Summary
Мы представляем микрофлюидную модель рака на чипе, технологию "Evolution Accelerator", которая обеспечивает управляемую платформу для долгосрочных количественных исследований динамики рака в четко определенных условиях окружающей среды в одноклеточных условиях Уровень. Эта технология, как ожидается, будет работать в качестве модели in vitro для фундаментальных исследований или доклинической разработки лекарственных средств.
Abstract
Традиционная клеточная культура остается наиболее часто используемой доклинической моделью, несмотря на доказанную ограниченную способность прогнозировать клинические результаты рака. Для преодоления разрыва между упрощенными традиционными 2D-культурами и более сложными моделями животных, которые имеют ограниченные возможности для получения надежных и воспроизводимых количественных результатов, были предложены модели микрофлюидного рака на чипе. Здесь мы представляем микрофлюидную модель рака на чипе, которая воспроизводит ключевые компоненты сложной микросреды опухоли комплексным образом, но достаточно проста, чтобы обеспечить надежные количественные описания динамики рака. Эта микрофлюидная модель рака на чипе, "Эволюция ускоритель", разбивает большую популяцию раковых клеток на взаимосвязанный массив микросреды опухоли, генерируя неоднородный химиотерапевтический стресс ландшафта. Прогрессирование и эволюционная динамика рака в ответ на градиент препарата могут контролироваться неделями в режиме реального времени, а многочисленные эксперименты вниз по течению могут быть выполнены в дополнение к замедленному снимкам, сделанным в ходе экспериментов.
Introduction
Рак все шире признается в качестве сложной экосистемы, которая зависит не только от продолжающейся дисрегуляции мутировавших популяций клеток, но и от жизненно важных взаимодействий между раковыми клетками и микроокружением хозяев. В этом смысле рак развивается на адаптивном ландшафте, проявляемом сочетанием факторов, включая разнородную микроокружение опухоли и перекрестный разговор с различными клетками-хозяинами, все из которых способствуют селективному давлению для дальнейшего генетического или эпигенетические изменения1,2,3. В контексте твердых опухолей неравномерное распределение химиотерапевтических и других градиентов ресурсов способствует их молекулярной неоднородности и может играть роль в развитии лекарственной устойчивости, повышенном ангиогенезе к конкретной опухоли субпопуляций, и даже метастаз4,5,6. Обычные исследования культуры 2D-клеток in vitro, обладающие крупномасштабными, удобными экспериментальными возможностями, обеспечивают среднее поле, единую и фикчированную условия, часто не имея точного пространственного и временного экологического контроля, необходимого для подлинного эмулировать динамику опухоли in vivo. Таким образом, существует необходимость в более репрезентативных моделях ex vivo для воспроизведения микроокружения опухоли до животных моделей в конвейере разработки лекарств для лучшего прогнозирования прогрессирования рака, а также реакции на лекарства в динамическом стрессе Пейзажи. Микрофлюитики были предложены для преодоления разрыва между 2D исследования культуры клеток и более сложные исследования in vivo животных, которые не могут быть в состоянии поддерживать контролируемые количественные исследования7,8,9.
Идеальная система in vitro для характеристики динамики раковых клеток должна обладать способностью генерировать неоднородную микросреду для имитации адаптивных клеточных реакций, которые могут иметь место в опухоли, а также позволяют наблюдать за этой динамикой на одноклеточное разрешение. В этой статье мы описываем микрофлюидную платформу культуры клеток, устройство на основе PDMS под названием "Эволюция ускоритель" (EA), что позволяет параллельно в пробирке исследования динамики раковых клеток при клеточном разрешении с получением данных в режиме реального времени над течение недель, в то время как устойчиво поддержания градиентов стресса по всей культуре ландшафта. Дизайн этой платформы основан на нашей предыдущей работе, в которой эволюционная динамика организмов в метапопуляции может быть ускорена10,11. В частности, в группе пространственно разделенных популяций, которые взаимодействуют на определенном уровне, при воздействии неоднородного стрессового ландшафта, наиболее подходящие виды могут доминировать в местной популяции быстрее по сравнению с большой равномерной популяцией. Затем выгодные виды мигрируют в соседние микрохабиты в поисках ресурсов и пространства, и в конечном итоге доминируют над всей популяцией. Как показано на рисунке 1, картина микрофлюидного чипа EA состоит из (i) пары серпантинных каналов, которые обеспечивают свежую циркуляцию носителей и строят фиксированные пограничные условия для химической диффузии, и (ii) область культуры шестиугольных клеток которая состоит из 109 взаимосвязанных шестиугольных и 24 полугексагональных камер в центре, напоминающих сотовую структуру. Глубина чипа составляет 100 мкм. Медиа-каналы и область клеточной культуры связаны с небольшими щелями (около 15 мкм в ширину), которые предотвращают прямой поток носителей и результирующее напряжение сдвига в области клеточной культуры, но все же позволяют химическим веществам распространяться через небольшие щели и обмениваться питательными веществами, метаболических отходов и т.д. Поколение химических градиентов демонстрируется на рисунке 1B, где один медиа-канал содержит 0,1 мМ флуоресцеина, в то время как другой канал свободен от флуоресцеина. Клетки культивируются на газопроницаемой мембране, инкапсулированной микроструктурами через положительное давление спины на мембрану против чипа. Компоненты держателя устройства иллюстрируются на рисунке 2, и экспериментальная установка иллюстрируется на рисунке 3, где культура поддерживается на перевернутом микроскопе при 37 градусах Цельсия, с более чем 85% относительной влажностью, и обусловлена нормоксийный газокомпозиция.
