Summary
Dette arbejde præsenterer en protokol til at udføre en stereotaxisk, Neurokirurgisk implantation af mikroelektrode arrays i den fælles marmoset. Denne metode muliggør specifikt elektrofysiologiske optagelser i frit at opføre dyr, men kan let tilpasses til enhver anden lignende Neurokirurgisk intervention i denne art (f. eks. kanyle til lægemiddeladministration eller elektroder til hjerne stimulation).
Abstract
Marmosets (Callithrix jacchus) er små ikke-menneskelige primater, der er stigende popularitet i biomedicinsk og præklinisk forskning, herunder neurovidenskab. Fylogenetisk, disse dyr er meget tættere på mennesker end gnavere. De viser også komplekse adfærd, herunder en bred vifte af vokaliseringer og sociale interaktioner. Her beskrives en effektiv stereotaxisk Neurokirurgisk procedure til implantation af optagelses elektrode arrays i det fælles aben. Denne protokol beskriver også de præ-og postoperative trin af Animal Care, der er nødvendige for at kunne udføre en sådan operation. Endelig, denne protokol viser et eksempel på lokale felt potentiale og Spike aktivitet optagelser i en frit opfører aben 1 uge efter den kirurgiske procedure. Samlet set denne metode giver mulighed for at studere hjernens funktion i vågen og frit opfører marmosets. Den samme protokol kan let bruges af forskere, der arbejder med andre små primater. Desuden kan det let ændres for at tillade andre undersøgelser, der kræver implantater, såsom stimulerende elektroder, mikroinjektioner, implantation af optrodes eller guide-kanyle, eller ablation af diskrete vævs områder.
Introduction
Almindeligt silkeaber (Callithrix jacchus) vinder anerkendelse som en vigtig model organisme inden for mange forskningsområder, herunder neurovidenskab. Disse nye verdens primater repræsenterer en vigtig supplerende dyremodel for både gnavere og andre ikke-menneskelige primater (NHP'er), såsom rhesus Macaque. Ligesom gnavere, disse dyr er små, let at manipulere, og relativt økonomisk at pleje og race1,2,3,4, sammenlignet med større NHP'er. Desuden har disse dyr en tilbøjelighed til venskabsbysamarbejde og høj frugtbarhed i forhold til andre NHP'er1,2,3. En anden fordel aben har over mange andre primater er, at moderne molekylær biologi værktøjer3,4,5,6,7 og en sequhegnet genom2 ,3,4,5,8 er blevet anvendt til genetisk modificerer dem. Både Knock-in dyr ved hjælp af lentivirus5, og knock-out dyr ved hjælp af zink-finger-nukleaser (zfns) og transkriptionsaktivator-lignende Effector NUCLEASER (talens)7, har givet levedygtige grundlægger dyr.
En fordel i forhold til gnavere er, at marmosets, som primater, er Fylogenetisk tættere på mennesker3,5,6,9,10,11. Ligesom mennesker, silkeaber er døgn dyr, der er afhængige af et højt udviklet visuelt system til at vejlede meget af deres adfærd10. Yderligere, silkeaber udviser adfærdsmæssige kompleksitet, herunder en bred vifte af sociale adfærd såsom brugen af forskellige vokaliseringer3, så forskerne til at løse spørgsmål ikke muligt i andre arter. Fra et Neuro videnskabeligt perspektiv, silkeaber har lissencephaly hjerner, i modsætning til de mere almindeligt anvendte rhesus makak9. Desuden har silkeaber et central nervesystem, der ligner mennesker, herunder en mere højt udviklet præfrontal cortex9. Sammen, alle disse egenskaber position silkeaber som en værdifuld model til at studere hjernefunktion i sundhed og sygdom.
En fælles metode til at studere hjernefunktion involverer implantering af elektroder i anatomisk specifikke steder ved hjælp af stereotaxisk Neurokirurgi. Dette giver mulighed for kronisk registrering af neurale aktivitet i forskellige målområder i vågen og frit opfører dyr12,13. Stereotaxic Neurokirurgi er en uundværlig teknik, der anvendes i mange forskningslinjer, da det giver mulighed for præcis målretning af neuroanatomiske regioner. Sammenlignet med makak og gnaver litteratur, der er færre offentliggjorte undersøgelser beskriver stereotaksisk Neurokirurgi specifikke for marmoset, og de har tendens til at give sparsomme detaljer af de trin, involveret i operationen. Desuden, dem med mere detaljeret primært fokusere på procedurer for Elektrofysiologi optagelse i hoved hæmmede dyr14,15,16,17.
For at fremme en bredere indførelse af silkeaber som en model organisme i neurovidenskabelig forskning, den nuværende metode definerer specifikke skridt, der er nødvendige for en vellykket stereotaxisk Neurokirurgi i denne art. Ud over implantation af registreringssystemer, som beskrevet i den nuværende metode, kan den samme teknik tilpasses til mange andre eksperimentelle formål, herunder implantation af stimulerende elektroder til behandling af sygdomme18 eller kausalt kørsel kredsløbs adfærd19; implantation af guide-kanyle til ekstraktion og kvantificering af neurotransmittere20, injektioner af reagenser, herunder til inducerende sygdomsmodeller12 eller til kredsløbs sporings undersøgelser15; ablation af diskrete vævs områder21; implantation af optrodes for optogenetiske undersøgelser22; implantation af optiske ruder til kortikale mikroskopiske analyser23; og implantation af elektro kortikografiske (ECoG) arrays24. Således er det overordnede mål med denne procedure at skitsere de kirurgiske trin, der er involveret i implantation af mikroelektrode systemer til kroniske elektrofysiologiske optagelser i frit at opføre marmoseter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr og godkendt af Santos Dumont instituttets etiske komité (protokol 02/2015AAS).
1. forberedelse af kirurgi
- Fastgør hvert elektrode array til en elektrodeholder, der er kompatibel med den stereotaxiske ramme, som skal anvendes.
- Forbind en elektrodeholder til den stereo taxiske micromanipulator og sæt en mikrowire til de Interaural koordinater. Gentag dette for de ekstra elektrode systemer og holdere, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: den Interaural koordinat af enhver mikrowire kan bruges til at beregne implantations koordinaterne for hele arrayet, fordi den relative afstand mellem mikroledningerne er konstant. Når arrayet har bundter med forskellige længder, den Interaural koordinat af den længste ledning er den mest bekvemme at bruge til indstilling af Interaural nul. - Afmonter elektrode holderne fra den stereo taxiske micromanipulator og steriliserer montager (elektrode fastgjort til Elektrodeholderen) i et ultraviolet lys (UV) kabinet i mindst 2 timer.
- Fastgør en 24 G nål til en stereotaxisk sonde holder, Tilslut den til micromanipulatoren og sæt de Interaural koordinater for spidsen af nålen.
Bemærk: forud for operationen skal koordinaterne for alle craniotomier være foruddefinerede som en omkreds 200 μm2 større end anteroposterior (AP) og mediolaterale (ml) position af array målimplantations stedet. Brug den 24 G nål-sonde holder samling til at bestemme placeringen af craniotomier i kraniet baseret på nul Interaural koordinater. - Afmonter sonde holderen fra micromanipulatoren, og Steriliser samlingen i et UV-kabinet i mindst 2 timer.
- Saml 6 − 8 titanium eller skruer i rustfrit stål. Lodde en jordledning til halvdelen af dem.
- Organiser og steriliserer alle resterende instrumenter, udstyr og engangsartikler, der kræves til operationen.
2. Præoperative procedurer
Bemærk: to voksne mandlige marmoseter (Callithrix jacchus), der vejer 320 – 370 g, blev anvendt i dette studie. Sørg for, at dyret ikke har spist i 6 timer før induktion af anæstesi.
- Bedøve dyret med en intramuskulær injektion af atropin (0,05 mg/kg) for at reducere spytsekretion og bronkial sekret. Check for manglen på pedal svar.
- Efter 5 min Påfør ketamin (10 − 20 mg/kg) intramuskulært.
- Barberer dyrets hoved ved hjælp af en elektrisk Barber klipper.
- Administrere tramadol (2 mg/kg) intramuskulært som en generel analgetikum.
- Intubate dyret.
- Ved hjælp af en maske udsætter du aben for isofluran i 1 − 2% ilt med en strømningshastighed på 1 − 5 L/min for at inducere dyb anæstesi. Når dyret er dybt bedøvet, reducere og vedligeholde isofluran til 1 − 3 L/min.
- Fastgør et elastikbånd til operationsbordet med tape.
- Placer aben i en liggende position med hovedet mod teknikeren, og Placer elastikbåndet i aben ' mund bag sine canines.
Bemærk: det er bedst at placere hovedet sådan, at rygoverfladen er spidse mod gulvet og dens ansigt er mod teknikeren. - Ved hjælp af en bomuld-tippet sonde, vatpind tørre marmoset tungen, og gribe det i den ene hånd for at holde munden åben.
- Spray 10% lidocain på spidsen af endotracheal tubus røret.
- Indsæt det ikke-cuffed, 2,0 mm diameter endotracheal tubus tube i luftrør, indtil 4,0 cm mærket er ved indgangen til luftrøret.
- Fastgør røret til anæstesi samlingen med den kunstige ventilator indstillet til 40 åndedrag/min og bekræft korrekt ekspansion og sammentrækning af brystet.
Bemærk: på dette tidspunkt skal isofluran og ilt leveres via endotracheal tubus røret, ikke masken. - Fjern elastikbåndet fra marmoset mund, så endotracheal tubus røret kan tapes til kæben.
- Placer aben i en udsat position i overensstemmelse med den stereo taxiske ramme og fastgør dyrets hoved ind i stereotaksisk rammen.
- Først skal du indsætte spidsen af den højre ørestang i dyrets højre auditive kanal.
- Indsæt derefter spidsen af den venstre ørestang i den venstre auditive kanal.
- Centrer dyrets hoved i midten af den stereotaxiske ramme, og fastgør ørepuderne på plads.
- Sæt mundstykket ind i dyrets mund og Juster dets højde, så det rører dyrets gane. Placer på samme tid orbital stængerne på den nedre overflade af orbital knoglen.
- Sørg for, at den nedre overflade af orbital knoglen er vandret justeret med midten af ørepuderne.
- Tilslut en bærbar pulsoximeter til marmoset-hånd. Sørg for, at pulsen er inden for 154 − 180 beats/min (bpm) i varigheden af operationen; ofte en puls over 200 BPM indebærer dyret vågner op. Sørg for, at iltmætning er over 95%. Det kan lejlighedsvis falde til 90% uden skade.
Bemærk: Hvis hjertefrekvensen falder til under 154 BPM, skal du nedsætte isofluran. - Placer rektal temperatursonde forbundet til en homeothermic varmepude i anus, med den ønskede temperatur indstillet til 37 °C. Tape denne sensor til halen for at holde den fast på plads.
- Påfør steril øjen smøremiddel i øjnene.
- Rengør og Desinficer dyrets hoved med chlorhexidin og povidon jod, før dyret dækker et kirurgisk felt.
Bemærk: Udfør alle følgende kirurgiske indgreb under aseptiske forhold.
3. kirurgi procedurer
- Påfør lokalt analgetikum subkutant (f. eks. lidocain 20 mg/mL, 0,1 mL) på det sted, hvor det tilsigtede snit er. Lav et snit i midterlinjen i hovedbunden.
- Eksponere og forberede overfladen af kraniet.
- Løstag forsigtigt den tidsmæssige muskel fra kraniet. Først skal du bruge en skalpel til at skære fascia ved indsættelsen i kraniet. Derefter forsigtigt adskille den tidsmæssige muskel fra kraniet ved hjælp af en periost raspatory.
- Fjern periosteum fra alle udsatte kranier ved hjælp af en periost-raspatory.
- Kontroller blødningen med en steril vatpind, hvis det er nødvendigt.
- Rengør knogleoverfladen med hydrogenperoxid.
- Delineate placeringen af kraniotomi ved at markere sine hjørner med lavvandede Burr huller i knogleoverfladen. Derefter bore ud omkredsen af kraniotomi ved hjælp af en tand boremaskine ved maksimal hastighed (dvs., 350.000 rpm). Tilsæt et par dråber sterilt saltvand over kraniet, mens du borer for at undgå overophedning. Måle placeringen af kraniotomi og koordinaterne af elektrode implantatet i forhold til de Interaural koordinater.
- Implantat skruer ind i kraniet.
- Bor 6 − 8 Skru hullerne ind i kranium.
- Implantere skruerne således, at hver jord wire sammensmeltet skrue støder op til og i nærheden af en uændret skrue (dvs. uden en jordledning, der er fastgjort til den).
- Vind hver jordledning omkring den tilstødende, uændrede skrue.
- Tilsæt en dråbe sølv maling mellem jordledningen og hver skrue.
- Fjern knoglen i midten af kraniotomi ved hjælp af pincet med en buet spids (f. eks McPherson pincet). Hold dura mater hydreret med sterilt saltvand.
- Fjern dura mater. Brug en steril hypodermic nål (25 eller 26 G) med facet bøjet ved ca. 90 ° til punktering og løft overfladen af dura mater væk fra hjernens overflade. Skær derefter dura mater med mikrosaks. Hold den udsatte hjerne hydreret med saltvand.
Bemærk: Hvis der observeres signifikant varig blødning, skal du bruge Cautery eller sterile absorberende gelatine svampe, som er gennemblødt i trombine25. - Implantat mikroelektrode matricer.
- Fastgør den steriliserede elektrodeholder og elektrode array til den stereotaxiske micromanipulator.
- Placer micromanipulatoren således, at elektroden er på de ønskede anteroposterior og mediolaterale koordinater.
- Sænk elektrode matrixen, indtil spidsen af den længste bundt rører overfladen af hjernen.
- Langsomt indsætte array i hjernevæv, indtil det når de dorsoventral koordinater.
- Dække den udsatte cortex med små stykker af sterile, absorberende gelatine svampe.
- Fastgør elektroden til kraniet ved at anvende dental akryl til det udsatte kraniet, en skrue og elektroden.
- Tag Elektrodeholderen ud, og fjern den fra micromanipulatoren.
- Gentag implantationsproceduren fra trin 3,7 med de ekstra matricer, hvis det er nødvendigt.
- Vind sammen og svejse jorden ledninger af de separate arrays og skruer. Brug sølv maling til at danne en bro omkring svejsningen for at sikre, at der er opnået en elektrisk forbindelse.
- Ved hjælp af dental akryl, lave en robust headcap omkring den laterale udstrækning af matricer, og helt encase jorden ledninger og eventuelle udsatte kraniet og skruer.
- Indsæt om nødvendigt en Støttestang i headcap. Dette kan være en robust plastik cylinder som dem fra en vatpind. Forsegl den på plads med Dental akryl.
Bemærk: Dette kan være nyttigt til sikring af Elektrofysiologi kabel stik på plads, men kan være unødvendig afhængigt af det anvendte udstyr. I den nuværende metode, en lignende Støttestang er fastgjort til hovedscenen sådan, at et elastikbånd kan solidt holde hovedet etaper på plads på stikkene. - Sutur huden omkring headcap.
4. postoperativ inddrivelse
- Påfør antiseptisk opløsning (f. eks. chlorhexidin) omkring såret.
- Sluk for isofluran-forsyningen, men ikke ilten, og fjern dyret fra den stereotype ramme.
- Anbring dyret på varmepuden med oxygen, som vedligeholdes gennem endotracheal tubus røret.
- Fjern endotracheal tubus røret, når de første tegn på neurogene reflekser, såsom laryngospasms, observeres.
- Hold forsyne ilt med en maske, indtil dyret præsenterer klare tegn på bedøvelsesmiddel opsving, såsom beskyttende reflekser, postural tone, og forsøg på at ambulere.
- Placer dyret inde i et rent bur i et restitutions rum i 24 − 48 timer, før dyret flyttes til sit hjem bur. Hver implanteret dyr individuelt.
Bemærk: fordi silkeaber har tendens til at klatre i burvæggene, skal du bruge et bur med glatte vægge eller dække burvæggene med en glat overflade for at forhindre dyret i at falde. - I den første time efter operationen, observere dyret til at se for tegn på angst eller ukoordineret hovedkontakt mod siden af buret.
- Administration af antibiotika (f. eks. enrofloxacin 5 mg/kg, subkutant, en gang om dagen i 5 − 7 dage), analgetika (f. eks. oral tramadol 1 mg/kg, hver 8 h i 3 − 5 dage) og anti-inflammatoriske lægemidler (f. eks. dexamethason 0,5 − 1,5 mg/kg, subkutant, en gang dagligt i 1 − 3 dage) .
Bemærk: efter en vellykket operation, vil dyrene være fuldt tilbagebetalt inden for 3 − 5 dage.
5. kroniske elektrofysiologiske optagelser i frit opfører silkeaber
- Start de elektrofysiologiske optagelses sessioner mindst 1 uge efter operationen.
Bemærk: habituate dyrene til forskeren og eksperimentelle miljøer, før du starter alle eksperimentelle procedurer i mindst 1 måned. - Ved begyndelsen af hver session, let bedøve dyret ved hjælp af isofluran (1 − 5 L/min, 1% O2).
Bemærk: Følg den relevante institutions retningslinjer vedrørende sedation af små primater. Hvis optagelses sessioner er meget hyppige, habituerer dyrene skal håndteres, således at kabler kan tilsluttes uden anæstesi. - Tilslut elektrode matricer til et kommercielt neurale optagelses system.
- Anbring dyret i forsøgs kammeret.
Bemærk: det eksperimentelle kammer, der anvendes her, er en kubik akryl boks (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m) designet til at evaluere mængden og mønsteret af spontan motorisk aktivitet26,27. - Vent 30 min før du starter optagelserne for at sikre, at dyret er fuldt genvundet fra anæstesi.
Bemærk: Isoflurane har en hurtig indsættende og offset-action, som giver mulighed for hurtig sedation og opvågning28. Når isofluran forsyningen er slukket, vil dyret begynde at vågne op. Dyret er vågen, når det forbliver i oprejst stilling og kan ambulere frit i forsøgs kammeret uden at falde. Dette tager mindre end 15 min. For at sikre, at der ikke er nogen beroligende virkninger, påbegyndes optagelserne 30 min efter isofluran seponeres. - Bekræft placeringen af mikroelektrode array implantater efter slagtning af NISSL farvning, når du har fastlagt og skåret vævet29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne undersøgelse var at beskrive en stereotaxisk Neurokirurgisk procedure for implantation af mikroelektrode systemer til elektrofysiologiske optagelser i den fælles marmoset. En typisk kirurgi (fra anæstesi induktion til anæstesi opsving) vil vare ca 5 − 7 h, afhængigt af antallet af arrays implanteret. Her, to arrays var symmetrisk implanteret, en i hver hjerne halvkugle. Hver array indeholdt 32 rustfrit stål mikroledninger arrangeret i syv bundter rettet mod flere strukturer af basal Ganglia-kortikothalamic kredsløb (figur 1), men elektrode design og målrettede hjernen regioner kan variere afhængigt af Eksperiment. Efter vellykket kirurgi og postoperative procedurer, dyret skal være fuldt tilbagebetalt inden for 3 − 5 dage. Hvis arrayet er blevet jordet og implanteret korrekt, vil det være muligt at optage pigge (figur 2a) og lokale felt potentialer (figur 2b) i frit at opføre dyr over flere uger eller måneder, før et modent gliotisk ar er etableret 13,30. Som et eksempel, de elektrofysiologiske data indsamlet i det eksperimentelle paradigme beskrevet her er blevet effektivt anvendt til at studere den samtidige aktivitet i forskellige regioner i basal Ganglia-kortikothalamic kredsløb under spontane, jordbaserede bevægelse i en model af Parkinsons sygdom26.
Endelig, en vellykket kirurgi indebærer også implantering arrays i de målrettede strukturer. Ikke-invasive billeddannelses metoder, såsom MRI eller tomografi, kan udføres efter operationen og forud for påbegyndelse af eksperimentelle optagelser. Det vil kun være muligt at anvende en sådan metode, hvis de specifikke implantater, der anvendes, er fremstillet til at være kompatible med sådanne teknikker, og hvis forskeren har adgang til passende smådyrs udstyr. Ultimativ bekræftelse kan også udføres efter slagtning. Nissl farvede sektioner, der indeholder elektrode spor, kan bruges til præcist at bestemme positionen af hver implanteret mikrowire (figur 3). Bemærk, at elektrode spor i koronale sektioner vises som tårer i vævet. Således ekstrem omhu skal anvendes, når skæring udføres for at reducere chancen for at skabe artefakter, der vil tolerere fortolkning.
Figur 1: mikroelektrode array til implantation i små primater. Arrayet var sammensat af 32 rustfri stål mikroledninger. Ledningerne var 50 μm i diameter og blev organiseret i syv bundter med henblik på at nå følgende områder: primær motorisk cortex (M1), putamen (put), caudatus (CD), globus pallidus (GPE), ventrolaterale og ventroposterior lateral thalamic Nucleus (VPL), og subthalamisk kerne (STN). Interelektrode afstanden i hvert bundt var 300 μm. Afstanden mellem bundter afhænger af målkoordinaterne for hver hjerneregion. Mere detaljerede oplysninger om mikroelektrode array design og produktion kan findes i Nicolelis31, Lehew og nicolelis32, og dizirasa et al.33. Skala bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativt elektrofysiologisk resultat efter en vellykket operation. Det venstre panel viser Spike aktivitet af to neuroner (gule og grønne bølgeformer) indspillet fra en elektrode. Den højre panel viser lokale felt potentielle svingninger registreret fra 14 elektroderne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: afsnittet Nissl-farvet væv, som demonstrerer et elektrode spor. Dette afsnit (anteroposterior koordinat, i forhold til Interaural linje: + 8,0, ifølge Atlas af Paxinos og Watson34) skildrer en elektrode spor med spidsen på putamen, som angivet af den sorte trekant. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af de procedurer, der er involveret i implantation af mikroelektrode indspilnings systemer i aben hjernen. Den samme protokol kan let bruges, når der implantering elektroder, uanset om de er hjemmelavede eller kommercielt tilgængelige, i andre små primater. Derudover kan det nemt tilpasses til andre eksperimentelle ender, der kræver præcis målretning af hjernestrukturer. Derfor er denne protokol målbevidst med hensyn til stereotaxiske koordinater og kranie boring teknikker, fordi det er de aspekter, der kan variere mest. For eksempel, at implantatet de arrays, der anvendes i denne operation, craniotomies blev udført for at åbne to passende størrelse vinduer i hver halvkugle. Men ved implantering af robuste, individuelle strukturer, såsom førings kanyle, er hverken dette eller durectomi nødvendigt. Snarere, en simpel Burr hul til niveauet af Dura vil være tilstrækkeligt. Tilsvarende, når ikke-elektriske implantater er involveret er det ikke nødvendigt for skruerne til at være jordet. Således, trin 3,9 i den kirurgiske protokol kan udelades. I stedet, dental akryl kan bruges til blot at dække de udsatte kraniet, implantat, og skruer.
Uanset det specifikke eksperimentelle mål for stereotaxisk Neurokirurgi, vellykket gennemførelse af den givne procedure stort set kredser om god kirurgisk praksis. Det betyder, at strenge protokoller skal følges for at udføre operationen under aseptiske forhold for at forhindre postoperative infektioner35. Nogle af de mest kritiske øjeblikke er inducerende og fjerne anæstesi. Det er derfor vigtigt, at de vitale tegn på dyret (puls, blod iltmætning og kropstemperatur) overvåges gennem hele Operations proceduren36. Hvis der opstår et fald i hjertefrekvensen med et samtidigt fald i iltmætning, skal du bekræfte, at brystet er oppustethed og er ved at afvige normalt, ellers kan forbindelsen til åndedræts maskinen være fejlbehæftet. Den første ting, der kan gøres for at forsøge at inddrive puls og ilt mætning er at nedsætte isofluran koncentrationen. Hvis dette ikke løser problemet, kan atropin administreres intramuskulært for at øge hjertefrekvensen og forsøge at stabilisere dyret. Dette skal gøres meget forsigtigt, fordi tidligere erfaringer viser, at en puls over 200 BPM uden tilstrækkelig isofluran vil vække dyret.
I modsætning til gnavere, i primater, måles alle koordinater normalt i forhold til den Interaural koordinat, ikke bregma og lambda34. Det er derfor vigtigt at måle de Interaural nulkoordinater for elektrode matricer og andre sonder, før dyrets hoved fastgøres i stereotaksisk-apparatet. Desuden er det vandrette plan i silkeaber defineret som det plan, der passerer gennem den nedre margin af orbital knoglen og midten af den ydre auditive meatus. Således er det vigtigt at justere den nedre overflade af orbital knoglen med midten af ørekopperne før fastgørelse hovedet i stereotaxisk ramme. Desuden dækker de tidsmæssige muskler i aben et stort område af kraniet. Mange neurale mål kræver således, at craniotomier udføres under eller i meget tæt nærhed af denne muskulatur. Fordi disse muskler er vigtige for aben kommunikation38, skal kirurgen langsomt og forsigtigt løsrive denne muskulatur fra kraniet for at minimere skaderne.
Forskere fortrolig med adfærdsmæssige arbejde, der involverer enten gnavere eller marmoseter bør være opmærksomme på flere begrænsninger, når du udfører Elektrofysiologi i frit opfører NHP'er. For det første, i den nuværende ordning og andre involverer high density arrays eller flere arrays, er det sandsynligt, at inducerende lys anæstesi vil være forpligtet til at fastgøre kabelstikkene, selv efter passende tilvænning. Denne procedure, mens inden for rammerne af NIH'S og andre landes lovgivningsmæssige retningslinjer, bør udføres sparsomt at reducere den mentale og fysiske stress på marmoset. Endvidere, det er afgørende, at forskeren sikre, at dyret er fuldt genvundet fra anæstesi før påbegyndelse af data erhvervelse, ellers anæstesi kan tolerere data39. En anden relateret begrænsning er den fysiske tilstedeværelse af selve kablet. Mens trådløse optagelses løsninger bliver tilgængelige40, de mere almindeligt kablede optioner pålægge en fysisk begrænsning på dyret. Endelig vil det eksperimentelle kammer, der anvendes, også begrænse rækken af adfærd til rådighed for marmoset. I modsætning til gnavere viser silkeaber unikke adfærd (f. eks. klatring), der ikke vil være mulig afhængigt af det eksperimentelle kammer, der anvendes.
Fremskridt inden for materialevidenskab og ingeniørarbejde fører til de nye neurale grænseflader41. Effektive neurokirurgiske indgreb som den, der er beskrevet i dette manuskript, vil gøre det muligt for forskerne at implementere disse nye og kommende værktøjer i marmosets. Kombineret med den samtidige udvikling i molekylær biologi3,4,5, har silkeaber potentiale til at tillade undersøgelser af vigtige grundlæggende og kliniske spørgsmål i neurovidenskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Bernardo Luiz for teknisk assistance med at filme og redigere. Dette arbejde blev støttet af Santos Dumont Institute (ISD), det brasilianske undervisningsministerium (MEC) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
- Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 17 (6), 336-340 (2012).
- Harris, R. A., et al. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (4), 1467-1472 (2014).
- Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
- Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sasaki, E. Creating Genetically Modified Marmosets. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , 335-353 (2019).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sato, K., et al. Resequencing of the common marmoset genome improves genome assemblies and gene-coding sequence analysis. Scientific Reports. 5, 16894 (2015).
- Chaplin, T. A., Yu, H. H., Soares, J. G. M., Gattass, R., Rosa, M. G. P. A Conserved Pattern of Differential Expansion of Cortical Areas in Simian Primates. Journal of Neuroscience. 33 (38), 15120-15125 (2013).
- Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
- Brok, H. P. M., et al. Non-human primate models of multiple sclerosis: Non-human primate models of MS. Immunological Reviews. 183 (1), 173-185 (2001).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Ribeiro, M., Santana, M. B., Araujo, M. Neuronal signal description after chronic stainless-steel microelectrode array implants in marmosets. , Available from: http://www.canal6.com.br/cbeb/2014/artigos/cbeb2014_submission_766.pdf (2014).
- MacDougall, M., et al. Optogenetic manipulation of neural circuits in awake marmosets. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1286-1294 (2016).
- Wakabayashi, M., et al. Development of stereotaxic recording system for awake marmosets (Callithrix jacchus). Neuroscience Research. 135, 37-45 (2018).
- Johnston, K. D., Barker, K., Schaeffer, L., Schaeffer, D., Everling, S. Methods for chair restraint and training of the common marmoset on oculomotor tasks. Journal of Neurophysiology. 119 (5), 1636-1646 (2018).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. , (2019).
- Kringelbach, M. L., Owen, S. L., Aziz, T. Z.
- Talakoub, O., Gomez Palacio Schjetnan, A., Valiante, T. A., Popovic, M. R., Hoffman, K. L. Closed-Loop Interruption of Hippocampal Ripples through Fornix Stimulation in the Non-Human Primate. Brain Stimulation. 9 (6), 911-918 (2016).
- Oddo, M., Hutchinson, P. J. Understanding and monitoring brain injury: the role of cerebral microdialysis. Intensive Care Medicine. 44 (11), 1945-1948 (2018).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Hammer, D. X., et al. Longitudinal vascular dynamics following cranial window and electrode implantation measured with speckle variance optical coherence angiography. Biomedical Optics Express. 5 (8), 2823-2836 (2014).
- Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Surgical Techniques for Chronic Implantation of Microwire Arrays in Rodents and Primates. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Santana, M. B., et al. Spinal Cord Stimulation Alleviates Motor Deficits in a Primate Model of Parkinson's disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
- Santana, M., Palmér, T., Simplício, H., Fuentes, R., Petersson, P. Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in the common marmoset. Behavioural Brain Research. 290, 90-101 (2015).
- Misra, S., Koshy, T. A review of the practice of sedation with inhalational anaesthetics in the intensive care unit with the AnaConDa device. Indian Journal of Anaesthesia. 56 (6), 518-523 (2012).
- Freire, M. A. M., et al. Distribution and Morphology of Calcium-Binding Proteins Immunoreactive Neurons following Chronic Tungsten Multielectrode Implants. PLOS ONE. 10 (6), 0130354 (2015).
- Budoff, S., et al. Astrocytic Response to Acutely- and Chronically Implanted Microelectrode Arrays in the Marmoset (Callithrix jacchus) Brain. Brain Sciences. 9 (2), 19 (2019).
- Dzirasa, K., Fuentes, R., Kumar, S., Potes, J. M., Nicolelis, M. A. L. Chronic in vivo multi-circuit neurophysiological recordings in mice. Journal of Neuroscience Methods. 195 (1), 36-46 (2011).
- Nicolelis, M. A. L., et al. Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 11041-11046 (2003).
- Lehew, G., Nicolelis, M. A. L. State-of-the-Art Microwire Array Design for Chronic Neural Recordings in Behaving Animals. , CRC Press/Taylor & Francis. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science Publishing Co Inc. San Diego. (2012).
- Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. Guidelines for animal surgery in research and teaching. American Journal of Veterinary Research. 54 (9), 1544-1559 (1993).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of Animals for Biomedical Research. British Journal of Anaesthesia. 71 (6), 885-894 (1993).
- Kurihara, S., et al. A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Boer, R. A., de Vries, A. M. O., Louwerse, A. L., Sterck, E. H. M. The behavioral context of visual displays in common marmosets (Callithrix jacchus). American Journal of Primatology. 75 (11), 1084-1095 (2013).
- Kudo, C., Nozari, A., Moskowitz, M. A., Ayata, C. The impact of anesthetics and hyperoxia on cortical spreading depression. Experimental Neurology. 212 (1), 201-206 (2008).
- Ghomashchi, A., et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology system. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 3138-3141 (2014).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), 10046-10055 (2017).
