Generering af heterogene stof gradienter på tværs af Cancer populationer på en Microfluidic Evolution Accelerator for real-time observation

Summary

Vi præsenterer en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, "Evolution Accelerator" teknologi, som giver en kontrollerbar platform for langsigtede real-time kvantitative undersøgelser af Cancer dynamik inden for veldefinerede miljømæssige forhold på enkelt-celle Niveau. Denne teknologi forventes at fungere som en in vitro-model for grundforskning eller præklinisk lægemiddeludvikling.

Abstract

Konventionel cellekultur er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model, på trods af dens påviste begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i cancer. Microfluidic Cancer-on-chip-modeller er blevet foreslået for at bygge bro mellem de overforenklede konventionelle 2D-kulturer og mere komplicerede dyremodeller, som har begrænset evne til at producere pålidelige og reproducerbare kvantitative resultater. Her præsenterer vi en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, der gengiver centrale komponenter i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men er enkel nok til at give robuste kvantitative beskrivelser af kræft dynamik. Denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model, "Evolution Accelerator," nedbryder en stor population af kræftceller i en sammenkoblet vifte af tumor mikromiljøer samtidig generere en heterogene kemoterapeutiske stress landskab. Progression og evolutionære dynamik kræft som reaktion på narkotika gradient kan overvåges i ugevis i realtid, og talrige downstream eksperimenter kan udføres supplerer de tidsforskudt billeder taget gennemløbet af eksperimenter.

Introduction

Kræft er i stigende grad blevet anerkendt som et komplekst økosystem, der ikke kun afhænger af den fortsatte dysregulering af muterede cellepopulationer, men også af vitale interaktioner mellem kræftceller og værts mikromiljøet. I denne forstand udvikler kræften sig på et adaptivt landskab, der manifesteres ved en kombination af faktorer, herunder et heterogent tumor mikromiljø og kryds stilk med en række værtsceller, som alle bidrager med selektivt pres for yderligere genetiske eller Epigenetiske ændringer^1,2,3. I forbindelse med solide tumorer, ulige fordeling af kemoterapeutika og andre ressource gradienter bidrager til deres molekylære heterogenitet og kan spille en rolle i udviklingen af resistens over for lægemidler, øget angiogenese til særlige tumor subpopulationer, og endda metastase^4,5,6. Konventionelle in vitro 2D cellekultur undersøgelser, mens besidder storstilet, praktisk eksperimentel kapacitet, giver middel-felt, ensartede, og faste betingelser, ofte mangler den præcise rumlige og tidsmæssige miljøkontrol nødvendig for virkelig emulere in vivo tumor dynamik. Der er således behov for mere repræsentative ex vivo-modeller til reproduktion af tumor mikromiljøet forud for dyremodeller i narkotika udviklings rørledningen for at opnå en bedre forudsigelse af kræft progression samt reaktioner på lægemidler inden for dynamisk stress Landskaber. Mikrofluidics er blevet foreslået for at bygge bro over kløften mellem 2D cellekultur studier og mere komplekse in vivo dyreforsøg, der muligvis ikke kan understøtte kontrollerbar kvantitativ undersøgelse^7,8,9.

En ideel in vitro-system til at karakterisere kræft celle dynamik bør besidde evnen til at generere en heterogen mikromiljø til at efterligne adaptive cellulære reaktioner, der kan finde sted i en tumor, samt give mulighed for observation af disse dynamikker på en enkelt celle opløsning. I denne artikel beskriver vi en mikrofluidic cellekultur platform, en PDMS-baseret enhed kaldet "Evolution Accelerator" (EA), der giver mulighed for parallelle in vitro-undersøgelser af cancer celle dynamik ved cellulær opløsning med realtidsdata indsamling over løbet af uger, mens stabilt fastholde gradienter af stress på tværs af kulturlandskab. Udformningen af denne platform er baseret på vores tidligere arbejde, hvor den evolutionære dynamik af organismer i en Tjurer kan accelereres^10,11. Specifikt i en gruppe af rumligt adskilte populationer, der interagerer på et eller andet niveau, når de udsættes for et heterogene stress landskab, de mest fit arter kan dominere i en lokalbefolkning hurtigere sammenlignet med en stor ensartet population. De fordelagtige arter derefter migrere til tilstødende mikrohabitater i søgen efter ressourcer og plads, og i sidste ende dominere hele befolkningen. Som vist i figur 1består mønsteret af den mikrofluidiske EA-chip af (i) et par Serpentine kanaler, der giver frisk medie cirkulation og konstruerer fast Grænsebetingelser for kemisk diffusion, og II) det sekskantede celle dyrkningsområde som består 109 indbyrdes forbundne sekskantede og 24 halvt-sekskantede kamre i midten, der ligner en honeycomb struktur. Chippen er 100 μm i dybden. Mediekanaler og cellekultur region er forbundet med små slidser (ca. 15 μm bred), som forhindrer direkte medieflow og den resulterende forskydningsbelastning på tværs af cellekultur området, men stadig tillader kemikalier at diffus gennem små slidser og udveksle næringsstoffer, metabolisk affald osv. Genereringen af kemiske gradienter er påvist i figur 1B, hvor en mediekanal indeholder 0,1 mm fluorescein, mens den anden kanal er fri for fluorescein. Celler dyrkes på en gasgennemtrængelig membran, indkapslet af mikrostrukturerne gennem det positive tilbage tryk på membranen mod chippen. Komponenterne i anordningen er illustreret i figur 2, og den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 3, hvor kulturen holdes på et inverteret mikroskop ved 37 °c, med over 85% relativ luftfugtighed, og konditioneret under normoxia gas sammensætning.

Dette system giver detaljeret observation af lokaliserede cellulære interaktioner via lysfelt og fluorescerende kanaler og giver mulighed for rumligt løste downstream-assays såsom immunofluorescence, Western blot, eller massespektrometri. Vi har tidligere demonstreret som en proof-of-princip af denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model på lang sigt Co-kultur af epitelial og mesenchymal PC3 prostatacancer celler¹² samt fremkomsten af Drug-resistens polyploide gigant kræftceller ved hjælp af epitelial PC3 cellelinje¹³. Mens vi præsenterer anvendelsen af denne platform til at forstå den rumlige dynamik af epitelial PC3 og mesenchymal prostatacancer celler under en stress gradient af Docetaxel, kan det mikrofluidisk system let anvendes til enhver kombination af cellelinjer og ressource (dvs. stoffer, næringsstoffer, ilt) gradienter.

Protocol

1. fabrikation af mikrofluidisk-enhed

1. Generer det ønskede mikrofluidisk mønster ved hjælp af et layout design software (Se supplerende materialer).
2. Fabrikere photomask. Se tabel over materialer for flere detaljer.
   1. Ved hjælp af en laser forfatter, skrive mønsteret på en sodavand glasplade belagt med 100 nm af CR og 500 nm af fotoresist AZ1518.
   2. Udvikle fotoresist med Developer AZ300MIF for 60 s.
   3. Etch væk chrom uden beskyttelse fra fotoresist ved hjælp af CR-7 chrom etchant.
   4. Strip off resterende fotoresist ved hjælp af en fotoresist stripper ved 70 °c for 45 min.
3. Mønster den photoresist. Se tabel over materialer for flere detaljer.
   1. Spin coat HMDS på silicium wafer ved 4000 rpm for 40 s.
   2. Spin coat fotoresist AZ4330 på silicium wafer ved 4000 rpm for 40 s.
   3. Blød bage silicium wafer ved 95 °C for 60 s.
   4. Udnyt masken aligner at udsætte UV til silicium wafer.
   5. Udvikle fotoresist med udvikleren AZ300MIF for 4 min.
4. Udfør DRIE ætsning. Se tabel over materialer for flere detaljer.
   1. Tør-etch wafer mønstret med fotoresist ved hjælp af et silicium dyb reaktivt ionetching (Drie) system til 100 μm dybde.
   2. Strip af fotoresist med acetone og plasma etch med en plasma etcher.
5. Oxidation og silanization. Se tabel over materialer for flere detaljer.
   1. Udfør termisk oxidation på den ætsede silicium wafer i en ovn ved 1100 °C i 1 time.
   2. Vent til silicium wafer at køle ned, og derefter placere wafer i en ekssikkator med et par dråber trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl-SILANE (pfots) dryppet i en lille beholder nær wafer.
   3. Pump trykket af ekssikkator til 0,5 ATM ved stuetemperatur for 60 min. Silicium wafer mug bør blive hydrofobe efter korrekt silanization, som kan testes ved at tilføje flere dråber vand på wafer.
6. Blød litografi. Se tabel over materialer for flere detaljer.
   1. Bland præ-polymer og Cross-linker (fra polymethylsiloxan (PDMS) Kit) ved en 10:1 efter vægt ratio.
   2. Hæld de blandede PDMS til at skabe en 10 mm film i højden på den silaniseret glasuld silicium wafer skimmel.
   3. Degas det resulterende PDMS-Silicon wafer system i en ekssikkator i 30 min til 1 h.
   4. Der inkubaterer PDMS-Silicon wafer i en 70 °C inkubator natten over for at helbrede PDMS.
   5. Når PDMS er helbredt, skræl PDMS-filmen ud af siliciumwaferen omhyggeligt.
   6. Ved hjælp af biopsi nåle, punch gennem-huller i indgangsportene baseret på placeringen af mønsteret på PDMS og ansætte en cirkulær punch til at skære chips 27 mm i diameter.
7. PDMS lag bonding.
   1. Varme kur to stakke af 27 mm PDMS cylindre (uden mønster), som vil blive reservoiret lag og capping lag af enheden.
   2. Skær ud to 7 mm cirkler omkring indsugningerne på reservoiret lag, og udnytte en biopsi nål til punch gennem-huller ved indløbs portene på capping lag.
   3. Bond tre stakke af PDMS (mønstrede stak, reservoir lag, capping Layer) med ilt plasma behandling.
   4. Med biopsi nål, punch gennem-huller i afsætningsmulighederne og den midterste port af enheden.

