Summary
这项工作描述了一个半高通量协议，允许在一次一夜的运行中同时对80-100 C.elegans胚胎的胚胎发生进行3D延时成像。此外，还包括图像处理和可视化工具，以简化数据分析。这些方法与自定义报告菌株相结合，有助于详细监测胚胎生成。
Abstract
在胚胎发育过程中，胚胎学是系统分析细胞命运规范和形态遗传事件的首要系统。一个挑战是胚胎生成在大约13小时的时间内动态展开;这个半天的时间尺度限制了可以成像的胚胎数量，限制了实验的范围。在这里，我们描述了一个半高通量协议，它允许在一次夜间运行中，以中等时间分辨率、从多达 14 个不同条件对 80-100 个胚胎进行同步 3D 延时成像。该协议非常简单，任何实验室都可以通过具有点访问能力的显微镜进行实施。该协议的效用通过用它来成像两个定制的菌株来演示荧光标记，这些荧光标记经过优化，以可视化细菌层规范和形态生成的关键方面。为了分析数据，构建了一个自定义程序，该程序在所有通道、z 步长和时间点中从更广泛的视野中裁剪单个胚胎，并将每个胚胎的序列保存到单独的 tiff 堆栈中。该程序包括用户友好的图形用户界面 （GUI），通过隔离、预处理和统一定向单个胚胎来简化数据处理，为可视化或自动分析做好准备。还提供了一个 ImageJ 宏，该宏将单个胚胎数据编译为多面板文件，在每个时间点显示每个胚胎的最大强度荧光投影和亮场图像。本文描述的协议和工具通过使用它们来描述胚胎发育的特征，在击倒40个先前描述的发育基因之后;此分析可视化了以前用的分着的发育表型，并揭示了新的表型。总之，这项工作详细介绍了半高通量成像方法，以及裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，当与表达信息荧光标记的菌株结合使用时，可以大大加快分析实验胚胎发育。
Introduction
胚胎是机械细胞生物学的重要模型系统，分析细胞命运规范和形态遗传事件，推动胚胎发育1、2、3、4，5，6，7，8，9。 迄今为止，胚胎中细胞级事件和细胞命运规范的大部分特征都是通过相对高的时间分辨率一次进行成像实验（即每10-100s采集一次）表达的胚胎来实现的。荧光标记。尽管这种方法非常适合从秒到几十分钟的事件，但这种方法在技术上对较长过程的特征进行了限制，从小时到天的顺序。从第一次裂解到伸长结束的胚胎发育大约需要10小时。在这个时间尺度，半高通量的方法，将允许同时降低时间分辨率成像（即，在5-20分钟的时间间隔获得）更大的胚胎组，从不同的条件，将开辟一个新的实验范围;例如，进行系统的大规模筛选工作，并分析足够数量的胚胎，以便比较分子扰动的后果。
在这里，我们描述了一种半高通量方法，用于监测C.elegans胚胎的产生，该方法可在一次夜间运行中，在80-100个胚胎中同时进行3D延时成像，从多达14个不同的条件下进行发育。该协议易于实施，任何实验室都可以使用具有点访问功能的显微镜进行操作。此协议中的主要步骤如图1所示。简而言之，胚胎从表达荧光标记的幼体成人中解剖，并将年轻胚胎（2-8细胞阶段）转移到384孔板的孔中进行成像。在这种形式下，相对较小的井尺寸将胚胎漏斗到狭窄的区域，这有助于识别含有多个胚胎的场，以便进行延时成像。为了保持胚胎群的大致同步发育，解剖在冷冻介质中进行，板在冰上保存，这阻止了长达一小时的解剖时间窗口的重大发育。将板转移到显微镜上，胚胎在温度控制室中过夜，间隔20分钟，使用60倍油浸1.35 NA透镜，在2μm步数中收集整个z-范围。50个场，每个包含1-5个胚胎，在一个夜间运行成像。根据所需的实验，可以通过按比例减少成像场的数量来增加时间分辨率（例如，以 5-10 分钟间隔成像）。
有了这个协议，即使是一次通宵运行也能生成大量数据（分布在 50 个领域的 80-100 个胚胎），而大型实验在数据分析方面可能很快变得难以管理。为了便于处理、可视化和简化此数据的分析，构建了一个程序来裁剪和定向胚胎并执行预处理步骤（可选），以及一个用于编译数据以简化查看的 ImageJ 宏。这些程序可用于处理使用传统方法收集的图像，因为它们独立于成像方法，只需要单个亮场平面。第一个程序采用包含多个胚胎（GUI 选项或源代码embryoCrop.py）的 4D 场，或包含多个胚胎（screenCrop.py）的多个 4D 场，紧密裁剪胚胎，并在前后配置中定向它们。这些程序还为用户提供了执行背景减法、漂移校正和衰减校正的选项。生成的文件是统一的预处理，严格裁剪每个胚胎的tiff堆栈，可以修改为自动图像分析。