मानव आंत्र organoids में लिपिड ड्रॉपलेट गठन की विशेषता और परिमाणीकरण के लिए एक फ्लोरोसेंट आधारित परख
Summary
इस प्रोटोकॉल फैटी एसिड के साथ उत्तेजना पर मानव आंतों organoids में लिपिड छोटी बूंद (एलडी) गठन की विशेषता के लिए एक परख का वर्णन करता है. हम चर्चा कैसे इस परख एलडी गठन के परिमाणीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह कैसे दवाओं है कि LD गठन को प्रभावित करने के लिए उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
आहार लिपिड को आंतों के उपकला द्वारा मुक्त फैटी एसिड (एफए) के रूप में लिया जाता है। इन FAs intracellularly ट्राइग्लिसराइड (TG) अणुओं में परिवर्तित कर रहे हैं, इससे पहले कि वे lymph के लिए परिवहन के लिए या cytosolic लिपिड बूंदों में intracellular भंडारण के लिए chylomicrons में पैक कर रहे हैं. एल डी के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम टीजी संश्लेषण के अंतिम चरण में diacylglycerol acyltransferases (डीजीएटी) के उत्प्रेरक गतिविधि है। एल डी विषाक्त लिपिड प्रजातियों बफर और विभिन्न सेल प्रकार में सेलुलर चयापचय को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. चूंकि मानव आंतों उपकला नियमित रूप से लिपिड के उच्च सांद्रता के साथ सामना किया जाता है, एलडी गठन homeostasis को विनियमित करने के लिए बहुत महत्व का है। यहाँ हम मानव आंतों organoids में सबसे आम असंतृप्त फैटी एसिड, oleic एसिड के साथ उत्तेजना पर एलडी गठन (LDF) की विशेषता और परिमाणीकरण के लिए एक सरल परख का वर्णन. LDF परख LD-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई LD540 पर आधारित है, जो confocal माइक्रोस्कोपी, फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, या प्रवाह साइटोमिति द्वारा एलडी के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है. LDF परख मानव आंतों उपकला कोशिकाओं में एलडी गठन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या मानव का अध्ययन करने के लिए (आनुवंशिक) विकारों है कि एलडी चयापचय को प्रभावित, जैसे DGAT1 की कमी. इसके अलावा, इस परख भी एक उच्च थ्रूपुट पाइप लाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, जो आंतों या organoids के अन्य प्रकार में एलडी गठन में दोष बहाल.
Introduction
लिपिड मानव आहार का एक महत्वपूर्ण घटक हैं और प्रणालीगत ऊर्जा भंडारण और चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जब ingested, आहार लिपिड मुक्त फैटी एसिड में अपमानित कर रहे हैं (FFAs) और monoglycerides (MGs) अग्नाशय lipases द्वारा. इन substrates तो आंतों उपकला के entercytes द्वारा लिया जाता है, जहां वे पहले re-esterified कर रहे हैं diglycerides (डीजी) मोनोग्लाइसराइड acyltransferases द्वारा (MGAT) एंजाइमों और बाद में ट्राइग्लिसराइड्स (टीजी) के लिए dicylglyrol द्वारा acyltransferase 1 (DGAT1)1| अंत में, इन टीजी को इंट्रासेल्यूलर स्टोरेज2,3के लिए लसीका प्रणाली या साइटोसोलिक लिपिड बूंदों (एलडी) के निर्यात के लिए या तो किलोमाइक्रोन में एकीकृत किया जाता है। हालांकि chilomicrons अन्य अंगों के लिए आहार लिपिड वितरित करने के लिए आवश्यक हैं, LDs में intracellular वसा भंडारण के महत्व को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है. हालांकि, एलडी को आंत में एक नियामक कार्य करने के लिए दिखाया गया है, क्योंकि वे धीरे-धीरे भोजन4के बाद 16 एच तक लिपिड को परिसंचरण में छोड़ देते हैं। इसके अलावा, एलडी विषाक्त फैटी एसिड सांद्रता के खिलाफ की रक्षा के लिए दिखाया गया है, जैसे lipolytic शर्तों के दौरान माउस एडिपोसाइट्स में5.
DGAT1 प्रोटीन एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली पर स्थित है और आंतों उपकला में एलडी गठन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। DGAT1 में समयुग्मज उत्परिवर्तनों के कारण प्रारंभिक-ऑनसेट गंभीर दस्त और/या उल्टी, हाइपोएल्बुमिनमिया, और/या (घातक) प्रोटीन खोने वाले आंत्र वसा सेवन पर आंतों की विफलता के साथ आंत्र विफलता के साथ, मानव के लिपिड होमियोस्टेसिस में DGAT1 के महत्व का चित्रण आंत्र उपकला6,7,8,9,10. चूंकि मनुष्यों में DGAT1 की कमी की घटना दुर्लभ है, प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं तक पहुंच दुर्लभ हो गई है। इसके अलावा, आंतों उपकला कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति लंबे समय से ट्यूमर व्युत्पन्न सेल लाइनों जो केवल एक सीमित विस्तार करने के लिए सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है। इसलिए, DGAT1-मध्यस्थ एल डी गठन ज्यादातर फाइब्रोब्लास्ट्स या पशु व्युत्पन्न सेल लाइनों7,10,11,12में अध्ययन किया गया है । इस प्रकार, यह हाल ही में दिखाया गया था कि DGAT1 कमी रोगी व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स oleic एसिड (OA)8के साथ उत्तेजना के बाद स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कम एलडी जमा .
इससे पहले, प्रोटोकॉल तीन आयामी (3 डी) organoids13के रूप में किसी भी जठरांत्र अंग से उपकला स्टेम कोशिकाओं संस्कृति के लिए स्थापित किए गए थे. इन आंतों के organoids13समय की एक लंबी अवधि के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है , और रोगी और आंतों के स्थान विशेष उपकला विशेषताओं14के कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति . वे आनुवंशिक रूप से और phenoआमरूपा स्थिर कर रहे हैं और संग्रहीत किया जा सकता है, लंबी अवधि के विस्तार और biobanking13की अनुमति.
हमने हाल ही में यह प्रदर्शित किया है कि एल डी गठन को मानव आंतों के organoids में एलडी गठन (एलडीएफ) परख 6 में आसानी से मापा जा सकताहै। जब 16 ज के लिए OA के संपर्क में, organoids लिपिड प्रेरित विषाक्तता से कोशिकाओं की रक्षा के लिए LDs उत्पन्न करते हैं. जब OA सांद्रता बहुत अधिक होती है, तो कोशिकाएं कैपेस-मध्यस्थ एपोप्टोसिस6से मर जाती हैं। एलडीएफ परख को पहले DGAT1 पर काफी हद तक निर्भर दिखाया गया था जैसा कि DGAT1-म्यूटेंट रोगियों से प्राप्त organoids द्वारा और DGAT1-विशिष्टअवरोधकों 6के उपयोग द्वारा दर्शाया गया था।
एलडीएफ परख के लिए यहाँ विस्तार से वर्णित, 3 डी organoids आंतों बायोप्सी से सुसंस्कृत हैं और एकल कोशिकाओं है कि आसानी से नए organoids फार्म में व्यवधान से साप्ताहिक पारित कर रहे हैं. एलडीएफ परख चलाने के लिए, $ 7,500 organoid व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में चढ़ाया जाता है. Organoids कई दिनों में गठन कर रहे हैं, 1 एम एम OA के साथ रात भर incubated और LD540 के साथ दाग, एक फ्लोरोसेंट सेल permeable एलडी विशिष्ट डाई कि इमेजिंग की सुविधा. एलडी गठन तो confocal माइक्रोस्कोपी, फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, या प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित है.
एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए इस एलडी गठन परख स्केलिंग करके, परख भी मानव आंतों organoid संस्कृतियों में एलडी गठन को प्रभावित जो उपन्यास दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए LD गठन के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या अध्ययन करने के लिए (मानव आनुवंशिक) विकारों है कि प्रभावित एलडी चयापचय.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम oleic एसिड के साथ ऊष्मायन पर मानव आंतों organoids में एलडी गठन निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस विधि LD-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई LD54018पर आधारित है, जो एक organoid संस्कृति के भीतर लिपि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उदारता से LD540 प्रदान करने के लिए बी Spee धन्यवाद. यह काम वैज्ञानिक अनुसंधान अनुदान के लिए एक नीदरलैंड संगठन द्वारा समर्थित किया गया था (NWO-zonMW; VIDI 016.146.353) से एस.एम.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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