2. forberedelse af medier og cellelinje

1. Forbered medier til dyrkning af PC3-cellelinjer, herunder PC3-EMT og PC3-EPI: Bland RPMI 1640-mediet med 10% føtal bovin serum (FBS) og 1x antibiotikum-antimykotisk. Generer cellelinjer som beskrevet tidligere¹⁴.
   Bemærk: PC3-cellelinjer vedligeholdes i ovennævnte medier i befugdede inkubatorer ved 37 °C med 5% CO₂. Split celler og subkultur hver 3 dage, før de når 100% konfluency.
2. Transfect cellelinjer med cytoplasmisk-mærket fluorescerende markører for bedre visualisering, som beskrevet tidligere¹², sådan at PC3-EMT udtrykker CYTOPLASMISK gfp og PC3-EPI udtrykker cytoplasmisk mcherry. Bemærk, at teknologien også er kompatibel med fluorescerende celler samt lysfelt Imaging af ikke-mærkede celler.

3. eksperimentel opsætning

1. Fabrikation af metalplade holder
   1. Fabrikere en plade holder, der er tilstrækkelig til at holde samtidige gas-permeable kultur retter til parallelle eksperimenter ved bearbejdning eller 3D-udskrivning. 3D CAD-filen ("3-brønd plade. FCStd ") kan findes på GitHub som en reference (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
   2. Skru komponenterne i holderen (figur 2) af med en skruetrækker. Desinficer komponenterne via UV-eksponering i mindst 1 time og Efterlad i et sterilt miljø.
      Bemærk: holderen er designet til at give betydelige betingelser for termisk ligevægt og ideelle gassammensætninger, med gas kanal indløb, der giver mulighed for luftstrøm. Flere detaljer kan findes i vores tidligere arbejde¹².
   3. Forbered op til tre gas-permeable kultur retter, som cellekultur membranen er relativt fleksibel.
2. Cellelinje såning
   1. 24 timer før eksperimentet påbegyndes, høst PC3-EPI og PC3-EMT celler ved trypsinisering i 5 min. Tilsæt prewarmede kultur medier, og centrifuger derefter ved 150 x g i 3 min. og kassér supernatanten.
   2. Tæl cellerne i hver PC3-EPI og PC3-EMT ved hjælp af et hemocytometer og Isoler i alt 2,5 x 10⁴ af hver celletype for hver gasgennemtrængelig kultur skål.
   3. Bland og resuspendere de to celletyper i 2 mL kultur medier og frø cellerne i hver af de gasgennemtrængelige kultur skål.
   4. Lad hele plade holderen stå i inkubator natten over, for at cellerne skal fastgøres.
   5. Desinficer PDMS-enhederne via UV-eksponering i mindst 1 time og Efterlad i et sterilt miljø.
3. Opsætning af termisk styreenhed og gasforsyningssystem
   1. Som vist i figur 3, oprette et gasforsyningssystem, der består af både Co₂ og O₂ styreenheder, en gaspumpe, en gas blande kammer, en luftfugter eller bubbler, og tre separate sæt af gasventiler og trykmålere. Flere detaljer kan findes i vores tidligere arbejde¹².
   2. Konfigurer CO₂ -og o₂ -kontrolenhederne, så de justerer blandingsprocenten for gassen fra Co₂ -og N₂ -tanke og o₂ -kilden. Alternativt, enhver gas forsyningssystem, der giver gas under normoxia tilstand ville arbejde.
   3. Sørg for, at den gas, der er kombineret i blandekammeret og befugges af en bubbler, således at den relative luftfugtighed øges op til 85% (som oplæst fra en relativ fugtighedsmåler), og at gassen fører til tre uafhængige gasventiler med trykmålere for at Kontroller og Overvåg Gasstrømningshastigheden i plade holderen.
   4. Placer hele plade holderen i en on-Stage inkubations termisk kontrolenhed med separate varme under enheder til låget og bundpladen, med alle enheder indstillet til 37 °C. Se tabel over materialer for flere detaljer.
4. Installation af mikrofluidisk-enhed. Se tabel over materialer for flere detaljer.
   1. Identificer, at de detaljerede komponenter i 3-brønd plade holderen er i orden, som i figur 2. Hver af de tre brønde er identiske og uafhængige, med et par gaskanaler for hver brønd. Hver brønd besidder en gasgennemtrængelig kultur parabol holder, en PDMS chip holder, en glas Vindues holder og et par 35 mm glas vinduer. Disse komponenter kan samles ved hjælp af de monterede skruer.
      Bemærk: glasvinduerne sikrer, at der er et termisk isoleret rum mellem den gasgennemtrængelige kultur membran og brønden, således at der ikke opstår kondensvand på grund af temperaturforskelle ved grænsefladen. Bemærk, at de 3 brønde er uafhængige, og 3 eksperimenter kan gøres separat.
   2. Forvarm dyrkningsmedium ved 37 °C og Degas i et vakuumkammer i 20 minutter.
   3. Behandling af PDMS-chips ved hjælp af et iltplasma system til 30 s for at opretholde hydrophilicity.
   4. Indstil sprøjtesystemet. Ilæg to sprøjter langsomt med vækstmedier og andre to sprøjter med ønsket reagens af interesse (medier, medier med lægemiddel osv.). Tilslut hver enkelt sprøjte til en 50 cm slange (0,020 "x 0.060" OD) med en 23 G dispenserings kanyle i en hul stål stift. Indsæt en hul stål stift i den anden ende af slangen.
   5. Prime slangen og indsætte stål PIN i hver PDMS chip gennem capping lag. Fyld reservoiret lag og våd PDMS mønster lag mønster med medier. Reservoiret lag fungerer som en on-chip boble fælde for at forhindre luftbobler fra at komme ind i det mikrofluidisk mønster.
   6. Læg en 1 mL sprøjte med kultur medier. sprøjten til en 5 cm slange (0,020 x 0.060 OD) med en 23 G dispenserings kanyle i en hul stål stift. Indsæt en hul stål stift i den anden ende af slangen og Prime slangen.
   7. Indsæt den hule stål stift i midten hullet af chippen, hvor overdreven medier kan udvindes ud fra chippen senere under spån forseglingen proces.
   8. Da hver PDMS enhed kræver 4 10 mL sprøjter lastet på en sprøjtepumpe, belastning 2 10 mL sprøjter per chip i fremad dækket. Placer de to andre sprøjter i sprøjte systemets træk dækningsdæk.
   9. Placer chip direkte oven på de gasgennemtrængelige kultur membraner (med celler, som allerede er overholdt til membranerne). For at undgå at samle mikrobobler i det mikrofluidiske mønster, skal du dispensere 1 mL forvarmet og afgassede medier i den 35 mm gas-permeable kultur skål før montering, og sørg derefter for, at chippen nærmer sig den flydende overflade med en 15-graders hældningsvinkel.
   10. Klem den gasgennemtrængelige kulturret og brønden i den gasgennemtrængelige kultur parabol holder for hver chip, og PDMS-chip holderen skubber PDMS-enheden nedad.
   11. Tape et ark med en sealer oven på PDMS-enheden, og klem med PDMS-chip holderen for at forhindre, at chippen tørrer ud.
   12. Indstil medieflow-hastigheden omkring matrixen til at være 20 μL/t.
   13. Sæt hele pladen i on-Stage inkubator på den motoriserede fase af et inverteret mikroskop. Tilslut gasforsyningssystemet til gaskanalerne og tryk den gasgennemtrængelige kultur membran mod den installerede PDMS-chip for at sikre forsegling af enheden. Bevar måler trykket ved 0,2 PSI (1,4 x 10⁴ PA).
   14. Udtræk langsomt for store medier i chippen ved hjælp af 1-mL-sprøjten fra midterhullet. Overhold chippen under mikroskopet, mens du udvinder medier, og stop derefter med at udtrække, når chippen er forseglet. Spån forsegling bør være indlysende, da en del af cellerne ville blive knust af mikro-strukturer.
   15. Tilslut den temperaturfølende enhed på on-Stage inkubator til 3-brønden og Indstil til 37 °C.

4. tidsforskudt billedbehandling med enkelt celle

1. Konfigurer billedbehandlingssoftware, der udnytter et inverteret mikroskop til tidsforskudt billed erhvervelse. Bemærk, at der kræves et inverteret fluorescerende mikroskop med fuldt motoriseret x-y-fase, fokusknap, lukker og filter kuber for et EA-eksperiment.
2. Konfigurer software til at erhverve billeder på tværs af to kanaler ved 10x forstørrelse for hver chip med automatisk billed syning efter en runde af autofokus. Vær opmærksom på, at automatiske korrektions systemer som perfekt fokus ikke garanterer tilfredsstillende billedkvalitet. Det er mere anbefales at generere en tilpasset fokus overflade til langsigtede billed erhvervelse baseret på enten autofokus eller manuel fokus på tværs af chippen.
3. Tag billeder hver time og lad eksperimentet køre på tids skalaen i uger. Overvåg billedkvaliteten på daglig basis, og Opdater fokus overfladen, hvis det er nødvendigt.
4. Forbered PDMS chip og gas-permeable kultur skål for efterfølgende immunfluorescent analyse, som beskrevet tidligere¹³.

5. billedbehandling og analyse

1. Post-eksperimentel behandling
   1. Konverter billeder til TIFF-format til billedbehandling og målinger, som udnytter Fiji/ImageJ.
   2. Komprimer TIFF-filer for at lette yderligere billedbehandling.
2. Fiji/ImageJ analyse
   1. For at identificere celler skal du udføre subtraktion i baggrunden og partikel analyse for at identificere fluorescerende lyse pletter for registrering af celleplacering og automatisk celletælling.
   2. Udnyt plugins (manuel tracking, chemotaxis, migration værktøj, track Mate) til at analysere celle motilitet og migration.

Representative Results

Validering af optimal cellevækst på chip
Et vigtigt mål for eksperimentet platform er at gengive centrale komponenter og interaktioner i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men simpelt nok til at give kvantitative, pålidelige og reproducerbare data. Dette mål kan kun nås, hvis vi har fuld kontrol over de fysiske og biokemiske miljøfaktorer. Vi skal enten udelukke de uønskede faktorer eller finde ud af en måde at indarbejde de ukontrollerbare faktorer i den kvantitative model til korrekt fortolke befolkningens adfærd.

Den første test er at sikre optimal cellevækst på enheden. Celle sprednings hastigheden på enheden skal være identisk eller sammenlignelig med deres vækstprofil i konventionel cellekultur. Som et bevis på princippet, humane prostatacancer cellelinje PC3 celler blev dyrket i PDMS chip uden tilstedeværelsen af ekstern stress. Disse celler blev fluorescently-mærket i cytoplasmaet, så vi kunne observere og kvantificere populationen af celler ved hjælp af inverteret lysstofrør mikroskopi. Celler sammenløbet, defineret som det område, der dækkes af celler, blev målt ved hvert mikrohabitat på forskellige tidsrammer givet en udvalgt intensitet tærskel på de fluorescerende billeder ved hjælp af Fiji¹⁵. Cellernes vækstkurver ved hver valgt position afbildes i figur 4. De valgte positioner er spredt over chippen, fra regionen nær spidsen af medierne tilspænding til Apex tæt på medier.

Vækstkurverne i figur 4B er godt afstemt, hvilket antyder, at celle sprednings profilen er identisk med en funktion af positionen på tværs af chippen. Den oprindelige hældning af kurverne afslører sprednings hastigheden. Fordoblingen tid for celler i enheden er omkring 24 timer som vist i figur 4B fra tid 0 til 24 timer, hvilket er det samme som fordoblings tiden i konventionelle cultureware¹³. Derfor konkluderer vi, at uden tilstedeværelsen af en ekstern kilde til stress, de fysiske og biokemiske faktorer er jævnt fordelt, hvilket fører til den homogene og optimerede cellevækst fra tid 50 til 100 timer.

Vi overvejede endvidere muligheden for at kvantificere celle dynamikken mellem delpopulationer i et mikromiljø. GFP-udtrykker PC3-EMT og de mCherry-udtrykte PC3-EPI-cellelinjer blev co-dyrket i EA som vist i figur 5. Celle konfluens, defineret som den procentdel af arealet, der dækkes af cellerne, måles som indikationen af befolkningens størrelse. Med udgangspunkt i 40% sammenløbet voksede Co-kulturen fuldt ud i løbet af 3 dage. Interessant, vi kan observere progression af hver fænotype i mikromiljøet. Mens vækstkurven for den samlede sammenløbet er i form af logistisk vækstmodel, befolkningen i PC3-EMT fortsatte med at ekspandere og PC3-EPI blev undertrykt i den asymptotiske fase.

Påvisning af celle motilitet assay i en blandet population
Celle motilitet er en vigtig fænotypisk opførsel. Den motilitet fordeling af en population kan give oplysninger om den fysiske interaktion af celler, de mekaniske egenskaber af lokale mikromiljø, og kan undertiden analyseres som en indikation af epigenetiske variation af celler. Da vores forbedrede cellekultur platform giver mulighed for næsten kontinuerlig billeddannelse, maksimerer fordelen ved at have en fin tidsmæssig opløsning potentialet for enkelt celle sporing i en uensartet population.

Vi bruger plugin TrackMate¹⁶ i Fiji (http://Fiji.SC) med tilpasset makro til at implementere og automatisere sporingsprocessen. TrackMate giver brugeren mulighed for at implementere og tilpasse en sporings algoritme ved hjælp af et scriptsprog fra Fiji script editor. Sporingsprocessen er inddelt i en række trin: segmenterings-, filtrerings-og partikel sammenkædnings processerne.

Som vist i figur 6B, vi udførte en "sårheling assay" som en demonstration for at studere celle kollektiv migration og celle-celle interaktion. PC3-EPI og PC3-EMT celler var tæt seedet i midten af enheden og fik lov til frit at migrere mod tomme region. Det normaliserede histogram over hastigheden af begge fænotyper afbildes i figur 6C. Hastigheden af PC3-EMT var signifikant højere end PC3-EPI med en faktor på 1,8 x, hvilket er i overensstemmelse med det faktum, at mesenchymal fænotype fungerer som en bestanddel af kutane sårheling med usædvanlig evne til at migrere i modsætning til den sammenlignelige stationær epitelial fænotype.