为了简化查看每种条件的所有胚胎，编写了 ImageJ 宏（OpenandCombine_embsV2.ijm），该宏将给定条件中的所有胚胎组装到单个 tiff 堆栈中，并阵列显示景场图像和最大强度投影颜色（RGB）覆盖，并排，每个胚胎。在一对定制菌株中敲除40个先前描述的发育基因后，通过它们来描述胚胎发育的特征，这些基因得到了验证，这些基因表达荧光标记，这些标记经过优化，以可视化细菌层的关键方面规格和形态生成10，11。半高通量胚胎成像协议和图像处理工具共同作用于实现更高的样本数实验和旨在了解发育过程的大规模筛选工作。此外，这些菌株还将为检查分子扰动对胚胎生成的影响提供一种有效的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 为半高通量成像准备C. elegans胚胎
注：该协议的这一部分的目标是将半同步（2至8细胞阶段）的C.elegans胚胎（从合适的标记菌株（图2）解剖到玻璃底384孔板中进行成像。其他板格式也可以工作，但384孔板是首选，因为小井大小限制胚胎传播到相对较小的区域，这有利于识别含有多个胚胎的场进行延时成像。大致同步胚胎可确保捕获一个领域中每个胚胎的整个发育过程。
- 准备5⁄10 mL 0.1 mg/mL的盐酸四甲盐碱（TMHC）麻醉剂溶解在冰冷M9介质（0.45 M Na2HPO4+7H2O，0.11 M KH2PO4， 0.04 M NH4Cl） 期间使用解剖和成像。这种介质包括麻醉剂，以确保移动孵化的幼虫不会在早期发育阶段破坏胚胎的成像。
注：如果使用裁剪和可视化工具分析使用标准甘草垫安装方法获得的数据，请跳到下面的第 3 节。 - 将制备溶液的70 μL加到玻璃底384孔板的单个孔中，每个孔有一口;避免板的外侧两行，以防止边缘效应。
注：使用粘合 PCR 板箔覆盖周围井非常有用（参见图 1D所示），这可保留相邻井，以便将来进行实验，并便于在解剖显微镜下找到适当的孔。一旦溶液被异引，在整个解剖过程中将板和剩余的溶液保持在冰上。 - 产生口移器，将胚胎从凹陷滑梯（其中肉汁的母体被解剖）转移到井中。将毛细管移液器（25 μL 校准移液器）拉到火焰上并断裂以生成细锥形端（图 1D）。每个条件都需要一个移液器，以防止交叉污染;使用后丢弃移液管。
- 使用细钳子将10个肉汁成人在解剖范围内转移到150 μL的冰冷的TMHC溶液中，并为每个情况的凹陷幻灯片。使用钳子和手术刀，解剖蠕虫释放胚胎。
- 将拉毛细管移液器装入移液器随附的吸气器附件中，并将所有 2 到 8 细胞级胚胎转移到制备板的单个孔中（图 1D）。避免转移晚期胚胎和解剖碎片。在解剖范围内检查，如果存在胚胎聚集体，口腔上下移液或用移液尖敲打胚胎团块以分散。
注：为了防止交叉污染，清洁解剖设备，并在两次之间移动时使用新鲜的口腔移液器。解剖之间将盘子存放在冰上。 - 一旦所有条件的蠕虫被解剖，胚胎被放置在适当的井中，在600 x g下旋转384孔板1分钟，以固定胚胎。
- 用乙醇浸泡的抹布擦拭板的底部，清除所有残留物，并将板放在配有板架的共聚焦显微镜上，置于温度控制的环境中。
注：遵循的步骤详细介绍了使用实验室设置的方法;请修改采集条件，以适应实验需要和设备。此处，使用配备微透镜增强双 Nipkow 旋转盘、512 x 512 EM-CCD 摄像机、高精度自动 XY 级（指定分辨率 0.1 μm）和电动 z 轴控制（指定分辨率 0.1 μm）的共聚焦扫描仪盒。该系统保存在16°C的房间里，在隔夜成像期间将显微镜温度保持在21至23°C之间。 - 要识别具有合适胚胎的场，请使用 10x 0.4 NA 目标和合适的成像软件对每口井进行预扫描。最佳场将包含多个早期胚胎，该胚胎与其他胚胎处于同一焦点平面，理想情况下相邻胚胎之间的接触最小。标记适当区域的位置。
- 要选择成像场，请切换到 60x 目标，并在每次访问时调整焦平面以适当分割胚胎。每口井有1⁄4个场被成像，在14个井中共有50个场，每个场可以包含1到5个胚胎。总体而言，从每种条件下选择4至15个胚胎进行高分辨率成像。
注：此步骤的一个关键变量是使用足够的机油;将油放在目标上，在每个井中的访问点，将油分散到所有井的表面，然后在选择油田之前向目标再涂上一滴油。 - 使用 60x 1.35 NA 目标对所选字段进行成像，以 2 μm 的间隔以 2 μm 的间隔获取 18 z 部分，每次 10 小时。使用胚芽层和形态生成报告菌株的成像条件如下：亮场，90%功率，25ms，增益20%;488 nm，100% 功率，200 ms，60% 增益;568 nm，45% 功率，150 ms，60% 增益。
