин. Добавить 2 мл буфера окрашивания FACS. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант.
- Отстегивай теплат с 200 qL буфера FACS, содержащего соответствующие тексируя антитела потока (живой/смертельный желтый, з-H-2Kb,q-CD45.1, q-CD45.2, q-CD11c, и q-MHCII). Инкубировать в течение 15 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте. Вымойте 2x с буфером 1 мл FACS. Повторное удаление клеточных гранул в 200-х годах буфера FACS и выполнение анализа цитометрией потока.
- Изолировать БМ от бедренной кости и tibias из FVB донора мышей. Подробности смотрите в шагах 1.2.3-1.2.10.
3. GVHD/GVL Модели БМТ
- Выполните индукцию GVHD/GVL.
- Культура люциферазы транс-лимфомы клеток A20 B в средствах культуры RPMI.
- Облучение BALB/c фон WT или Ly5.1 получателя на 700 cGy (разовая доза). Подробности смотрите в шаге 1.1.
- Изолировать TCD-BM из бедренной кости и tibias B6. Ly5.1 донорские мыши. Подробности смотрите в шагах 1.2.1-1.2.10.
- Очистка Т-клеток от селезенки и лимфатических узлов мышей-доноров C57BL/6. Подробности смотрите в шагах 1.3.1-1.3.15.
- Вымойте лимфомы A20 2x с 25 мл PBS. Отдохните пеллеты клетки в 10 ml ледяного PBS. Возьмите аликот суспензии клетки (10 qL) и подсчитайте клетки, используя 1% трипан синий и гемоцитометр. Отрегулируйте концентрацию клеток до 20 000 клеток/мл.
- Впрысните TCD-BM (5 x 106/мышь) с или без T-клеток (0.75 x 106/mouse)и лимфомы A20 (5000 клеток/мышей).
- Следите за выживаемость реципиента, клинические признаки GVHD и потеря веса тела во время экспериментального курса. Подробности смотрите в шаге 1.5.
- Выполните биолюминесцентную визуализацию.
- Мониторинг роста опухоли у пересаженного реципиента путем введения мышей-реципиента с 4 мг D-люциферина. Инкубировать в течение 5 минут, чтобы обеспечить люциферин реагирует с люциферазы.
- Анестезия мыши с помощью 3% изофлуран в камере биолюминесценции изображения и изображения получателей в течение 5 минут в поле D и время экспозиции 1 мин.
- Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Измените масштаб псевдоцветных изображений для достижения наилучших результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все фотографии должны быть в одинаковом масштабе в экспериментах. - Используйте программное обеспечение для анализа изображений для определения регионов, представляющих интерес, и количественной оценки плотности сигнала путем расчета потока (фотон/ы), испускаемого из каждой области, представляющих интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основная модель MHC-mismatched B6b(H2k b)-BALB/C (H2kd)тесно соответствовала развитию GVHD после трансплантации(рисунок 2). Все шесть клинических признаков ГВХД, установленных ранее Cooke et al.16, произошли у реципиентов, пересаженных СВ-В6 Т-клеток, но не у реципиентов, пересаженных только с БМ (шаг 1.5), которые представляли GVHD-отрицательную группу. В этой модели есть два этапа разработки GVHD. Во-первых, пик тяжести составляет примерно 11 дней после трансплантации, с последующим снижением клинических показателей и восстановлением массы тела до 16 дней. На этой стадии, несколько механизмов, таких как облучение индуцированного воспаления и привязания синдром диски болезни патогенности и GVHD. Реципиенты равномерно поддаются GVHD примерно через 30-40 дней после трансплантации.
По крайней мере 85% БМ дифференцированы в DCs(Рисунок 3A). Интересно, что трансплантация с FB-/- DCs улучшили выживаемость реципиента и GVHD клинический балл(рисунок 3B, C). Учитывая, что fB-/- DCs имеют меньше антигена, представляя способность продемонстрирована более низкой экспрессией MHCII и снижением состимулирующего экспрессии рецепторов17,протокола сотрансплантации может быть достаточно для изучения различных сигнальных сигналов или целей в реципиентных DCs в развитии GVHD после BMT.
Чистота Т-клеток составила 90% после обогащения(рисунок 4А). Люциферазева-трансиндуцированная лимфома клеток A20 B позволяет контролировать рост опухоли у живых животных(рисунок 4B). В этой модели, если получатели умерли без какого-либо сигнала и высокой клинической оценки GVHD, был сделан вывод, что они умерли от GVHD. Все получатели WT BALB/c, которые получили БМ в одиночку плюс A20 умер от рецидива опухоли(рисунок 3B). В отличие от этого, если животное умерло от более высокой плотности сигнала, было заключено, что они умерли от рецидива опухоли. Как показано на рисунке 3B, WT BALB/c реципиентов, пересаженных с БМ и Т-клеток от ACC1fl/fl B6 донора (ACC1 / Т-клеток) умер от GVHD.+/+ Если животные умирали с сигналами болезни, был сделан вывод, что они умерли от ГВХД и рецидива опухоли. Звери, которые получили БМ и Т-клетки от ACC1fl/fl x CD4 cre B6 донора (ACC1-/- Т-клеток) умер от гВБи и рецидива опухоли(рисунок 3B). Звери могут быть помещены обратно в клетку, чтобы быть изображены на более поздней точке времени или усыплены для изображения ex vivo. Используя программное обеспечение, опухоль массы у животного также может анализироваться индивидуально(рисунок 3B).
Рисунок 1: Схематическое представление процедуры BMT. (A) Схема для MHC-несовместимой модели B6'BALB/c BMT. (B) Схема для СОВМЕСТНОй трансплантации DC FVB-B6 модели. (C) Схема для модели B6'BALB/c GVHD/GVL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Основные MHC-несоответствие B6'BALB/c GVHD модели. Мыши BALB/c были смертельно облучены и пересажены только 5 х 106 БМ или с 0,75 х 106 Т-клеток. (A) Данные о выживании, (B) потеря веса тела, и (C) клинические данные оценки получателей БМ в одиночку или с Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: DC совместной трансплантации HCT модели. БМ был изолирован от WT и fB-/- B6 мышей и дифференцированы в DCs путем культивирования с GM-CSF. (A) Чистота DCs был изучен цитометрии потока путем окрашивания с CD11c и MHCII. Смертельно облученные реципиенты B6 были пересажены с БМ (3 х 106/мышь) плюс очищенные Т-клетки (1 х 106/мышь) от доноров FVB. Реципиенты также получили 2 x 106 WT или fB-/- B6 BM-DCs клетки в день трансплантации. Показано выживание(B)и клинический балл(C) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Модель Major-MHC несовместима с Моделью B6'BALB/c GVHD/GVL. Реципиенты WT BALB/c были пересажены с TCD-BM (5 x 106/мышь) самостоятельно или с ACC1-/ T-клетками или ACC1-/' T-клетками (1 x 106/мышь)изолированными от мышей-доноров B6 фоновыми. Кроме того, реципиенты получили 2 x 103 A20-luc на момент пересадки. Чистота Т-клеток была исследована цитометрией потока через окрашивание с живым/смертельным желтым, CD3, CD4 и антителами потока CD8 (A). Получатели были проверены на рост опухоли определяется всего тела биолюминесценции изображений (BLI) (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование стволовых клеток в соответствии с конкретным человеком является эффективным подходом для лечения передовых и устойчивых раковых заболеваний18. Малые молекулы фармацевтических препаратов, однако, уже давно остается основным направлением персонализированной терапии рака. С другой стороны, в клеточной терапии множество взаимодействий между донором и хозяином может решительно влиять на исходы лечения, такие как развитие GVHD после BMT1.
Основные MHC-несовместимые мыши модели BMT являются ценным инструментом в понимании биологии GVHD и тестирования эффективности препаратов в его лечении. Среди них, C57BL/6 (H2b) к BALB/c (H2d) и FVB (H2b5,7q) Эти модели включают либо миелоабливного излучения кондиционирования в виде одной дозы (BALB/c) или фракционной дозы (C57BL/6), в котором 3-8 часовых интервалов, необходимых для снижения токсичности кишечника5. Обе модели зависят как отCD8, так и от CD4и Т-клеток. В этих моделях, тяжесть GVHD и выживание являются основными исходами измеряется, и пересаженных реципиент имеет последовательную быструю кинетику и 100% penetrance. Для того, чтобы контролировать Т-клеточные миграции и расширения, Т-клетки из люциферазы-трансумированных донорских мышей должны быть использованы для вивобиолюминесценции изображений19. Однако, в то время как 90% выполненных БМТ соответствуют MHC, модель B6-BALB/c не идеально похожа на клиническую ситуацию. Открытие MHC и незначительных антигенов гистосовместимости (miHAs) в значительной степени способствовало продвижению области BMT10. Незначительные модели мыши GVHD, несовместимые с MHC, более точно имитируют пациента GVHD20. Интенсивность кондиционирования, чтобы вызвать донорскую клетку прививования вызывает повреждение тканей и может повлиять на результат GVHD21. Режимы кондиционирования в моделях мурин часто включает TBI в отличие от химиотерапии в клинических условиях22,23. Таким образом, иммуносупрессивная модель химиотерапии была использована для имитации снижения условной интенсивности в клиниках. Мышь модель была C57BL/6 (H2b) к BALB/c (H2d) и пересаженные реципиенты разработали клинические и гистологические симптомы, связанные с GVHD24.
Потенциальным преимуществом совместного трансплантационного протокола является проверка роли реципиента DCs без зависимости конкретно от CD11c истощенных мышей. Поскольку генерация BM-DC была выполнена ex vivo, этот протокол также может быть применен для проверки роли других типов клеток, таких как макрофаги или нейтрофилы в GVHD просто путем изменения условий культуры. Использование CD45.1и B6 мышей в качестве получателей позволяет исследователям отличить BM-DCs (CD45.2и CD11c)от получателя DCs (CD45.1cd11c )по анализу потока. Гибкое количество клеток, генерируемых ex vivo и принятых на пересаженных реципиентов является еще одним преимуществом протокола совместной трансплантации. Кроме того, культура ex vivo позволяет нам проверять потенциальные препараты для контроля GVHD.
Способность отслеживать опухолевые паттерны in vivo является мощным инструментом, который имеет потенциал для проверки того, может ли препарат повлиять на активность GVL. Используя эту модель GVHD/GVL, прогрессирование опухоли и метастазирование можно контролировать у живых животных16. Кроме того, эта настройка может быть использована для тестирования эффекта GVL при множественных раковых заболеваниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается Университетом Центральной Флориды колледж медицины запуска гранта (для HN), Университет Питтсбурга Медицинский центр Хиллман онкологический центр Хиллман онкологический центр запуска гранта (в HL), Соединенные Штаты NIH Грант #1P20CA210300-01 и Вьетнамского Министерства здравоохранения Грант #4694 / КД-BYT (к PTH). Мы благодарим д-ра Сюэ Чжун Ю в Медицинском университете южной Каролины за предоставление материалов для исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | Fisher Scientific | BP2482100 | MACS buffer |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP3994 | MACS buffer |
| A20 B-cell lymphoma | University of Central Florida | In house | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl | Jackson Lab | 30954 | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl CD4cre | University of Central Florida | GVL experiment | |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | T-cell enrichment |
| Anti-Human/Mouse CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-85 | T-cell enrichment |
| Anti-mouse B220 FITC | Thermo Fisher Scientific | 10452-85 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse CD11c- AF700 | Thermo Fisher Scientific | 117319 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD25 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0251-82 | Flow staining |
| Anti-Mouse CD4 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0041-86 | T-cell enrichment |
| Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-82 | Flow staining |
| Anti-mouse CD45.1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0900-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD8a APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0081-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5958-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse MHC Class II-antibody APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5320-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse TER-119 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-85 | T-cell enrichment |
| Anti-Thy1.2 | Bio Excel | BE0066 | BM generation |
| B6 fB-/- mice | University of Central Florida | In house | Recipients |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice | Charles River | 564 | Donors |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | Transplant recipients |
| C57BL/6 mice | Charles River | 027 | Donors/Recipients |
| CD11b | Thermo Fisher Scientific | 13-0112-85 | T-cell enrichment |
| CD25-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0251-82 | T-cell enrichment |
| CD45R | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-82 | T-cell enrichment |
| CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5971-82 | T-cell enrichment |
| Cell strainer 40 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | Cell preparation |
| Cell strainer 70 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | Cell preparation |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | Live animal imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Bilogicals R&D system | D17051 | Cell Culture |
| Flow cytometry tubes | Fisher Scientific | 352008 | Flow cytometry analysis |
| FVB/NCrl | Charles River | 207 | Donors |
| Lipopolysacharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391-1MG | DC mature |
| LS column | Mitenyi Biotec | 130-042-401 | Cell preparation |
| MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | T-cell enrichment |
| New Brunswick Galaxy 170R incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | Cell Culture |
| Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | Media |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scienctific | 11875-093 | Media |
| TER119 | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-82 | T-cell enrichment |
| Xenogen IVIS-200 | Perkin Elmer | Xenogen IVIS-200 | Live animal imaging |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-RAY | X-RAD 320 | Total Body Irradiation |
References
- Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
- Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
- Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
- Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
- Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
- Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
- Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
- Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
- Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
- Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
- Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
- McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
- Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
- Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
- Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
- Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
- Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