Yderligere, for at observere progression af celle motilitet i et stressfri miljø, vi udførte en langsigtet Co-kultur af PC3-EPI og PC3-EMT med ensartet indledende såning tæthed og sporet fordelingen af cellehastighed varierende med tiden. Som vist i figur 7A, B, efter 6 dage af kultur, som celler nåede højere sammenløbet, fordelingen af cellehastighed for begge fænotyper lænede sig mod venstre haler.

Vi kan sammenligne forholdet mellem antallet af PC3-EPI og PC3-EMT i hvert klasse interval. Som vist i figur 7C, uanset de dage af kultur eller tæthed af celler, PC3-EMT dominerede højhastigheds-regionen, mens PC3-EPI besat lavhastigheds zonen. Selv om den samlede hastighed faldt betydeligt for begge fænotyper, forblev PC3-EMT motile sædceller og blev mindre påvirket af den der af mikromiljøet som vist i figur 7D. Den gennemsnitlige hastighed af PC3-EPI faldt omkring 40%, mens den af PC3-EMT kun faldt 14%.

Der er flere faktorer, der kan påvirke fordelingen af cellehastighed og den gennemsnitlige hastighed, såsom der af befolkningen. Kontinuerlig celle sporing og overvågning over alle delpopulation er afgørende for at forstå progression af fænotypiske adfærd. Hvis vi for eksempel ønsker at kvantificere niveauet for den mesenchymale status for en ikke-mærket delpopulation, ville det være mere informativt at erhverve ikke blot fordelingen af den fysiske mængde (f. eks. hastighed) af den berørte delpopulation som funktion af tid, men også for alle resten af den sameksisterende delpopulation af celler.

Figur 1: den sprøjtepumpe drevne mikrofluidisk EA-chip. A) mikrofluidisk-anordningen har to separate medium indløb, to udtag og en central port til celle såning eller ekstraktion af for stort medium. Bemærk, at mellem medium indløb og cellekultur arrays, et par Serpentine kanaler, der tillader mediet at ækvibrere med atmosfæren passeret under den gasgennemtrængelige membran. B) generering af gradient. Sprøjterne pumpemediet med ~ 0,1 mM fluorescein og ingen fluorescein henholdsvis i chippen gennem de 2 mellemstore indløb til højre, ekstraheret ud fra chippen på de 2 medium udgange til venstre. Koncentrationen af fluorescein er proportional med intensiteten af fluorescens signal, og er profileret nær medium indløb/udtag a og nær centrum b. figur gengivet med tilladelse fra Lin et al. 2017¹². Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: komponenterne i den tilpassede 3 brønd prøveplade. a) hoveddelen af 3 brønd plader b) et par gaskanaler, der giver mulighed for at pumpe konditioneret atmosfære ind og udluftning gennem septa ved indgangen til gaskanalerne c) en O-ring, der er konstrueret til at forsegle rummet mellem brønd pladen og den gasgennemtrængelige kultur skål d) den gasgennemtrængelige kultur skål 35 mm diameter e) parabol holderen f) PDMS-anordningen g) PDMS-chip holderne h) dobbeltlags 35 mm glasruder, der er konstrueret til at opretholde Termisk isolering og forhindre dannelse af kondensvand i) glas Vindues holder j) varmepuder k) temperatursensor (l) den klæbende forsegling, der holder chippen i at tørre ud. Figur gengivet med tilladelse fra Lin et al. 2017¹². Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: den skematiske figur af den eksperimentelle opsætning. Opsætningen af eksperimentet, herunder gasforsyningssystemet, gaskanal forbindelsen, den mellemstore forsynings forbindelse og billed systemet. Figur gengivet med tilladelse fra Lin et al. 2017¹². Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: vækstkurver af PC3 i EA uden stress. PC3 blev dyrket i EA uden tilstedeværelsen af ekstern stress. A) EA-mønster med positions etiketter. B) vækstkurver for PC3 på de valgte positioner med hensyn til cellens sammentræf. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Co-kulturen i PC3-EPI og PC3-EMT i EA uden stress. PC3-EPI (rød) og PC3-EMT (grøn) blev co-dyrket i EA uden tilstedeværelsen af ekstern stress. A) overlejring af to fluorescerende kanaler ved t = 0 h. (B) fluorescerende billede taget ved t = 95 h. (C) vækstkurver med hensyn til cellens sammentræf. Cellens sammenløbet af hver celletype blev målt på hele chippen. Hvert datapunkt repræsenterer den gennemsnitlige celle sammenløb ved 3 på hinanden følgende tidspunkter, der tages med intervaller på 15 minutter. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen for cellens sammenløb ved de tre på hinanden følgende tidspunkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: celle motilitet assay i en blandet population. Påvisning af enkelt celle sporings præstation i en blandet population. A) en demonstration af, hvordan celler detekteres af Laplacian af Gaussian (LoG) segmentering. Cirklerne angiver placeringen af celler, der er registreret af Logalgoritmen. De fundne celler er sammenkædet fra ramme til ramme baseret på det lineære tildelings problem for at kvantificere celle motilitet. B) "sårhelings analysen" af PC3-EPI-og PC3-EMT-Co-Culture-eksperimentet. Celler blev seedet lokalt op til 100% sammenløbet med en klar grænse i midten. Efter installationen af EA-chippen blev cellerne observeret for at migrere gennem mikrohabitat arrayet som indikeret af de hvide pile. (C) normaliseret histogram af celle motilitet. PC3-EMT er hurtigere end PC3-EPI med en faktor på 1,8 x. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen for 5 eksperiment prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: den motilitet analyse af en langsigtet Co-kultur af PC3-EPI og PC3-EMT. En langsigtet Co-kultur af PC3-EPI og PC3-EMT med ensartet indledende såning tæthed. Fordelingen af celle hastigheden varierer med tiden. (A) normaliseret fordeling af celle hastigheden på dag 2. B) den normaliserede fordeling af celle hastigheden på dag 6. (C) forholdet mellem antallet af PC3-EPI og PC3-EMT i hvert klasse interval. D) den gennemsnitlige hastighed for PC3-EPI og PC3-EMT som funktion af tiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Konventionel cellekultur blev udviklet for næsten et århundrede siden og er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model i biomedicinsk forskning, på trods af dens dokumenterede begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i Cancer¹⁷. Dyremodeller tilbyder den højeste fysiologiske relevans og rimelige genetiske lighed for mennesker, men har længe været anerkendt for at have betydelige begrænsninger i forudsigelse af menneskelige resultater¹⁸. Blandt alle de eksisterende prækliniske modeller synes mikrofluidisk Cancer-on-chip modeller at være den mest lovende kandidat til at tilfredsstille det uopfyldte behov i kræftforskning^9,19,20. Men, nuværende kræft-på-chip modeller har endnu at tilbyde en platform, der er i stand til at reproducere centrale komponenter og interaktioner til at efterligne en tumor mikromiljø i en omfattende måde, men simpelt nok til at give pålidelige og reproducerbare kvantitative data. Vores repræsentative data viser, at vores mikrofluidiske cellekultur teknologi giver stabile fysiske og biokemiske betingelser for langvarig cellekultur i heterogene mikromiljøer. Denne multifunktionelle platform giver mulighed for sofistikeret justering af en tidsafhængig kemisk gradient samt omgivende gas sammensætning. Platformen er bærbar og kompatibel med de fleste af de fluorescerende inverterede mikroskoper til højopløsnings realtidsscanning, som tilbyder flerdimensionelle oplysninger om celler som en funktion af tid, herunder celle morfologi, populationsdynamik, celle motilitet og celle migration på et enkelt celleniveau.

Sammenlignet med vores tidligere arbejde¹¹, bemærker vi, at denne tryk forseglende emballage og monteringsmetode til vores mikrofluidisk-enhed muliggør talrige downstream-eksperiment kapaciteter (f. eks. FACS, ekstraktion af lokal metabolit, sub-klonale populationer udvidelse, hvis, DNA/RNA fisk, osv.) som supplement til de tidsforskudt billeder, der er taget i løbet af forsøgene. Denne evne til at fjerne celler fra bestemte steder i en heterogene kultur er et stort fremskridt i forhold til tidligere enheder, hvor forseglings overfladen til en chip måtte fjernes, før man kunne få adgang til kulturen¹¹. Endvidere, selv i dette tilfælde, den handling at fjerne dækslet betydeligt forstyrret kulturen, således at lokale test af celler på en enkelt til få habitat niveauer ikke var muligt. En sådan lokaliseret udvinding var mulig i vores tilfælde på grund af den bløde "resealable" karakter af den fleksible gas-permeable membran.

Der er flere kritiske trin i den præsenterede protokol. Først og fremmest, at indlede en langsigtet eksperiment med stabile Fluidic dynamik, mikrobobler skal undgås så meget som muligt. Derfor er det vigtigt at Forvarm og Degas kulturmediet (trin 3.4.2), før mediet indlæses i sprøjterne. Manipulation af medier lastning og dispensering bør ske langsomt og forsigtigt for at forhindre bobledannelse. PDMS-mønsteret skal behandles med iltplasma (trin 3.4.3), før det tilsluttes til kultur mediets forsyningssystem. Oxygen plasma behandling sikrer hydrophilicity af PDMS overflade og reducerer muligheden for mikroboble entrapping betydeligt. I trin 3.4.7., når du placerer chippen oven på cellekultur membranen, bør PDMS-chippen nærme sig den flydende overflade med en 15-graders vippevinkel for at slippe af med boblerne (hvis nogen) på den flydende overflade inde i kultur skålen. For det andet kræver tryk forseglings metoden et stabilt gasforsyningssystem, der under tryk cellekultur membranen. Trykket skal indstilles mellem 0,2 til 0,6 PSI. Tryk lavere end 0,2 PSI er utilstrækkelig til spån forsegling. Over 1,2 PSI, en betydelig mængde gas vil trænge gennem membranen og generere bobler inden for mikrofluidisk mønster. Vi bemærker, at hvis komponenterne i metal 3-brønd pladen ikke er korrekt samlet (herunder plade legemet, den gasgennemtrængelige kultur parabol holder, en PDMS-chip holder, en vindues holder i glas, O-ringe og et par 35 mm glasruder), ville man identificere gaslækage som Tryk aflæsningen ville være ufølsom over for stigningen i gasstrømmen. Lækage problemet kan løses ved blot at udføre en lækage test og derefter samle komponenterne igen.

Den store form for data, der er erhvervet med udnyttelsen af EA-teknologien, er gennem billeddannelse. Som tidligere nævnt kan EA-teknologien installeres på ethvert inverteret mikroskop. Men for fuldt ud at udnytte fordelene ved systemet, er det stærkt anbefales at installere systemet på en inverteret fluorescerende mikroskop udstyret med fuldt motoriseret x-y Stage, motoriseret fokusknap, motoriseret lukker, og motoriseret filter Cube. Vær også opmærksom på, at perfekt fokus ikke kan garantere tilfredsstillende billedkvalitet. Vi foreslår, at du bruger en billedbehandlingssoftware, der giver mulighed for flerdimensionel billed erhvervelse og tilpasset billedbehandlings script. Holde billederne velfokuserede kunne være udfordrende uden en periodisk (hver 24 timer eller 48 timer) autofokus kommando, som genererede en tilpasset fokus overflade i løbet af billedet erhvervelse cyklus.

Den præsenterede mikrofluidisk EA-teknologi er blevet implementeret for at studere tilpasning og Evolution dynamik i prostatacancer celle metapopulations under en kemoterapeutisk stress landskab¹². Vi har også demonstreret fremkomsten af Drug-resistens polyploide kæmpe kræftceller i denne tumor-lignende heterogene mikro-økologi, viser, at miljømæssige heterogenitet kombineret med celle migration inden tumor population ville forårsage forstærkning om fremkomsten af resistente fænotyper¹³. Med evnen til at kontrollere og overvåge opførsel af blandede tumor cellepopulationer under velkontrollerede stress gradienter, kan vores mikrofluidisk EA-teknologi også fungere som en platform til at studere reguleringsmekanismer og den fænotypiske transformation, der er involveret i EMT i forbindelse med kræft terapeutiske strategier²¹. Sidst, men ikke mindst, kan den præsenterede tryk forseglings emballerings metode også implementeres i andre mikrofluidisk-systemer, der kræver sofistikeret justering af omgivende gassammensætning samt downstream-eksperimentets kapacitet. For eksempel, den samme emballerings metode blev brugt til at indarbejde forskellige mikrofluidisk mønster til at studere, hvordan bakterielle befolknings bølger udbrede gennem fysiske barrierer²².

Sammenfattende er den kollektive populationsdynamik kvalitativt forskellig fra enkelt celle adfærd. Den mikrofluidiske EA-teknologi muliggør den kvantitative undersøgelse af den evolutionære dynamik og fænotypiske adfærd individuelt og kollektivt som en funktion af tid. Denne teknologi kan udgøre en mere fysiologisk relevant in vitro-model for kræftforskning, og potentielt for prækliniske lægemiddeludvikling og screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes	BD	14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955	1x anti-anti
AZ 300 MIF	Merck KGaA	18441123163	Photoresist developer
AZ1518	Merck KGaA	AZ1518	Photoresist
AZ4330	Merck KGaA	AZ4330	Photoresist
Cr Chromium Etchant	Sigma-Aldrich	651826
Fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation	10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter	Heidelberg Instruments	DWL66+	Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	379212	For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins	New England Small Tube	NE-1300-01	.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame	ibidi	10929	On-stage incubator
Luer-Lok 23 G dispensing needle	McMaster-Carr	75165A684	To connect syringes and tubings
Lumox dish 35	Sarstedt	94.6077.331	Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165	Dow Electronic Materials	Microposit Remover 1165	Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing)	McMaster-Carr	9452K114	Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing)	McMaster-Carr	9452K74	Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System	Plasmatic Systems, Inc	Plasma-Preen	Oxygen plasma system
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	11875-093
Samco RIE800iPB DRIE	Samco	RIE800iPB	Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner	SUSS MicroTec	MA6	Mask aligner
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher	PVA TePla	M4L	Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)	Sigma-Aldrich	448931	For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)	Cole-Parmer	EW-06419-01	Tubings for media delivery