- 成像完成后，在开始夜间成像后，通过执行低放大倍率（10x 0.4 NA 物镜）全井明场扫描[20~24 h]来评估胚胎杀伤力。
2. 胚胎杀伤性评分
- 使用运行后的10x扫描场，通过计算每口井的孵化蠕虫和未孵化胚胎来评估胚胎杀伤力和幼虫缺陷。
- 将未孵化的胚胎列为胚胎致命。从致命性计数中排除已逮捕的一至四细胞阶段胚胎，因为年轻的解剖胚胎有时无法完成蛋壳形成（如果美氏体 II 尚未完成），渗透性缺陷可能导致前两个期间的渗透并发症部门。
- 分数部分孵化或完全孵化的蠕虫与身体形态或行为缺陷，如倾倒或瘫痪，作为"异常幼虫"。
3. 自动裁剪 （图 3A）
注：该软件被安置在两个位置：（1） Zenodo拥有用户友好的软件12版本，不需要任何编程专业知识。（2） Github包含我们embryoCropUI.py的源代码，screenCrop.py软件13，这需要熟练使用 Python。有关下载和操作两个版本的程序的详细说明，请参阅下文。
- 使用胚胎裁剪UI可执行版本（用户友好版本）进行自动裁剪
- 要使用胚胎克罗维程序，首先从泽诺多（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）12下载程序。
- 下载该程序的 MacOS 或 Windows 格式版本（请注意，MacOS 版本需要 MacOS X10.11 或更高版本）。
- 下载说明文件（GUI_指令_zenodo_repoV2.docx），为测试和使用胚胎裁剪UI程序提供分步说明。
- 下载 test_files.zip 以测试程序在平台上是否正常运行（请参阅说明）。
- 下载后，解压缩并导航以查找胚胎裁剪UI 可执行文件 （...]胚胎裁剪UI_WINDOWS_胚胎克罗普UI_胚胎裁剪UI.exe）或 （...]胚胎克罗普 UI_MacOS_胚胎克罗普UI_胚胎克罗普.exe）。双击启动（或选择"打开"终端）并运行胚胎裁剪UI可执行文件。
- GUI 可执行文件一次裁剪一个 4D 视场。在左上角，选择打开的按钮以加载要裁剪的特定字段（多点）。如果裁剪具有多个维度（即 z、时间、通道）的 tiff 系列，则仅加载文件夹中系列中的第一个图像（每个文件夹一个 tiff 系列）。
- 加载图像后，指定以下信息：z-切片数、（Z）、时间点数 （T）、通道数 （C）、对应于 DIC 或亮场的通道（first=1、秒 =2 等）。
- 选择要在图像上运行的其他处理。该程序提供漂移校正、背景减法和衰减校正。
- 指定背景减法和衰减校正的参数，以指导 GUI 提示符中的处理工作。对于"背景减法"，定义最大要素大小以反映有意义的信号大小;不应将此要素大小视为背景，并且必须是奇数值。输入 0-1 的值以进行衰减校正。衰减校正值反映原始强度的百分比，该强度保持在被成像对象的最远深度。
注：背景减法和衰减校正必须一起运行。 - 指定图像收集顺序（即通道-z-time （czt） 或 z 通道时间 （zct）。
- 根据正在使用的相机指定图像的每像素微米。
注：如果像素大小未正确定义，则会出现图像裁剪不良。 - 选择左下角的"运行"。将在与未裁剪文件夹相同的路径中创建一个标记为"裁剪"的新子文件夹;裁剪后的版本将保存在此位置。根据文件大小，裁剪应在数秒到几分钟内完成。
- 要使用胚胎克罗维程序，首先从泽诺多（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）12下载程序。
- 使用screenCrop.py自动裁剪 （批处理版本替代上述胚胎作物GUI;仅限精通 Python 的用户)10,13
- 要使用screenCrop.py，Python 软件版本用于以批处理格式裁剪较大的数据集，从 Github 克隆或下载源代码（github.com/renatkh/embryo_crop.git）。
- 阅读有关配置适当虚拟环境的说明，并遵循所述的文件命名系统;两者都在 Github 存储库中的README文件中详细说明：https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md。
- 一旦环境变量和命名约定得到正确建立，打开parameters.py，screenCrop.py选择编辑器。
- 要在不接触源代码的情况下修改可调整参数，请编辑parameters.py文件。
注：还可以直接更改screenCrop.py标头中的参数。- 如果使用parameters.py配置文件，请将use_配置设置更改为 True。如果在screenCrop.py中使用直接编辑，请将use_配置设置保留为 False。
- 在parameters.py文件中找到以下信息，并进行修改以适应所需的成像参数和文件结构：
- loadFolder（第9行）：更改为存储文件的驱动器（例如，Z：/、D://等）
- 日期（第 7 行）：更改为包含映像会话文件的文件夹。这在 CSV 跟踪文件中称为"实验文件夹名称"（请参阅说明）。
- 跟踪文件（第 11 行）：更改为存储实验信息的 CSV 文件的路径。
- z（行 13）：设置为 z 平面数。
- nT（第14行）：设置为时间点数。
- nWells（第19行）：设置为使用的井数。
- 点访问（第 20 行）：设置为最大点访问数（每口）。
- 在第 10 行中查找当前由"CV1000/"占用的位置，并输入文件路径中使用的外部文件夹。为避免出现问题，请使用以下约定："XXXXXXX/"。
- 在第 12 行中，输入用于存储裁剪数据的纵横比数据的有效文件路径。
- 在第 15、16、17 和 18 行中输入True/False，用于图像是否经过以下处理：
- 输入真或假，用于第 15 行的漂移校正。
- 输入真或假，用于第 16 行的背景减法。特征大小必须根据不同的标记应变和像素大小进行经验确定。在此处的配置中，特征大小定义为 Germ-Layer 应变的 41 和形态发生应变的 201。背景减法必须与衰减校正同时进行。
- 输入真或假，用于第 17 行的衰减校正。
- 输入 True 或 False，用于第 18 行的前后旋转。
- 完成所有更改后，即可开始裁剪。为此，请切换到screenCrop.py并在工具栏中选择播放图标，在下拉菜单中选择"以"运行为> Python 运行"。
- 由于大型数据集（50 点访问 18 z 步长、3 个通道、31 个时间点）可能需要几个小时才能完成，因此可在控制台窗口中跟踪裁剪进度。裁剪完成后，在保存之前，一个小窗口将显示裁剪图像的预览。对于每个图像，有 3 个选项：
- 保存：如果图像被正确裁剪且没有切断感兴趣的区域，则按空格键保存图像。
- X：如果图像似乎已切断感兴趣区域，请按X;图像将在名称前面保存一个 X，以将其与其他图像分开。
-
删除：如果图像未正确裁剪或胚胎不令人满意，请按D删除裁剪的图像。
注： 图像将保存到"加载文件夹"中名为"裁剪"的子文件夹（在程序的第 9 行中定义）。
4. 可视化 （图 4）
注： OpenandCombine_embsV2.ijm10，12是一个 ImageJ 宏，它将从特定应变和条件的所有图像中构造一个易于查看的 tiff 文件。需要安装FIJI/ImageJ14，15。 此宏根据我们的文件结构运行;将需要对其进行修改以与其他文件结构一起工作。有关正确文件结构和重要注意事项的详细说明，请参阅 Zenodo 存储库上的GUI_指令_zenodo_repoV2.docx文件的末尾。在映像之前，请完整阅读这些说明，以正确命名和构造文件，以便最好地与该宏接口。作为参考，我们的文件位置结构如下所示：
Z：\裁剪\目标\应变\Emb_目标_Emb_15数字唯一标识符_W_#F_t_#_Z_#_C_.tif
即 Z：\裁剪\EMBD0001_GLS_EMB1_EMBD0001_Emb1_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif
- 从泽诺多（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）下载Openand 合并_embsV2和GUI_指令_zenodo_repoV2.docx。
- 准备以下信息：
-图像文件夹的存储位置（裁剪后）。
-要处理的特定条件（即 EMBD0002）的图像文件夹名称）。这在上述示例中称为"目标"
-一个 15 位字母数字唯一标识符，特定于给定的隔夜实验 — 此标识符是数据采集文件夹名称（即 20140402T140154），唯一标识符嵌入到单个 tiff 文件名 （EMBD0002_Emb1}} 中20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1）当天拍摄的每个胚胎。宏使用此标识符检查在同一日期获取的胚胎，并可以将具有单独日期的重复条件组装到单独的 ImageJ 文件中。 - 打开 ImageJ，并将宏文件Open 和组合_embsV2.ijm拖放到 ImageJ 栏，或直接打开宏。
