Summary

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

Published: October 06, 2019
doi:

Summary

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

Abstract

각막 내피 세포에 대한 실험 연구는 여러 가지 어려움과 관련이 있습니다. 인간 기증자 각막은 부족하고 일반적으로 이식을 위해 필요로 하기 때문에 실험적인 조사를 위해 드물게 유효합니다. 내피 세포 배양은 종종 생체 내 상황에 잘 번역되지 않습니다. 비 인간 각막의 생체 구조 특성으로 인해 재배 중 기질 부종은 상당한 각막 내피 세포 손실을 유발하여 장기간 재배를 수행하기가 어렵습니다. dextran과 같은 팽창 에이전트는 이 응답을 중화하는 데 사용됩니다. 그러나, 그(것)들은 또한 중요한 내피 세포 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 분해에이전트를 필요로 하지 않는 생체본 장기 배양 모델이 확립되었다. 지역 도축장에서 돼지 눈은 분할 각막 버튼을 준비하는 데 사용되었다. 부분 각막 trephination 후, 각막의 외부 층 (상피, 보만 층, 기질의 부분)을 제거하였다. 이것은 크게 대규모 기질 붓기에 의해 유도 된 각막 내피 세포 손실을 감소시키고 더 긴 재배 기간 동안 Descemet의 막 접는 내피 세포 층의 일반적인 보존을 향상. 후속 완전한 각막 담음은 나머지 눈 전구 및 재배에서 분할 각막 버튼의 제거에 의해 뒤따랐다. 내피 세포 밀도는 경현미경을 사용하여 제제 후 최대 15일(즉, 1일, 8일, 15일)의 후속 시간에 평가하였다. 사용된 준비 기술은 인간 기증자 각막에 필적하는 분할 각막 단추에 있는 느리고 선형 쇠퇴 비율 귀착되는 더 적은 기질 조직 팽윤에 의해 가능하게 된 내피 세포 층의 더 나은 보존을 허용합니다. 이 표준화된 유기학-전형적으로 재배된 연구 모델은 적어도 2주 동안 안정적인 재배를 가능하게 하기 때문에, 인간 기증자 각막에 대한 귀중한 대안으로, 향후 다양한 외부 요인에 대한 조사를 위한 귀중한 대안이 될 수 있습니다. 각막 내피에 미치는 영향.

Introduction

각막 이식 절차는 전 세계적으로 가장 일반적으로 수행 이식 중 하나입니다1. 인간 기증자 각막의 심각한 부족이 있기 때문에, 인간 각막에서 각막 내피 세포를 다루는 실험 연구는 수행하기 어렵다1. 그러나, 눈, 안과 점탄성 장치, 수술 기구 및 기술 (예를 들어, phacoemulsification 기기 및 기술, 초음파 에너지)에서 사용되는 관개 용액 및 기타 물질의 도입은 필요합니다. 임상 사용 전에 각막 내피에 미치는 영향에 관한 유효하고 광범위한 조사.

인간 기증자 각막에 대한 몇 가지 대안은 연구를 위해 존재합니다. 동물 연구 모델은 매우 귀중하지만 동시에 매우 자원 소비와 점점 윤리적으로 의문을 제기. 시험관 내 세포 배양의 주요 단점은 인간의 눈에 그들의 제한 된 번역. 세포 배양에서 얻은 결과는 세포가 내피 중간엽 전이 (EMT)를 겪을 수 있기 때문에 세포 극성의 손실과 세포 모양 및 유전자의 변화로 인한 섬유아세포 와 같은 형태학을 겪을 수 있기 때문에 생체 내 조건에 부합할 수 있습니다. 표현식2.

이전 생체 내 외 모델은 최대 120 h의 재배 기간을보고한 반면, 돼지 각막 내피 내피 장기 배양 모델을 확립하기 위한 새로운 준비 기법은 신선한 돼지 각막을 적어도 15 일 동안 배양하여 최근에 도입되었다3 ,4,5,6. 각막 상피와 기질의 일부가 재배 하기 전에 각막에서 제거 하는 경우 (약 300 전체에서 약 300 μm) 각막의 붓기는 덜 내 피 세포 손실 및 잘 유지 내 피 세포 손실의 결과로 분할 각막 버튼에서 감소 비 분할 각막 단추는 Descemet의 주름의 고르지 않은 기질 팽윤 그리고 대형 때문에 중요한 내피 세포 손실을 보여주기 때문에 15 일까지 후에 세포 층. 눈 은행은 일반적으로 이식 하기 전에 각 막의 붓기를 줄이기 위해 dextran 같은 삼 투 성 팽창 에이전트를 사용. 그러나, 이들 제제는 증가된 내피 세포 손실을 유도하는 것으로 나타났다7,8,9.

이 문서는 분할 각막 단추를 사용하여 각막 내피에 대한 연구를 수행 할 미래의 조사자가 할 수 있도록하기 위해 상세한 단계별 프로토콜에서이 표준화 된 생체 내 비보 연구 모델을 시각화하는 것을 목표로합니다. 이 모형은 안과 점탄성 장치, 관개 해결책 및 초음파 에너지, 또는 각막 내피가 관심있는 그밖 절차와 같은 눈 내의 이용된 물질 그리고 기술을 시험하는 간단한 방법을 나타냅니다.

Protocol

이 프로토콜은 우리 기관의 윤리적 지침을 따릅니다. 우리 기관의 윤리 검토 위원회의 법령에 따라 모든 돼지 각막이 지역 도축장에서 얻어졌기 때문에 실험 전에 윤리적 승인을 받아야했습니다. 1. 장기 문화 돼지 눈을 준비합니다. 지역 도축장에서, 곧 사후 하지만 열 처리 하기 전에 제거 된 돼지 눈을 얻을. 실험실로 눈을 운반하고 몇 시간 이내에 처리합니다….

Representative Results

제시된 해부 기술은 기질 조직의 부분적인 제거를 의미하며, 이로 인해 각막 샘플이 얇아지고 기질 이붓기가줄어듭니다(그림 1 및 그림 2). 적은 기질 팽윤은 각막 내피에 부정적인 충격이 있는 더 적은 전단 및 핀치 힘을 유도합니다, 따라서 더 낮은 내피 세포 손실 비율을 일으키는 원인이되는 6. 분할 각막 단…

Discussion

이 프로토콜은 연구 목적을 위해 표준화되고 저렴한 비용의 생체 내막 내피 내피 내피 모델을 나타내는 돼지 분할 각막 버튼을 제조하는 방법을 제공한다6. 돼지 분할 각막 버튼은 2 주 기간동안눈 은행에서 재배 된 인간 기증자 각막에서 관찰 된 내피 세포 손실에 필적하는 내피 세포 밀도의 감소를 보였다6,10,11,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

제시 된 연구 모델의 설립은 교육 및 연구 독일의 연방 정부의 KMU-innovativ (FKZ : 13GW0037F)에 의해 지원되었다.

Materials

Subject
Pig eyes local abbatoir
Substances
Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016 Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x) Gibco, USA
Fetal calf serum Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution own production
Hypotonic balanced salt solution own production per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9% B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution own production
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well) Corning Inc., USA
Colibri forceps Geuder AG, Germany
Corneal scissors Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder L. Klein, Germany
Eye scissors Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm Whatman, USA
Hockey knife Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL Schott AG, Germany
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm) Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder Geuder AG, Germany
Petri dishes VWR International, USA
Pipette tips Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL) Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm own production
Tying forceps Geuder AG, Germany
Weighing paper neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope Olympus, Japan
CellSens Entry (software) Olympus, Japan
Cold-light source Schott AG, Germany
Incubator Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal VWR International, USA
Photoshop CS2 Adobe Systems, USA
Precision scale Ohaus Europe GmbH, Switzerland

References

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).

Play Video

Cite This Article
Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Steinhorst, N. A., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J. Vis. Exp. (152), e60171, doi:10.3791/60171 (2019).

View Video