Эта система обеспечивает детальное наблюдение локализованных клеточных взаимодействий через ярко-полевые и флуоресцентные каналы и позволяет пространственно-решено вниз по течению assays, таких как иммунофлуоресценция, Западная поместья, или масс-спектрометрии. Ранее мы продемонстрировали в качестве доказательства принципа этой микрофлюидной модели рака на чипе на долгосрочной совместной культуры эпителиальных и мезенхимальных раковых клеток предстательной железы PC312, а также появление лекарственной устойчивости полиплоидных гигантских гигантских раковые клетки с помощью эпителиальной линии клеток PC313. В то время как мы представляем применение этой платформы, чтобы понять пространственно-временной динамики эпителиальных PC3 и мезенхимальных раковых клеток простаты под градиентом стресса доцетаксел, микрофлюидная система может быть легко применена к любой комбинации клеточных линий и ресурсные (т.е. лекарственные, питательные вещества, кислородные) градиенты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление микрофлюидного устройства
- Создание желаемого микрофлюидного шаблона с помощью программного обеспечения для проектирования макета (см. Дополнительные материалы).
- Изготовить фотомаску. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Используя лазерный писатель, напишите рисунок на содовой известковой стеклянной пластине, покрытой 100 нм Cr и 500 нм фоторезистого АЗ1518.
- Разрабатывайте фотоустойчивость с разработчиком A300MIF на 60 с.
- Выetch от хрома без защиты от photoresist с помощью Cr-7 Chromium Etchant.
- Снимите остаточный фоторезист, используя фотосессию стриптизерши при 70 градусах по Цельсию в течение 45 мин.
- Шаблон фотоустойчивость. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Спинпальто HMDS на кремниевой пластине при 4000 об/мин при 40 с.
- Спинпальто фоторезисповержки A4330 на кремниевой пластине при 4000 об/мин при 40 с.
- Мягкая испечь кремниевую вафу при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 60 с.
- Используйте маску выравниватель подвергать УФ кремниевых пластин.
- Разрабатывайте фотоустойчивость с разработчиком A300MIF в течение 4 минут.
- Выполните dRIE травления. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Сухой-etch узором с photoresist с помощью Силиконовой Глубокой Реактивной ИонEtch (DRIE) системы на 100 мкм глубины.
- Снимите фотоустойчивость с ацетоном и плазменным травкой с плазмой etcher.
- Окисление вафель и силанизация. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Выполните термическое окисление на травленной кремниевой пластине в печи при 1100 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Подождите, пока кремниевая пластина остынет, а затем поместите пластину в обезвреживание с несколькими каплями трихлоро-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-силан (PFOTS) капала в небольшой контейнер возле пластины.
- Насос давление обезопаденности до 0,5 атм при комнатной температуре в течение 60 минут. Кремниевая пластина плесень должна стать гидрофобной после надлежащей силанизации, которые могут быть проверены путем добавления нескольких капель воды на.
- Мягкая литография. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Смешайте пре-полимер и кросс-ссылку (из полиметилсилоксана (PDMS) комплект) на 10:1 по соотношению веса.
- Налейте смешанные PDMS для создания 10 мм пленки в высоту на силанизированных кремния пластины формы.
- Дега в результате PDMS-силиконовой системы в desiccator в течение 30 мин до 1 ч.
- Инкубировать PDMS-силиконовую пластину в инкубаторе 70 градусов на ночь, чтобы вылечить PDMS.
- После того, как PDMS вылечить, очистить пленку PDMS от кремниевой пластины тщательно.
- Используя биопсии иглы, пробить через отверстия в входе портов на основе расположения картины на PDMS и использовать круговой удар, чтобы сократить чипы 27 мм в диаметре.
- Связь слоя PDMS.
- Тепло вылечить две стопки 27 мм PDMS цилиндров (без шаблона), который станет пласт омичегор и укупорки слоя устройства.
- Вырежьте два 7 мм круги вокруг входов на слое резервуара, и использовать биопсии иглы пробить отверстия в входе портов на укупорки слоя.
- Скрепление три стопки PDMS (узорчатый стек, слой резервуара, укупорки слоя) с кислородной плазмы обработки.
- С иглой биопсии, пробить через отверстия в розетках и в центре порта устройства.
2. Подготовка медиа и клеточной линии
- Подготовьте средства массовой информации для культивирования клеточных линий PC3, включая PC3-EMT и PC3-EPI: смесь RPMI 1640 среднего с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1x антибиотик-антимикотик. Создание клеточных линий, как описано ранее14.
ПРИМЕЧАНИЕ: PC3 клеточные линии поддерживаются в вышеуказанных носителях в увлажненных инкубаторах при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Разделение клеток и субкультуры каждые 3 дня, прежде чем они достигнут 100% выпуклость. - Трансфект-клеточные линии с цитоплазмическими флуоресцентными маркерами для лучшей визуализации, как описано ранее12, таким образом, что PC3-EMT выражает цитоплазматическую GFP и PC3-EPI выражает цитоплазматическую mCherry. Обратите внимание, что технология также совместима с любыми флуоресцентными клемками, а также с ярко-полевыми изображениями немаркированных клеток.
3. Экспериментальная установка
- Изготовление держателя металлической пластины
- Изготовить держатель пластины, который достаточно для одновременного хранения газопроницаемых культурных блюд для параллельных экспериментов путем обработки или 3D-печати. Файл 3D CAD ("3-хорошая пластина. FCStd") можно найти на GitHub в качестве справочника (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Отвинтите компоненты держателя(рисунок 2)с отверткой. Дезинфекция компонентов с помощью УФ-облучения, по крайней мере 1 ч и оставить в стерильной среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель предназначен для обеспечения существенных условий для теплового равновесия и идеальных газовых композиций, с впусками газовых каналов, которые обеспечивают воздушный поток. Более подробную информацию можно найти в нашей предыдущей работе12. - Приготовьте до трех газопроницаемых культурных блюд, из которых мембрана клеточной культуры является относительно гибкой.
- Посев наят линии сотовой связи
- За 24 часа до начала эксперимента собирайте PC3-EPI и PC3-EMT-клетки путем трипсинизации в течение 5 мин. Добавьте предотеристые культурные носители, затем центрифуги при 150 х г в течение 3 мин и отбросьте супернатант.
- Подсчитайте клетки каждого PC3-EPI и PC3-EMT с помощью гемоситометра и изолировать в общей сложности 2,5 х 104 каждого типа клеток для каждого газопроницаемого блюда культуры.
- Смешайте и повторно применяйте два типа клеток в 2 мл культурных носителей и семя клеток в каждом из газопроницаемых культурблюдов.
- Оставьте весь держатель пластины в инкубаторе на ночь для клеток, чтобы прикрепить.
- Дезинфекция устройств PDMS с помощью УФ-облучения, по крайней мере 1 ч и оставить в стерильной среде.
- Настройка блока теплового контроля и системы газоснабжения
- Как показано на рисунке 3, создать систему газоснабжения, которая состоит из обоих CO2 и O2 блоки управления, газовый насос, камера смешивания газа, увлажнитель или пузырьк, и три отдельных набора газовых клапанов и датчиков давления. Более подробную информацию можно найти в нашей предыдущей работе12.
- Настройка CO2 и O2 единиц управления таким образом, что они регулируют скорость смешивания газа из CO2 и N2 танков и O2 источника. Кроме того, любая система газоснабжения, которая обеспечивает газ в соответствии с условием нормоксии будет работать.
- Убедитесь, что газ, который сочетается в камере смешивания и увлажняется пузырьком, таким образом, что относительная влажность увеличивается до 85% (как считывается из монитора относительной влажности) и что газ приводит к трем независимым газовым клапанам с датчиками давления для того, чтобы контролировать и контролировать скорость потока газа в держателе пластины.
- Поместите весь держатель пластины в на сцене инкубационного теплового блока управления с отдельными нагревательными подразделениями для крышки и нижней пластины, со всеми блоками, установленными на уровне 37 градусов по Цельсию. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Установка микрофлюидного устройства. Более подробную информацию можно узнать в таблице материалов.
- Определите, что подробные компоненты 3-колодца держателя пластины в порядке, как и на рисунке 2. Каждая из трех скважин идентична и независима, с парой газовых каналов для каждой скважины. Каждая скважина обладает газопроницаемым держателем для культурных блюд, держателем чипов PDMS, стеклянным держателем окон и парой 35-мм стеклянных окон. Эти компоненты могут быть собраны с помощью установленных винтов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные окна гарантируют, что между газопроницаемой культурой мембраной и колодцем есть термически изолированное пространство, что из-за разницы температур на интерфейсе не происходит конденсации воды. Обратите внимание, что 3 скважины являются независимыми, и 3 эксперимента могут быть сделаны отдельно. - Предварительно теплая культурная среда при 37 градусах Цельсия и дегава в вакуумной камере в течение 20 минут.
- Лечить чипы PDMS с помощью кислородной плазменной системы в течение 30 с для поддержания гидрофилики.
- Настройка системы шприца. Загрузите два шприца медленно с ростом средств массовой информации и два других шприцев с желаемым реагентом интереса (СМИ, сми с наркотиками и т.д.). Соедините каждый отдельный шприц к 50-сантиметровой трубе (0.020"x 0.060"OD) 23 G дозирующей иглой в одну полую стальную штифт. Вставьте полый стальной штифт на другом конце трубки.
- Прайм трубки и вставить стальной штифт в каждый чип PDMS через укупорки слоя. Заполните слой резервуара и промокните узор омрачаемого узором pdMS со средствами массовой информации. Слой резервуара работает как ловушка пузыря на чипе для предотвращения попадания пузырьков воздуха в микрофлюидную картину.
- Загрузите 1 мл шприца с культурой средств массовой информации. Подключите шприц к 5-сантиметровой трубке (0,020" х 0,060"OD) 23 G дозирующей иглой в одну полую стальную штифт. Вставьте полый стальной штифт в другой конец трубки и премьер трубки.
- Вставьте полый стальной штифт в центральное отверстие чипа, где чрезмерное носители могут быть извлечены из чипа позже во время процесса уплотнения чипа.
- Поскольку каждое устройство PDMS требует четырех шприцев объемом 10 мл, загруженных на шприц-насос, загрузите два шприца объемом 10 мл на чип в передсобой палубу. Поместите два других шприца в палубу шприца.
- Поместите чип непосредственно на верхней части газопроницаемых культурных мембран (с клетками, уже прилипаемыми к мембранам). Для того, чтобы избежать захвата микропузырей в микрофлюидной картины, распределять 1 мл предварительно разогретых и дегазированных средств массовой информации в 35 мм газпроницаемой культуры блюдо перед сборкой, а затем убедитесь, что чип приближается к жидкой поверхности с углом наклона 15 градусов.
- Зажимайте газпроницаемое блюдо культуры и колодец в газопроницаемом держателе блюда культуры для каждого чипа, с держателем чипа PDMS, толкающим устройство PDMS вниз.
- Лента лист герметика на верхней части устройства PDMS и зажим с держателем чипа PDMS для того, чтобы предотвратить чип от высыхания.
- Установите скорость потока носителей вокруг массива, чтобы быть 20 л/ч.
- Установите всю пластину в инкубатор на сцене на моторизованной стадии перевернутого микроскопа. Подключите систему газоснабжения к газовым каналам и поддавлением газопроницаемой культуры мембраны против установленного чипа PDMS для обеспечения герметизации устройства. Поддерживайте давление на уровне 0,2 пси (1,4 x 104 Па).
- Медленно извлекайте излишнюю среду в чипе, используя 1-мл шприц из центрального отверстия. Наблюдайте за чипом под микроскопом при извлечении носителей, а затем прекратите извлечение, когда чип запечатан. Чип уплотнения должно быть очевидным, поскольку часть клеток будет раздавлена микро-структур.
- Соедините блок датчика температуры инкубатора на сцене к 3-хорошей пластине и установите до 37 градусов по Цельсию.
- Определите, что подробные компоненты 3-колодца держателя пластины в порядке, как и на рисунке 2. Каждая из трех скважин идентична и независима, с парой газовых каналов для каждой скважины. Каждая скважина обладает газопроницаемым держателем для культурных блюд, держателем чипов PDMS, стеклянным держателем окон и парой 35-мм стеклянных окон. Эти компоненты могут быть собраны с помощью установленных винтов.
4. Одноклеточная замедленной визуализации
- Настройка программного обеспечения для визуализации, используя перевернутый микроскоп, для приобретения изображений замедленного действия. Обратите внимание, что для эксперимента EA требуется перевернутый флуоресцентный микроскоп с полностью моторизованной стадией x-y, фокусной ручкой, затвором и фильтром кубиков.