-
打开宏后，找到第 3 行和第 4 行。根据以下步骤输入（第 4.2 节）中收集的信息：
- 在第 3 行 （RNAL） 中，输入要处理的图像的目标名称。在以下结构新阵列（"XXXXXXXX/"）中输入每个目标;包括报价。要同时运行多个条件，请用逗号分隔，并将所有目标名称保留在括号内（即newArray（"EMBD00000/"，"EMBD0001/"，"EMBD0002 /"）。
- 在第 4 行（日期）中，在引号中输入 15 位字母数字唯一标识符，例如 newArray（"20140402T140154"）。
- 按宏窗口左下角的"运行"。将出现一个窗口，该窗口将启动一个提示，以导航到包含裁剪的图像文件夹的外部文件夹（在 4.4.1 中指定）。
-
一旦选中，将显示另一个窗口，这将允许规范成像参数。
- 输入通道数、Z 切片数、标记已编译图像所用文本的字体大小以及每个通道的颜色。
- 检查所有通道中的开/关自动对比度。
- 指定所有参数后，单击窗口底部的"确定"。 复合文件将开始组装;这将需要几分钟，每个条件，才能完成。
- 完成后，根据需要查看未打开的文件。可以关闭这些文件而不保存，因为宏已经将文件保存到新创建的文件夹，该文件夹以下列方式命名：外部文件夹名称（在第 4.5 节的提示符中指定） = "-fiji 处理-输出"（即 Z：*裁剪-fiji-处理输出_EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在描述分子扰动对C.elegans胚胎发育的影响时，一个重大挑战是，胚胎从第一次裂解到20°16的伸长结束大约需要10小时。一种半高通量方法，其中可以同时成像大量胚胎，这种方法对于此时间尺度的事件非常有用，因为它允许同时对多个条件进行成像，并为每个条件提供足够的组合大小，从而实现定量分析 （图 1A.
半高通量成像方法和多标记菌株
此处描述的半高通量成像方法（如图 1B所示），采用 384 孔玻璃底板;多井格式允许并行排列多达 14 个条件，而小井的体积限制了搜索区域，简化了包含胚胎的用于高分辨率成像的场的识别。在这里，使用了共聚焦扫描仪盒，配备了微透镜增强型双Nipkow旋转盘、512 x 512 EM-CCD摄像机、高精度自动XY级（指定分辨率0.1 μm）和电动z轴控制（指定分辨率0.1 μm）。然而，该协议可以适用于任何具有精确点访问功能的共聚焦显微镜和可以容纳多孔板的阶段适配器。开发这种方法的一个重大挑战是设计一种方法，在同一发育阶段产生一个胚胎板，以便每个领域的所有胚胎都能捕获整个发育。这是一个挑战，因为首先排列在成像板上的胚胎将继续发育，而随后的样品将被解剖，从而导致在井上分期化的梯度。为了规避这个问题，选择早期胚胎（2-8细胞阶段），并将解剖介质和成像板保存在冰上;这种停滞胚胎的解剖胚胎，直到所有条件已经排列，没有显著影响胚胎生存能力10。为了将胚胎在冰上的坐放时间限制为1小时，两名研究人员同时进行解剖，这允许在大约50分钟内设置14种不同的条件。解剖后，在600 x g处旋转1分钟，将胚胎沉淀，在低倍率下对孔进行预扫描，用一组合适的胚胎定位场进行高放大率成像;点访问位置被标记。胚胎在温度控制室中使用60倍油浸1.35 NA透镜过夜。样品配置在 4 井乘 4 孔区域，使实验中使用的板的表面面积与 22 x 22 mm2标准盖玻片相媲美，从而允许使用 60 倍油物镜。在成像开始之前，在这个地区均匀地分布石油对于成功获得长期图像至关重要。发育中的胚胎在含有麻醉剂的溶液中成像;这确保了当井内较老的胚胎孵化时，它们的运动不会破坏正在成像的相邻年轻胚胎的位置。由于蛋壳的不可穿透性，麻醉剂不影响孵化前的运动。在这些条件下，在一次夜间实验中，在3个通道中收集3D延时数据，总共80-100个胚胎（下文将对此进行讨论）。
