Summary

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Abstract

Mikobakteriler, Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere (Mtb), insan tüberkülozunun nedensel ajan, doğal olarak immünolojik olarak aktif moleküller içeren ekstrasellüler veziküller (EVs) serbest. Vezikül biyogenezinin moleküler mekanizmaları, veziküllerin içeriği ve patojen-konak arabirimindeki fonksiyonları hakkında bilgi çok sınırlıdır. Bu soruların ele alınması, eVs’lerin yalıtımı, saflaştırılması ve doğrulanması için sıkı prosedürler gerektirir. Daha önce, M. tüberküloz demir kısıtlamasına maruz kaldığında vezikül üretiminin artırılmış olduğu bulunmuştur, ev sahibi ortamda Mtb’nin karşılaştığı bir durum. Burada sunulan demir eksikliği mikobakterilerden EVs izole etmek ve arındırmak için tam ve ayrıntılı bir protokoldür. Arındırılmış EVs doğrulamak için nicel ve nitel yöntemler uygulanır.

Introduction

Mikobakteriyel ekstrasellüler (MEV) membrana bağlı nano taneciklerdir, 60−300 nm boyutundadır, doğal olarak hızlı ve yavaş büyüyen mikobakteriler tarafından serbest bırakılır1. Patojenik mikobakteriler tarafından salınan MEV’ler, immünolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve konsantre ve korunan bir şekilde salgılanan glikolipidler aracılığıyla konakla etkileşimedebilen bir mekanizma oluşturur2,3,4. MEVs karakterize etmek ve biyogenez ve işlevlerini anlamak için, vezikül arınma ve doğrulama sıkı ve verimli yöntemler çok önemlidir. Şimdiye kadar, MEVs bir demir açısından zengin orta1,5,6,7,8yetiştirilen mikobakterilerin kültür filtrates izole edilmiştir.

Ancak, önceki çalışma demir sınırlama büyük ölçüde Mtb vezikül salınımını uyarır gösterdi, muhtemelen mycobactin üzerinden demir yakalamak için, MEVs salgılanan bir siderophore9. Yüksek demir ortamda yetiştirilen Mtb’lerden MEV izolasyonu prosedürleri tanımlanmış olsa da, düşük demir kültürlerinden MEV elde etmek için etkili bir metodoloji bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, biyokimyasal ve fonksiyonel tahliller ve mikobakterilerde vezikül üretiminin genetik belirleyicilerinin analizi için kullanılabilmesi için düşük demir kültürlerinden elde edilen MEV’leri izole etmek, arındırmak ve ölçmektir.

Protocol

1. Demir Tükenmiş Tanımlı Ortamın Hazırlanması 5 g KH2PO4,5 g L-asparagin, 20 mL gliserol ve plastik bir kapta 900 mL deiyonize su da dekstroz 2 g dekstroz eriterek minimal orta (MM) 1 L hazırlayın. Demir kontaminasyonunu önlemek için camdan kaçının. PH’ı 5 N NaOH ile 6,8’e, hacmi ni suyla 1 L’ye ayarlayın. 50 g metal şelin reşaden (MCR) ekleyin ve 4 °C’de 24 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak hafifçe çalkalayın. Plastik alıcılı 0…

Representative Results

MEV’ler bir yoğunluk gradyanda diferansiyel sedimantasyon ile saflaştırılmıştı (Şekil 1, Şekil 2). Açıklanan koşullar altında, MEVs çoğunlukla degrade kesir 3 (F3), hangi% 25 iodixanol karşılık ayrılmıştır. Bu sonuç protein, membran lipid, bozulmamış MEV’lerin mikroskobik görüntülemesi, nanopartikül boyut dağılımı ve antivezile antiserum ile pozitif reaktivitenin saptanması üzerine kuruludur<str…

Discussion

Ökaryotik hücre kaynaklı ekzozomları arındırmak için birden fazla yöntem geliştirilmiştir12. Buna karşılık, bakteri kaynaklı EVs7arındırmak için etkili yöntemler hakkında sınırlı bilgi vardır. Mtb kaynaklı EV’lerin verimli bir şekilde izole edilmesi, bu patojenik mikobacterium’un yetiştirimindeki içsel zorlukları göz önünde bulundurmak gerekir. Mtb uzun bir bölünme süresine sahiptir (~24 saat) ve biyogüvenlik seviyesi üç (BSL-3) koşulla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Rafael Prados-Rosales’e nanopartikül izleme analizi ni gerçekleştiren anti-MEV antisera ve Navneet Dogra’yı paylaştığı için minnettarız.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

View Video