En kryogene pulverisering metode for å behandle murine poter ved hjelp av en flytende nitrogen fryser Mill ble utviklet for å forbedre utbyttet og kvaliteten på RNA eller protein utvunnet fra vev og muliggjøre analyse av molekylære profiler forbundet med inflammatoriske Svar.
Profilering av molekylære endringer i lokalt vev er avgjørende for å forstå mekanismen (e) av terapeutiske kandidater i vivo. Innen leddgikt forskning, er mange studier fokusert på betente ledd som består av en kompleks blanding av bein, brusk, muskel, stromal celler og immunceller. Her etablerte vi en pålitelig og robust mekanisk metode for å forstyrre betent mus poter i homogene pulverisert prøver i et cryogenically kontrollert miljø. Protein og RNA lysater ble behandlet for å muliggjøre Proteomikk og transcriptional endepunkter og molekylær karakterisering av relevante sykdoms baner i lokalt vev.
Revmatoid artritt (RA) er en kronisk systemisk inflammatorisk sykdom med vedvarende symmetrisk synovitt i ledd og ekstra ledd involvering av organer som hud, hjerte, lunger og øyne1. Selv om de systemiske manifestasjoner av immunresponsen er tydelig i menneskelige pasienter, en av kjennetegnene til RA patologi er infiltrasjon av immunceller i synovial vev og spredning av synovial Fibroblast celler2.
I likhet med menneskelig RA, mus kollagen indusert artritt (CIA) modell utløser sterk vev betennelse med aktive immunresponser i synovial vev og systemiske avdelinger. Mottakelighet av ulike mus stammer til CIA-modellen lenker til store histocompatibility kompleks (MHC) haplotype og antigen spesifikke T celle og B celle interaksjoner3,4. I tillegg er mange patogene veier i menneskets RA, inkludert autoantistoff produksjon, immun komplekse deponering, myelogen celle aktivering, polyartikulær manifestasjoner og pannus dannelse med synovial immun infiltrasjon, også tydelig i denne modellen 5,6. Etterforskerne har brukt denne veletablerte CIA-modellen for å undersøke virkningene av anti-inflammatorisk cytokin behandlinger7. Mange biologiske medisiner godkjent for autoimmune eller inflammatoriske sykdommer, slik som anti-TNFα og anti-Il-6, er funnet å være effektiv i CIA modell8,9.
Profilering av interaksjoner i immunsystemet i synovial vev er avgjørende for å belyse molekylære mekanismer knyttet til patogenesen av RA. I den menneskelige kliniske innstillingen, er en vanlig praksis å utføre nål synovial biopsier under veiledning av Ultralyd Imaging. I prekliniske innstillingene, gjør den mindre arkitekturen i murine leddene biopsi prosedyrer mye vanskeligere om ikke umulig. Nylig demonstrerte vi utnyttelsen av murine CIA-modell for å evaluere kombinasjoner av medikamenter for å påvirke ulike sluttpunkter og løse sykdom i en Kombinatorisk tilnærming10. En kryogene fryseboks Mill-basert pulverisering metode ble brukt til å behandle betent murine poter i homogen fint pulver og etablerte nedstrøms prosesser for å trekke ut RNA og proteiner. Denne metoden beskytter RNA og protein fra enzymatisk og kjemiske degrative prosesser og gjør det mulig for oss å anvende flere analytiske metoder til en enkelt homogenisert prøvekilde.
Selv om det er sterk vitenskapelig begrunnelse for å evaluere molekylære trasé i synovial vev, mange rapporter om immun profilering av murine CIA-modellen var fokusert på perifert blod, mens protein og RNA analysedata av betente poter er ganske begrenset. Det er flere mulige årsaker til denne bias: murine ankel leddene er ikke større enn ~ 2 cm; de berørte områdene består av hud, bein og bindevev som ofte er vanskelig å homogenisere ved hjelp av tradisjonelle metoder som vev kverner, morter og mørtel, silica p…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Edith Janssen for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet og Navin Rao og Jennifer Towne for deres støtte til utgivelsen av dette manuskriptet.
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |