결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.
Abstract
인간 결핵의 원인원인 인균인 결핵 균(Mtb)을 포함한 마이코박테리아는 면역학적 활성 분자를 함유하는 세포외 소포(EV)를 자연적으로 방출합니다. 소포 생물 발생의 분자 메커니즘, 소포의 함량 및 병원체 숙주 인터페이스에서의 기능에 관한 지식은 매우 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하려면 EV의 격리, 정화 및 검증을 위한 엄격한 절차가 필요합니다. 이전에는 M. 결핵이 숙주 환경에서 Mtb에 의해 발생하는 조건인 철제한에 노출되었을 때 소포 생산이 강화되는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 완전하고 상세한 프로토콜은 철결핍 균으로부터 전기자동차를 분리하고 정화하는 것입니다. 정제 된 전기 를 검증하기 위해 정량적 및 질적 방법이 적용됩니다.
Introduction
진균성 세포밖 소포 (MEV)는 막 결합 된 나노 입자, 60-300 nm 크기로, 빠르고 느리게 성장하는 진균에 의해 자연적으로 방출됩니다1. 병원성 진균에 의해 방출된 MEV는 면역학적 활성 단백질, 지질 및 글리콜리피드를 통해 숙주와 상호 작용하는 메커니즘을 구성하여 농축 및 보호 방식으로분비되는 2,3,4. MEV를 특성화하고 생물 발생 및 기능을 이해하려면 소포 정화 및 검증의 엄격하고 효율적인 방법이 중요합니다. 지금까지 MEV는 철분이 풍부한 배지1,5,6,7,8에서자란 진균의 배양 여과체로부터 분리되어 왔다.
그러나, 전작에서는 철 제한이 Mtb에서 소포 방출을 크게 자극한다는 것을 보여주었으며, 아마도 MEV9에서분비되는 사이드로포어인 마이코박틴을 통해 철을 포착할 수 있습니다. 높은 철 배지에서 배양된 Mtb로부터의 MEV 격리 에 대한 절차가 설명되었지만, 낮은 철 배양물에서 MEV를 얻는 효율적인 방법은 보고되지 않았다. 따라서, 이 방법의 목적은 낮은 철 배양물에서 얻은 MEV를 분리, 정화 및 정량화하여 생화학 및 기능성 분석및 진균에서 소포 생산의 유전 적 결정요인의 분석에 사용될 수 있도록 하는 것입니다.
Protocol
1. 철분 고갈 정의 매체의 준비 KH2 PO4,L-아스파라긴 5g,글리세롤 20 mL, 덱스트로오스 2g을 플라스틱 용기에 탈이온수 900 mL에 녹여 최소 배지(MM) 1L를 준비합니다. 철분 오염을 방지하기 위해 유리를 피하십시오. pH를 5 N NaOH로 6.8로 조정하고 부피를 물로 1L로 조정합니다. 금속 킬레이트 수지(MCR) 50g을 넣고 4°C에서 24시간 동안 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 교?…
Representative Results
MEV는 밀도 구배에서 차등 침전물을 정제하였다(도1, 도 2). 설명된 조건하에서, MEV는 대부분 25% 이오디산올에 해당하는 그라데이션 분획 3(F3)으로 분리되었다. 이러한 결론은 단백질, 막 지질, 손상되지 않은 MEV의 현미경 시각화, 나노입자 크기 분포, 및 항베제 항혈전을 통한 양성 반응성의 검출에 기초한다(도2,</…
Discussion
진핵 세포 유래 엑소좀을 정화하는 여러 방법이12가지개발되었다. 이에 반해, 박테리아 유래 EV7을정화하는 효과적인 방법에 대한 정보는 제한적이다. Mtb 유래 전기 EV의 효율적인 격리는 이 병원성 진균을 성장에 있는 본질적인 어려움을 고려할 필요가 있습니다. Mtb는 긴 분할 시간 (~24 h)을 가지고 있으며 생물 안전 성 수준 3 (BSL-3) 조건에서 처리해야합니다. 따?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 나노 입자 추적 분석을 수행하기위한 안티 MEV 항 세라와 Navneet 도그라를 공유 라파엘 프라도스 – 로살레스에 감사드립니다.
Materials
Amicon stirred cell Model 108
EMD Milipore
UFSC40001
Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes
Fisher
05-538-61
Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane
EMD Milipore
PBHK07610
Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin
Bio-Rad
142-2842
Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar
BD Difco
262710
Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth
BD Difco
271310
Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane
GE Healthcare
10600001
Blotting Membrane
Optiprep
Sigma
D1556
Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Beckman Coulter
355618
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Beckman Coulter
344059
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).