- Настроите программное обеспечение для получения изображений по двум каналам при 10-кратным увеличением для каждого чипа с автоматическим сшиванием изображений после одного раунда автофокусировки. Имейте в виду, что системы автоматической коррекции, такие как Perfect Focus, не гарантируют удовлетворительное качество изображения. Более рекомендуется создавать индивидуальную поверхность фокусировки для долгосрочного приобретения изображения на основе автофокуса или ручного фокуса на чипе.
- Снимайте изображения каждый час и оставляйте эксперимент, работающий по временной шкале недель. Мониторинг качества изображения на ежедневной основе и обновления фокусной поверхности, если это необходимо.
- Подготовьте чип PDMS и газопроницаемую культурную тарелку для последующего иммунофлуоресцентного анализа, как описано ранее13.
5. Обработка и анализ изображений
- Постэкспериментальная обработка
- Преобразование изображений в формат TIFF для обработки изображений и измерений с использованием Фиджи/ImageJ.
- Сжимать файлы TIFF для удобства дальнейшей обработки изображений.
- Анализ Фиджи/ImageJ
- Для идентификации клеток выполните фоновое вычитание и анализ частиц для выявления флуоресцентных ярких пятен для обнаружения местоположения клеток и автоматического подсчета клеток.
- Используйте плагины (Ручное отслеживание, химиотаксис, инструмент миграции, Trackmate) для анализа подвижности и миграции клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проверка оптимального роста клеток на чипе
Основной целью экспериментальной платформы является воспроизводство ключевых компонентов и взаимодействий в сложной микросреде опухоли комплексным образом, но достаточно простым, чтобы обеспечить количественные, надежные и воспроизводимые данные. Эта цель может быть достигнута только в том случае, если мы полностью контролируем физические и биохимические факторы окружающей среды. Мы должны либо исключить нежелательные факторы, либо найти способ включить неконтролируемые факторы в количественную модель, чтобы правильно интерпретировать поведение населения.
Первый тест заключается в обеспечении оптимального роста клеток на устройстве. Скорость пролиферации клеток на устройстве должна быть идентичной или сопоставимой с их профилем роста в обычной культуре клеток. В качестве доказательства принципа, человеческой линии рака простаты линии PC3 клетки были культивированы в чипе PDMS без присутствия внешнего стресса. Эти клетки были флуоресцентно помечены в цитоплазме, чтобы мы могли наблюдать и количественно популяции клеток с помощью перевернутой флуоресцентной микроскопии. Слияние клеток, определяемое как область, охватываемая клетками, измерялось в каждом микрохабее в разные временные рамки с учетом выбранного порога интенсивности на флуоресцентных изображениях с использованием Фиджи15. Кривые роста клеток в каждом выбранном положении нарисованы на рисунке 4. Выбранные позиции разбросаны по всему чипу, от региона вблизи вершины притока средств массовой информации до вершины, близкой к средствам массовой информации.
Кривые роста на рисунке 4B хорошо выровнены, что позволяет предположить идентичность профиля пролиферации клеток как функции расположения на чипе. Первоначальный наклон кривых показывает скорость распространения. Время удвоения для ячеек в устройстве составляет около 24 часов, как показано на рисунке 4B от времени от 0 до 24 часов, что является таким же, как удвоение времени в обычных cultureware13. Таким образом, мы приходим к выводу, что без наличия внешнего источника стресса, физические и биохимические факторы равномерно распределены, что приводит к однородной и оптимизированной роста клеток от времени 50 до 100 часов.
Мы также рассмотрели возможность количественной оценки динамики клеток между субпопуляциями в микросреде. GFP-выражение PC3-EMT и mCherry-выражения PC3-EPI клеточные линии были совместно культивированы в Е.А., как показано на рисунке 5. Слияние клеток, определяемое как процентная доля площади, охватываемой клетками, измеряется как указание на численность населения. Начиная с 40% слияния, со-культура выросла полностью слияния в течение 3 дней. Интересно, что мы можем наблюдать прогрессирование каждого фенотипа в микросреде. В то время как кривая роста общего слияния находится в форме логистической модели роста, численность населения PC3-EMT продолжала расширяться, а PC3-EPI был подавлен в асимметричной фазе.
Демонстрация ассесии подвижности клеток в смешанной популяции
Подвижность клеток является важным фенотипическим поведением. Распределение подвижности популяции может дать информацию о физическом взаимодействии клеток, механических свойствах местной микросреды, а иногда может быть проанализировано как признак эпигенетической вариации клеток. Учитывая, что наша улучшенная платформа культуры клеток позволяет почти непрерывное изображение, преимущество наличия тонкого временного разрешения максимизирует потенциал отслеживания одной ячейки в неоднородной популяции.
Мы используем плагин TrackMate16 на Фиджи (http://fiji.sc) с индивидуальным макросом для реализации и автоматизации процесса отслеживания. TrackMate позволяет пользователю реализовать и настроить алгоритм отслеживания с помощью языка скриптов из редактора скриптов Фиджи. Процесс отслеживания разделен на ряд этапов: процессы сегментации, фильтрации и связывания частиц.
Как показано на рисунке 6B, мы выполнили "раны исцеления асссеев" в качестве демонстрации для изучения коллективной миграции клеток и клеточной клетки взаимодействия. Pc3-EPI и PC3-EMT клетки были плотно посеяны в центре устройства и было разрешено свободно мигрировать в пустую область. Нормализованная гистограмма скорости обоих фенотипов построена на рисунке 6C. Скорость PC3-EMT была значительно выше, чем PC3-EPI в 1,8 раза, что согласуется с тем, что мезенхимальный фенотип служит компонентом заживления кожных ран с исключительной способностью мигрировать в отличие от сопоставимого стационарный эпителиальный фенотип.
Кроме того, для того, чтобы наблюдать прогрессирование подвижности клеток в среде, свободной от стресса, мы выполнили долгосрочную кокультуру PC3-EPI и PC3-EMT с равномерной начальной плотностью посева и отслеживали распределение скорости клеток, меняющейся со временем. Как показано на рисунке 7A,B, после 6 дней культуры, как клетки достигли более высокого слияния, распределение скорости клеток для обоих фенотипов наклонился к левым хвостам.
Мы можем сравнить соотношение количества PC3-EPI к PC3-EMT в каждом интервале класса. Как показано на рисунке 7C, независимо от дней культуры или плотности клеток, PC3-EMT доминировали высокоскоростной области в то время как PC3-EPI занимал низкую скорость зоны. Хотя общая скорость значительно снизилась для обоих фенотипов, PC3-EMT оставался motile и был затронут меньше переполненности микросреды, как показано на рисунке 7D. Средняя скорость PC3-EPI упала примерно на 40%, в то время как скорость PC3-EMT упала только на 14%.
Есть несколько факторов, которые могут повлиять на распределение скорости клеток и средней скорости, такие как переполненность населения. Непрерывное отслеживание клеток и мониторинг всей субпопуляции имеет важное значение для понимания прогрессирования фенотипического поведения. Например, если бы мы хотели количественно определять уровень мезенхимального статуса немаркированной субпопуляции, было бы более информативным приобретать не только распределение физического количества (например, скорость) заинтересованного субпопуляции в качестве функции время, но и все остальные сосуществующие субпопуляции клеток.
Рисунок 1: Микрофлюидный чип EA, управляемый шприцем. (A) Микрофлюидическое устройство имеет два отдельных средних впуска, две розетки, и один центральный порт для посева клеток или извлечения чрезмерной среды. Обратите внимание, что между средними входами и массивами клеточной культуры, пара серпантинов каналов, которые позволяют среде уравновесить с атмосферой, проданной ниже газопроницаемой мембраны. (B) Поколение градиента. Шприцы насос анактирует среду с 0,1 мМ флуоресцеина и не флуоресцейн соответственно в чип через 2 средних входов справа, извлеченные из чипа на 2 средних розеток слева. Концентрация флуоресцеина пропорциональна интенсивности флуоресценционного сигнала, и профилируется вблизи средних заливов /выходов а и вблизи центра b. Рисунок воспроизводится с разрешения Lin et al. 201712. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Компоненты настроенной 3 хорошо образца пластины. (a)основное тело 3 хорошо пластины; (б)пара газовых каналов, которые позволяют прокачивать и вытекала через септу на входе в газовые каналы, которые позволяют закачивать кондиционированную атмосферу; (c)O-кольцо, предназначенное для уплотнения пространства между пластиной скважины и газопроницаемым культурным блюдом; (d)газпроницаемое блюдо культуры диаметром 35 мм; (e)держатель тарелки; (f)устройство PDMS; (g)держатели чипов PDMS; (h)двухслойные 35-мм стеклянные окна, предназначенные для поддержания теплоизоляции и предотвращения конденсации воды; (i)держатель стеклянного окна; (j)грелки; (k)датчик температуры; (l) Клейковый уплотнитель, который удерживает чип от высыхания. Рисунок, воспроизведенный с разрешения Lin et al. 201712. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схематическая фигура экспериментальной установки. Настройка эксперимента, включая систему газоснабжения, подключение газовых каналов, связь со средним энергоснабжением и систему визуализации. Рисунок, воспроизведенный с разрешения Lin et al. 201712. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Кривые роста PC3 в EA без стресса. PC3 культивировались в EA без присутствия внешнего стресса. (A) Шаблон EA с метками положения. (B) Кривые роста PC3 на выбранных позициях с точки зрения слияния клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Со-культура PC3-EPI и PC3-EMT в EA без стресса. PC3-EPI (красный) и PC3-EMT (зеленый) были совместно культивированы в EA без присутствия внешнего стресса. (A) Наложение двух флуоресцентных каналов на т 0 ч. (B) Флуоресцентное изображение, сделанное на т й 95 ч. (C) Кривые роста с точки зрения слияния клеток. Слияние клеток каждого типа клеток измерялось на всем чипе. Каждая точка данных представляет собой среднее слияние клеток в 3 последовательных временных точек, взятых с интервалом 15 минут. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение слияния клеток в 3 последовательных временных пунктах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Контроль подвижности клеток в смешанной популяции. Демонстрация производительности отслеживания одной ячейки в смешанной популяции. (A) Демонстрация того, как клетки обнаружены Laplacian гауссианской (LoG) сегментации. Круги указывают расположение ячеек, обнаруженных алгоритмом LoG. Обнаруженные ячейки связаны от кадра к кадру на основе линейной задачи назначения для количественной оценки подвижности клеток. (B) "раны исцеления асссеция" PC3-EPI и PC3-EMT совместной культуры эксперимента. Клетки были посеяны локально до 100% слияния с четкой границей в центре. После установки чипа EA, клетки были замечены мигрировать через массив микрохаба, как указано белыми стрелками. (C) Нормализованная гистограмма подвижности клеток. PC3-EMT быстрее, чем PC3-EPI в 1,8 раза. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение 5 образцов эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Использование подвижности долгосрочной совместной культуры PC3-EPI и PC3-EMT. Долгосрочная культура PC3-EPI и PC3-EMT с равномерной начальной плотностью посева. Распределение скорости клеток меняется со временем. (A)Нормализованное распределение скорости ячейки на день 2. (B) Нормализованное распределение скорости ячейки на 6-й день. (C) Соотношение количества PC3-EPI к PC3-EMT в каждом интервале класса. (D) Средняя скорость PC3-EPI и PC3-EMT как функция времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционная клеточная культура была разработана почти сто лет назад и остается наиболее часто используемой доклинической моделью в биомедицинских исследованиях, несмотря на доказанную ограниченную способность предсказывать клинические результаты при раке17. Модели животных предлагают самую высокую физиологическую значимость и разумное генетическое сходство с людьми, но уже давно признаны, что имеют значительные ограничения в прогнозировании исходов человека18. Среди всех существующих доклинических моделей, микрофлюидных рака на чипе модели, как представляется, наиболее перспективным кандидатом для удовлетворения неудовлетворенных потребностей в исследовании рака9,19,20. Тем не менее, современные модели рака на чипе до сих пор не предлагают платформу, которая способна воспроизводить ключевые компоненты и взаимодействия, чтобы имитировать микроокружение опухоли всеобъемлющим образом, но достаточно просто, чтобы обеспечить надежные и воспроизводимые количественные данные. Наши репрезентативные данные показывают, что наша технология микрофлюидной культуры клеток обеспечивает стабильные физические и биохимические условия для долгосрочной клеточной культуры в неоднородных микросредах. Эта многофункциональная платформа позволяет сложно корректировать зависящий от времени химический градиент, а также состав окружающего газа. Платформа является портативной и совместимой для большинства флуоресцентных перевернутых микроскопов для визуализации в реальном времени с высоким разрешением, которая предлагает многомерную информацию о клетках в качестве функции времени, включая морфологию клеток, динамику популяции, клетки подвижность и миграция клеток на одноклеточном уровне.
По сравнению с нашей предыдущей работой11, мы отмечаем, что это давление уплотнения упаковки и сборки метод для нашего микрофлюидного устройства позволяет многочисленные вниз по течению экспериментальных мощностей (например, FACS, локальная добыча метаболита, субклональных популяций расширение, ЕСЛИ, ДНК / РНК FISH и т.д.) дополняют замедленного изображения, сделанные в ходе экспериментов. Эта возможность удаления клеток из конкретных мест в гетерогенной культуре является важным достижением по сравнению с предыдущими устройствами, где уплотнительная поверхность чипа должна была быть удалена, прежде чем можно было получить доступ к культуре11. Кроме того, даже в этом случае, акт удаления покрытия значительно нарушил культуру, так что местное тестирование клеток на одном или нескольких уровнях среды обитания было невозможно. Такая локализованная добыча стала возможной в нашем случае благодаря мягкому «запечатываемому» характеру гибкой газопроницаемой мембраны.
В представленном протоколе есть несколько важных шагов. Прежде всего, чтобы начать долгосрочный эксперимент со стабильной текучей динамикой, необходимо как можно больше избегать микропузырей. Поэтому важно предварительно разогреть и дегазировать культурную среду (шаг 3.4.2) перед загрузкой носителя в шприцы. Манипуляция медиа-загрузкой и дозированием должна проводиться медленно и осторожно, чтобы предотвратить образование пузырьков. Шаблон PDMS следует обрабатывать кислородной плазмой (шаг 3.4.3) перед подключением к системе питания носителей культуры. Обработка кислородной плазмы обеспечивает гидрофиличность поверхности PDMS и значительно снижает вероятность захвата микропузыря. В шаге 3.4.7., при размещении чипа на верхней части мембраны культуры клеток, чип PDMS должен приближаться к жидкой поверхности с углом наклона 15 градусов, чтобы избавиться от пузырьков (если таковые имеются) на жидкой поверхности внутри культуры блюдо. Во-вторых, метод герметизации давления требует стабильной системы газоснабжения, которая давит на мембрану клеточной культуры. Давление должно быть установлено между 0,2 до 0,6 пси. Давление ниже 0,2 пси недостаточно для уплотнения чипов. Выше 1,2 пси, значительное количество газа будет проникать через мембрану и генерировать пузырьки в микрофлюидной картины. Мы отмечаем, что если компоненты металлической 3-луковой пластины не собраны должным образом (включая корпус пластины, держатель тарелки, проницаемой газом, держатель чипа PDMS, держатель стеклянного окна, O-кольца, и пара 35-мм стеклянных окон), то можно было бы определить утечку газа как показания давления будут безответными к увеличению потока газа. Проблема утечки может быть решена просто путем проведения теста на утечку, а затем повторной сборки компонентов.
Основной формой данных, полученных с использованием технологии EA, является визуализация. Как упоминалось ранее, технология EA может быть установлена на любой перевернутый микроскоп. Однако, чтобы в полной мере использовать преимущества системы, настоятельно рекомендуется установить систему на перевернутый флуоресцентный микроскоп, оснащенный полностью моторизованной стадией x-y, моторизованной фокусной ручкой, моторизованным затвором и моторизованным кубом фильтра. Кроме того, имейте в виду, что Perfect Focus не может гарантировать удовлетворительное качество изображения. Мы предлагаем использовать программное обеспечение для визуализации, которое позволяет многомерное приобретение изображений и настраиваемый сценарий изображения. Поддержание хорошо сфокусированных изображений может быть сложной задачей без периодической (каждые 24 часа или 48 часов) команды автофокуса, которая генерировала индивидуальную поверхность фокусировки во время цикла приобретения изображения.
Представленная микрофлюидная технология EA была внедрена для изучения адаптации и эволюции динамики метапопуляций раковых клеток простаты под химиотерапевтическим стрессовым ландшафтом12. Мы также продемонстрировали появление полиплоидных полиплоидных ячеек гигантов лекарственной устойчивости в этой опухолевой неоднородной микроэкологии, показывая, что экологическая гетерогенность в сочетании с клеточной миграцией внутри популяции опухолей вызовет усиление о появлении устойчивых фенотипов13. С возможностью контролировать и контролировать поведение смешанных популяций опухолевых клеток под хорошо контролируемыми градиентами стресса, наша микрофлюидная технология EA может также служить платформой для изучения механизмов регулирования и фенотипической трансформации, участвующей в EMT в контексте рака терапевтических стратегий21. И последнее, но не менее важное: представленный метод уплотнения давления может быть также реализован в других микрофлюидных системах, которые требуют сложной корректировки состава окружающего газа, а также возможностей для экспериментов вниз по течению. Например, тот же метод упаковки был использован для включения различных микрофлюидных шаблон для изучения того, как бактериальные волны популяции размножаться через физические барьеры22.
Таким образом, коллективная динамика населения качественно отличается от одноклеточного поведения. Микрофлюидическая технология EA позволяет количественно изучать эволюционную динамику и фенотипическое поведение индивидуально и коллективно в качестве функции времени. Эта технология может представить более физиологически релевантную модель in vitro для исследования рака, и потенциально для доклинического развития и скрининга препарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не было заявлено.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
