该协议描述了在脂肪酸刺激下人体肠道器官中脂液滴(LD)形成的表征测定。我们讨论了这种测定如何用于LD形成定量,以及如何用于影响LD形成的药物的高通量筛选。
膳食脂质被肠道上皮作为游离脂肪酸(FAs)。这些FA在细胞内转化为甘油三酯(TG)分子,然后被包装成胆小微子,以输送到淋巴或细胞体脂液滴(LDs),用于细胞内储存。在TG合成的最后一步中,二乙二醇丙酸酶(DGAT)的催化活性是LD的形成的关键步骤。LD对缓冲有毒脂质物种和调节不同细胞类型的细胞代谢非常重要。由于人类肠道上皮经常面临高浓度的脂质,LD形成对于调节平衡非常重要。在这里,我们描述了一个简单的测定,在人类肠道有机体中最常见的不饱和脂肪酸(油酸)刺激时,对LD形成(LDF)的表征和定量。LDF 测定基于 LD 特异性荧光染料 LD540,它允许通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞测定对 LD 进行定量。LDF测定可用于表征人类肠道上皮细胞的LD形成,或研究影响LD代谢的人类(遗传)疾病,如DGAT1缺乏症。此外,这种测定也可用于高通量管道,以测试新的治疗化合物,恢复肠道或其他类型的有机体LD形成的缺陷。
脂质是人类饮食的重要组成部分,在系统能量储存和代谢中起着重要的作用。摄入时,膳食脂质通过胰腺脂肪酶降解为游离脂肪酸(FFA)和单甘油酯(MGs)。这些基质然后由肠道上皮的肠细胞吸收,它们首先通过单甘油酯丙酸酶(MGAT)酶重新酯化为二甘油酯(DG),然后通过二乙醇对甘油三酯(TG)进行再酯化乙酰转移酶 1 (DGAT1)1.最后,这些TG被集成到用于出口到淋巴系统的奇洛微米或细胞体脂滴(LDs)用于细胞内存储2,3。虽然需要血小微子将膳食脂质分给其他器官,但细胞内脂肪储存在LD中的重要性并不完全清楚。然而,LDs已被证明在肠道中执行调节功能,因为它们在餐4后缓慢释放脂质到循环16小时。此外,LD已被证明可以防止有毒脂肪酸浓度,如在脂肪条件5小鼠脂肪细胞中。
DGAT1蛋白位于内质视网膜(ER)膜上,在肠道上皮的LD形成中起着至关重要的作用。DGAT1 中的同源突变导致早发性严重腹泻和/或呕吐、低白蛋白血症和/或(致命)蛋白质损失的肠病,在脂肪摄入时出现肠道衰竭,说明 DGAT1 在人体脂质平衡中的重要性肠道上皮6,7,8,9,10。由于DGAT1缺乏症很少发生在人类身上,因此很少获得原发性患者衍生的细胞。此外,肠道上皮细胞的长期培养长期仅限于肿瘤衍生的细胞系,这些细胞系只代表正常生理。因此,DGAT1介导LD的形成主要研究在成纤维细胞或动物源细胞系7,10,11,12。因此,最近显示,DGAT1缺乏患者衍生成纤维细胞积累较少的LD与健康控制细胞在刺激后用油酸(OA)8。
以前,建立协议,培养从任何胃肠道器官的上皮干细胞的形式三维(3D)有机体13。这些肠道器官可以长期保存在培养中13,并允许功能研究患者和肠道位置特异性上皮特征14。它们是遗传和表观稳定的,可以储存,允许长期扩张和生物库13。
我们最近证明,LD形成可以很容易地在人体肠道器官在LD形成(LDF)测定6中测量。当暴露于OA16小时,有机体产生LD,以保护细胞免受脂质引起的毒性。当OA浓度过高时,细胞通过卡巴塞介导凋亡6死亡。LDF测定先前证明主要依赖于DGAT1,如从DGAT1突变患者中提取的有机体以及使用DGAT1特异性抑制剂6所指示的。
对于此处详细描述的 LDF 测定,3D 有机体通过肠道活检培养,每周通过中断进入容易形成新有机物的单细胞。为了运行LDF测定,在24孔板的每个孔中镀有7,500个有机物衍生的单细胞。有机体在几天内形成,用1mM OA孵育过夜,并沾染LD540,一种荧光细胞渗透LD特异性染料,便于成像。然后,通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞仪对 LD 形成进行量化。
通过将此 LD 形成测定扩展至 96 井格式,该测定还可用于 LD 结型的高通量分析,以筛选影响人类肠道器官培养中 LD 形成的新药物,或研究影响 (人类遗传) 疾病LD 代谢。
在这里,我们提供一个协议,以确定在用油酸孵育时人类肠道器官的LD形成。该方法基于LD特异性荧光染料LD54018,它允许在有机体培养物内对脂液滴的总体积进行表征和定量。建立和维持人类肠道器官培养的程序已于13日前公布,并可提供该协议的视觉指南以及15。
该协议的关键步骤是人体肠道器官的培养,以及OA与BSA的适…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢B.Spee慷慨地提供LD540。这项工作得到了荷兰科学研究组织赠款的支持。VIDI 016.146.353) 到 S.M.
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |