Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.
Amip ortak kültür süreci sırasında, birden fazla virüs tek bir kuyuda izole edilebilir. Daha önce bu sorunu, viral popülasyona uygulanan son nokta seyreltme ve/veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile çözmüştük. Ancak, karışımdaki virüsler benzer morfolojik özelliklere sahip olduğunda ve virüslerden biri yavaş yavaş çoğaldığında, genom montaj aşamasında iki virüsün varlığı keşfedilir ve virüsler daha fazla karakterizasyon için ayrılamaz. Bu sorunu çözmek için, son derece benzer virüslerin ayrılması ve klonlanmasına olanak tanıyan tek bir hücreli mikro aspirasyon prosedürü geliştirdik. Bu çalışmada, bu alternatif strateji bize Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7, yavaş büyüyen ve amipli ve hızlı büyüyen göre amip lisis yol açmaz dev virüslerin küçük viral alt popülasyonları ayırmak için izin nasıl sayılmızı sıyoruz Faustovirüs. Saflık kontrolü spesifik gen amplifikasyonu ile değerlendirildi ve daha fazla karakterizasyon için virüsler üretildi.
Nükleozositoplazmik büyük DNA virüsleri (NCLDV) ökaryotlara bulaşandört aile tarafından tanımlanan son derece çeşitlidir. 300 kbp üzerinde genomları ile ilk açıklanan virüsler Phydcodnaviridaeedildi , Paramecium bursaria Chlorella virüsü dahil 1 PBCV12. İzolasyon ve Mimivirüs ilk açıklaması, virüslerin boyutu parçacık (450 nm) ve genom uzunluğu (1.2 Mb)3hem boyutu açısından iki katına gösterdi . O zamandan beri, birçok dev virüs, genellikle bir amip co-kültür prosedürü kullanılarak izole tarif edilmiştir. Farklı morfolojileri ve genetik içeriği ile birçok dev virüs Marsilyavirüsler, Pandoravirüsler, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus ve son zamanlarda dahil olmak üzere Acanthamoeba sp. hücreleri, izole edilebilir Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Buna paralel olarak, Vermamoeba vermiformis izolasyon izolasyon ve dev virüsler Faustovirus, Kaumoebavirus ve Orpheovirus18, 19,20açıklamasına izin verdi. Diğer dev virüsler kafeterya roenbergensis21gibi ev sahibi protistler ile izole edildi, Aureococcus anoofagefferens22, Chrysochromulina ericina23, ve Bodo saltans 24. yıl. Tüm bu izolasyonlar izolasyon ve yüksek iş-iş stratejisi güncellemeleri25,26,27,28,gibi giriş üzerinde çalışan ekiplerin artan sayıda sonucu akış sitometrisi kullanımı ile ortak kültür sisteminin iyileştirilmesi.
2016 yılında, dev virüsleri izole etmek için ortak kültür ve akış sitometrisini ilişkilendiren bir strateji kullandık27. Bu strateji aşılanan numune sayısını artırmak, hücre desteği olarak kullanılan protistleri çeşitlendirmek ve hücre desteğinin düzgünliğini hızlı bir şekilde tespit etmek için geliştirilmiştir. Sistem pacmanvirus29durumunda olduğu gibi ön moleküler biyoloji kimlik ve bilinmeyen bir viral popülasyonun hızlı tespiti önlemek için ek bir adım ekleyerek güncellendi . Mimivirüs ve Cedratvirus A1130karışımının ayrılmasıiçin izin verilen hücre ayrıştırma için kaplin akış sitometri . Ancak daha sonra bu viral alt popülasyonların akış sitometrisi ile ayrılması ve saptanması ile ilgili sınırlamalarla karşılaştık. Sıralamadan sonra, Faustovirus ST125 ve Faustovirus LCD7 (yayınlanmamış veriler) genomlarını bir araya getirdiğimizde, şaşırtıcı bir şekilde her derlemede, kamu genom veritabanlarında tanımlanmamış iki yeni virüsün iki ek genomunu bulduk. Ancak, ne akış sitometrisi ne de iletim elektronik mikroskopi (TEM) amiplerin iki farklı virüs, Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7 ile enfekte olduğunu gösterdi. Faustovirüs, Usurpativirus ve Clandestinovirus belirteçlerini sırasıyla genomlarına göre güçlendirmek için özel PCR sistemleri tasarladık; amacımız, ayrılan virüslerin saflıklarının doğrulanmasını sağlayan PCR tabanlı sistemlere sahip olmaktı. Ancak, son nokta seyreltme ve akış sitometri onları ayırmak için başarısız oldu. Clandestinovirus ve Usurpativirus popülasyonlarının ne morfolojisi ne de çoğaltıcı elementleri karakterize edilmediği için bu tek viral popülasyonun izole edilmesi zordu. İki popülasyonun üst üste binme (etkili ayrışma sonrasında test edildiği) nedeniyle akış sitometrisi ile sadece bir viral popülasyon tespit ettik. 96 kuyulu plakalarda tek partikül ayrıştırma kullanarak ayırmaya çalıştık, ancak herhangi bir sitopatik etki gözlemlemedik ve PCR amplifikasyon uğramı ile ne Clandestinovirus ne de Usurpativirus tespit ettik. Son olarak, faustovirüsler bu iki düşük bolluk dev virüslerin ayrılmasını etkin tek amip mikro-aspirasyon izledi sadece uç nokta seyreltme kombinasyonu oldu. Bu ayırma yöntemi bu makalenin nesnesidir.
Tek hücreli mikro-aspirasyon işleme süresi ve iyi çalışması operatöre bağlıdır. Deneyin farklı adımları kesinlik gerektirir. İş istasyonunun mikromanipülasyon bileşenlerinin kullanımı, mikro-aspirasyon sürecini ve hücrenin salınımını gözlemleyerek sürekli kontrol altında olmalıdır. Mikroskobik gözlem ile takip bir hücrenin yakalanması ve transferi için gereklidir. Deneyimli bir operatör 10 hücreleri izole etmek ve izole edilecek virüslerin bolluğuna bağlı olarak tek tek aktarmak i…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar hem Jean-Pierre Baudoin ve Olivier Mbarek kendi tavsiye ve Claire Andréani İngilizce düzeltmeler ve değişiklikler ona yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Anr-10-IAHU-03 (Méditerranée Enfeksiyonu) referansı ile “Investissements d’avenir (Gelecek için Yatırımlar)” programı kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı tarafından yönetilen Fransız Devleti’nin bağışı ile desteklenmiştir. Côte d’Azur ve Avrupa finansman FEDER PRIMI.
Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |