Summary

Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

Микобактерия туберкулеза показывает увеличение производства и высвобождение внеклеточных пузырьков в ответ на низкие железные условия. Эта работа детали протокола для генерации низких железных условий и методов для очистки и характеристики микобактериальных внеклеточных пузырьков, выпущенных в ответ на дефицит железа.

Abstract

Микобактерии, в том числе Микобактерии туберкулеза (МТБ), возбудителя туберкулеза человека, естественным образом высвобождают внеклеточные пузырьки (ЭВ), содержащие иммунологически активные молекулы. Знания о молекулярных механизмах везиклового биогенеза, содержании пузырьков и их функциях при патогенно-хост-интерфейсе очень ограничены. Решение этих вопросов требует строгих процедур для изоляции, очистки и проверки EVs. Ранее было установлено, что производство везикл было увеличено, когда М. туберкулез подвергался воздействию ограничения железа, состояние, с которым сталкивается Mtb в принимающей среде. Представлен полный и подробный протокол для изоляции и очистки EVs от железодефицитных микобактерий. Количественные и качественные методы применяются для проверки очищенных ЭВ.

Introduction

Микобактериальные внеклеточные пузырьки (MEV) являются мембранными наночастицами, размером 60-300 нм, естественно выделяемых быстро- и медленно растущими микобактериями1. МЕВ, высвобождаемые патогенными микобактериями, представляют собой механизм взаимодействия с хозяином с помощью иммунологически активных белков, липидов и гликолипидов, выделяемых концентрированным и защищенным образом2,3,4. Для характеристики МЭВ и понимания их биогенеза и функций, строгие и эффективные методы очистки везикулы и проверки имеют решающее значение. До сих пор, MEVs были изолированы от культуры фильтратов микобактерий, выращенных в богатых железом среде1,5,6,7,8.

Тем не менее, предыдущая работа показала, что ограничение железа значительно стимулирует высвобождение везикля в Mtb, возможно, для захвата железа с помощью микобактина, siderophore выделяется в MEVs9. Хотя процедуры изоляции МЭВ от Mtb, культивированные в высокой железной среде, были описаны, эффективной методологии получения МЭВ из низкой культуры железа не сообщалось. Таким образом, цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать, очистить и количественно MEVs, полученные из низких культур железа, так что они могут быть использованы для биохимических и функциональных анализов и для анализа генетических детерминантов везиклов производства в микобактериях.

Protocol

1. Подготовка истощенного железом определяемого среднего Приготовьте 1 л минимальной средней (ММ) путем растворения 5 г KH2PO4,5 г L-аспарагина, 20 мл глицерола и 2 г декстроза в 900 мл деионизированной воды в пластиковом контейнере. Избегайте стекла, чтобы предотвратить загряз?…

Representative Results

MEV были очищены дифференциальной осадок в градиент плотности(Рисунок 1, Рисунок 2). В описанных условиях, MEVs разделены главным образом в градиентной фракции 3 (F3), который соответствует 25% йодиксанол. Этот вывод основан на обнаружении белк?…

Discussion

Несколько методов для очистки эукариотических клеток, полученных экзосомы были разработаны12. В отличие от этого, существует ограниченная информация об эффективных методах очистки бактерий полученных EVs7. Эффективная изоляция Mtb-полученных EVs необходимо учиты…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Рафаэлю Прадос-Росалесу за то, что он поделился антисерой антисеры МИВ и Навнитом Догра за выполнение анализа отслеживания наночастиц.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

View Video