胚胎发育分两个阶段进行。首先，10轮细胞分裂耦合到细胞命运规范产生三个生殖层（内生，中生代，和内皮）在6小时期间17。在随后的7小时，形态遗传事件推动分化组织8，16的形成。为了捕捉这两个发育方面，我们构建了一对自定义菌株，即Germ层和形态发生菌株10（图2A），并使用半高通量协议来成像来自两个菌株的胚胎。Germ 层菌株表示转基因编码的荧光蛋白，这些蛋白以红色、黄色和绿色标记在外皮、中生代和内皮中的核。该菌株包含三个报告基因：（1）一个转基因表达PHA-4：：GFP，标记在肠道和咽核（绿色内皮）10，18，19，（2） 一个转基因表达mCherry-组蛋白在表皮和神经元+1/3中融合（红色外皮;图2A，和（3）一个转基因，在体壁肌肉（黄色中代）中同时表达mCherry和GFP标记的组蛋白。形态生成菌株有两个表达的转基因：（1）表皮中的绿色上皮结标记（DLG-1：：GFP），以及（2）mCherry标记的血浆膜标记，在神经元的+1/3（Pcnd-1启动子）;图 2A.为了提高RNAi的有效性，两种菌株还被设计成含有一对RNAi敏化突变（nre-1（hd20）lin-15b（hd126）20。这些构建的目的是对胚胎发育所需的2000个基因进行大规模基于RNAi的筛选。然而，这副菌株也将构成一个广泛有用的标准化平台，用于评估突变体中的发育缺陷，并更详细地分析不同蛋白质在发育中的作用。
对于这种半高通量格式的数据收集，在 16°C 温度控制室中，每隔 20 分钟收集一次的绿色、红色和亮场 z 系列（18 x 2 μm2间隔）;这在运行过程中保持显微镜在21-23°C之间。20分钟的时间间隔允许我们每个实验对50个胚胎场（点访问）进行成像。用户可以根据更少的点访问时间调整收购间隔，或者通过更多点访问来缩短访问间隔，以最适合其实验目标。对于这些菌株，早期发育时间点没有成像，因为组织特定的记者驱动标记表达直到中晚期的胃发育才开始表达。在早期阶段，以低倍率（10倍）扫描油井，并选择场进行高放大倍率成像。建议选择含有多个早期胚胎的场，但避免在胚胎部分重叠、过于拥挤或位于油井极端边缘的领域。在隔夜进行60倍成像后，进行低放大倍率（10倍）全井扫描，以确定胚胎是否以正常外观（WT）孵化，孵化是否具有明显异常（幼虫异常），或针对评估的每个情况具有胚胎杀伤性（图 1B.这一步骤是同时设置板块以评估更大人口致死力的简便选择;整个井10倍后扫描提供胚胎杀伤性数据50-80胚胎每个条件。利用这一措施比较人口胚胎致死数据，用于控制运行之间的控制是一种有用的控制，可确保在菌株的健康、环境条件和处理步骤方面的一致性。当组合成像时，两个自定义报告菌株为大多数主要发育事件提供信息性读出，包括细胞命运规范、背端间膜、表皮外壳、伸长和神经发生（代表性控制图像如图2B所示，另见王等人10。
数据处理：自动胚胎裁剪和定向
通过我们的成像协议，每个高分辨率成像场包含1至5个胚胎;这些胚胎是随机定向的，并且经常彼此相邻。使用传统胚胎安装技术收集的数据也面临着同样的挑战。为了准备数据，以便随后进行可视化和分析，需要大量动手操作来裁剪和定向胚胎序列，以及预处理它们以减去背景、校正漂移和补偿信号衰减与深度。为了简化这个过程，建立了一个定制的胚胎裁剪程序，将每个胚胎从更广阔的领域分离和定向（图1C，图3）。该程序已打包为用户友好的独立程序，具有图形用户界面（GUI，与大多数成像平台的数据兼容），可以接收胚胎场的 3D 延时序列，并将其处理成单独的 tiff 系列对于该场中的每个胚胎（图3B，可https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）10，12。GUI 的 Python 源代码 （embryoCropUI.py） 和该程序的批处理版本 （screenCrop.py） 也可用于 GitHub （https://github.com/renatkh/embryo_crop.git）10、13上的有经验的 Python 用户。这个程序的核心功能是沿着前后轴定位、裁剪和定向胚胎。同时，可以使用可选的可调设置对数据集执行背景减法、衰减校正和漂移校正。
简单地说，自动裁剪软件迭代地检测从亮场图像中获得的二进制掩膜中的单个胚胎，并依次从所有通道裁剪胚胎，并沿前后轴定向图像（图3 B，首先在王等人10中描述。在裁剪之前，软件会校正漂移，减去背景，并在每个荧光通道（可选）中执行深度衰减校正。为了获得二进制掩码，该软件将Canny边缘检测21应用于亮场图像，对三个中心平面执行最大强度投影并填充小孔。该算法通过将卡西尼椭圆形安装到二进制掩码轮廓的一部分来检测单个胚胎（参见图3B，3C）。沿主轴对齐椭圆后，软件测量分离胚胎每半部分的红色荧光强度，并旋转胚胎，使红色强度朝向左侧，从而将胚胎前位于两个胚胎的左侧。本作品中使用的记者菌株（图3D）。该软件的试验表明，大多数胚胎被有效地裁剪，如预期的那样。小成像问题，如胚胎漂移、暂时的焦点平面损失（由于油中的气泡）或拥挤的胚胎田通常不会破坏成功的种植。然而，对于有大块胚胎（在z中有些重叠）的场，在成像平面（在Z中）明显倾斜的胚胎，长期焦点平面损失，或部分截断的胚胎，成功的裁剪并不总是实现。在数据采集阶段，通过更好的字段选择，可以轻松避免这些问题。总体而言，使用这种半高通量方法或使用传统安装方法收集的预处理数据是可视化和分析胚胎数据集的有用的第一步。
图像采集和数据处理方法的验证：在击倒40个先前描述的基因后可视化胚胎发育
为了验证这种半高通量图像收集方法和自定义裁剪机制，在自定义菌株中执行了一个小型 RNAi 屏幕，针对 40 个基因，这些基因具有细胞命运规范和形态生成中先前描述的功能（描述由王，奥乔亚，卡柳林和同事10，11。为此，针对每个靶点生成dsRNA，从每个菌株中注入L4动物，等待20-24小时，然后使用上述协议（完整数据集10，11）解剖胚胎并成像胚胎。通过RNAi实现发育表型需要抑制母体和酶基因表达。发育基因可以母体表达，结果的蛋白质产物被加载到胚胎中，或在胚胎中酶表达，或者在许多情况下，10，22，23。注射和胚胎拍摄之间的时间是有效定位母体和酶表达人群的关键变量;时间决定注入的dsRNA量，被加载到胚胎，以防止酶表达24和母体蛋白质耗尽的程度。dsRNA注射后，与靶向基因对应的母体mRNA降解，在相关时间间隔内无法恢复。预先存在的蛋白质消耗需要胚胎生产，通过加载到形成胚胎中，将母体蛋白从生殖系组织中排出。20-24小时在20°C是最短的孵育时间，允许持续的母体消耗;母体耗竭在以后的时间点（即注射后36-42小时）会变好。注入到胚胎中的dsRNA量决定了预防酶基因表达的有效性。注射后，当带有注射物质的胚胎首次受精时，加载的RNA量峰值约为5-10小时，此后下降。根据我们的经验，注射后24小时是最佳时间点，其中母体蛋白消耗和抑制酶基因表达都有效。对这项工作中使用的自定义报告菌株中的表型进行分析，通过40个测试基因集，表明我们的组合协议在涉及细胞命运的广泛基因中产生了不同、高度可重复的签名表型规格和形态生成（见王等人10）;完整的数据集可用11。作为这些数据的一个例子，图4A显示了用于控制的四个不同胚胎的静止图像，pha-4（RNAi），pal-1（RNAi）和mex-3（RNAi）。图4A。 有关在 40 基因 RNAi 屏幕中观察到的表型的更全面讨论，请参阅 Wang 等人10
ImageJ 宏：编译和可视化给定条件的所有数据
从单个 tiff 堆栈中可视化大量胚胎可能非常繁琐且耗时。从我们最初的努力，>400个胚胎被分离使用上述自定义自动裁剪程序。为了加快第一次分析，我们构建了一个ImageJ宏，该宏生成一个数组，为给定的RNAi条件在给定的应变背景下成像的所有胚胎（图4B）。对于阵列中的每个胚胎，将并排显示亮场图像和最大强度投影图像，用于生成复合影片文件。虽然此宏是编写为与我们的文件结构一起工作，但可以对其进行编辑以适应用户的文件结构。但是，为了获得最佳结果，用户应遵循协议中规定的命名和文件结构约定（请参阅 Zenodo 或 Github README 文件，了解有关 Python 和 ImageJ 应用程序命名约定的更多细节）。要查看所有 ImageJ 处理的数据，并获取对 40 基因测试集观察到的表型的更深入分析，请参阅存储在 Dryad 数据库10、11中的数据。这种 ImageJ 可视化格式可快速评估整体表型及其渗透，并可轻松标记数据质量问题，例如存在碎屑或失去焦平面。总体而言，半高通量数据采集方法、裁剪程序和ImageJ可视化工具相结合，结合定制报告机菌株，大大促进了胚胎发育研究的更大规模。
图 1.高含量成像方法、数据处理过程和基本工具概述。（A） 将标准基于agarose垫的方法的特点与本文所述的半高通量多井成像方法进行比较。（B） 监测胚胎发育的半高通量方法概述。有关详细信息，请参阅文本。（C） 数据处理和可视化工具概述，可用于使用传统的基于甘蔗垫的安装过程或本文所述的半高通量多孔板方法获得的数据。可以使用自定义裁剪程序处理来自一个字段（左）或多个 3 通道、4 维胚胎数据场的单个 3 通道时移胚胎序列，该程序与大多数成像平台上捕获的数据兼容。该程序的图形用户界面 （GUI） 版本是用户友好的，不需要任何编程专业知识。screenCrop.py应用程序需要 Python 专业知识，但它增加了功能，即它可以以批处理格式裁剪。这一步的输出是紧密裁剪，前后定向胚胎tiff堆栈。为了可视化来自单个条件的所有数据，构建了一个 ImageJ 宏，该宏用于编译裁剪、旋转的 tiff 堆栈，以在每个时间点显示每个胚胎的亮场图像和最大强度投影。（D） 面板显示了解剖和设置半高通量成像格式所需的基本工具。经王某等人许可，一些图构件转载。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.为C.elegans胚胎的高含量成像而生成的定制菌株。（A） 原理图说明了用于构造细菌层（上）和形态生成（底部）菌株的转基因。（B） 最大强度投影面板显示形态生成（顶部）和细菌层（底部）菌株的发育时间过程。图解图（左图）所示，显示了通风视图。时间是相对于逗号阶段（t = 0），这两个菌株都很容易识别。比例尺 = 10 μm.图经王等人许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.自定义裁剪程序将单个胚胎从成像领域分离和定向。（A） Schematic 说明了自定义胚胎裁剪程序的功能，并突出显示了访问此程序的两个选项：用户友好的 GUI 界面，该界面不需要编程专业知识，可在 Zenodo（左）和程序的批处理裁剪版本，这需要 Python 体验，并且可在 Github 上使用（右）。（B） 图形总结了自动裁剪算法 – 从 8 位亮场图像生成二进制掩码，并沿前后轴检测、裁剪和定向单个胚胎。刻度条是 10 μm . （C） 架构详细说明用于迭代检测二进制掩膜中的胚胎的过程。（D） Schematic 说明了沿前后轴定向胚胎的方法。经王某等人许可，B-D面板转载。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.自定义 ImageJ 宏通过为每个条件生成复合文件，实现 RNAi 筛选数据的可视化。（A） 显示来自 40 个基因测试集的三个示例 RNAi 条件的胚胎（参见 Wang 等人10，11完整数据集），突出显示每个测试组获得的不同特征表型条件以及每种条件中表型的可重复性。经王某等人许可，小组进行了修改。（B） 面板说明了自定义 ImageJ 宏 （OpenandCombine_embsV2.ijm） 如何将给定 RNAi 条件的胚胎阵列到复合 ImageJ 文件中，该文件在每个时间点阵列每个胚胎的亮场和最大强度投影。虽然仅突出显示一个示例，但此宏可以一次编译许多 RNAi 条件的数据。图像J宏可在泽诺多12。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这项工作描述了一套工具和方法，开发，使更大规模的努力，以分析基因在胚胎发育在C.elegans的功能。我们的半高通量方法允许在一次实验中以 20 分钟分辨率对胚胎发育进行 3D 延时成像，用于 80-100 个胚胎。虽然此协议可以适用于任何所需的标记菌株，但此工作演示了使用两种定制菌株来监测胚胎生成过程中事件的方法的潜力：（1） 胚层报告菌株，其中组织特定启动子驱动荧光组蛋白的表达，以标记内皮、中生代和外皮核，以及（2）形态发生报告应变，利用表皮和神经元启动子驱动细胞结中的荧光标记的表达，等离子膜。通过成像这两种菌株，可以非常详细地捕捉分子扰动对细胞命运规范和形态遗传事件的影响。为了应对这种方法生成的数据量所带来的挑战，开发了自定义工具，以简化数据处理和可视化。第一个工具在3D延时序列中从胚胎领域中裁剪单个胚胎，同时将胚胎旋转到标准的前后方向，并执行背景减法、漂移校正和衰减校正。这个程序被打包为一个用户友好的GUI（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）和源代码和更高级的批处理版本的程序为Python精明的用户（github.com/renatkh/embryo_crop.git）提供了10，12，13。最后，为了以有意义的格式可视化此处理的数据，设计了一个 ImageJ 宏;这允许用户在多板电影中可视化给定RNAi条件的所有胚胎，该电影在每个时间点显示每个胚胎的明亮场和最大强度投影。结合菌株、协议和数据处理工具，努力研究C.elegans胚胎的成形，在更大范围内进行更可行的努力。
虽然简单来说实现简单明了，但此处描述的半高吞吐量采集方法确实需要关注一些关键细节，下面将对此进行讨论。首先，用户必须能够使用具有精确点访问能力的共聚焦显微镜，该显微镜可配备多孔板支架。该协议最关键的考虑因素是显微镜保存在温度控制室中。虽然许多显微镜具有加热能力，但大多数显微镜无法可靠地冷却，因此必须调整环境温度以保持恒定的C. elegans友好温度。为此，成像室在16°C下举行。在成像过程中，仪器的样品区域加热至21-23 °C。室温的波动会影响发育时序，在点访问过程中会巧妙地改变焦点平面的精度，应尽量避免。请注意，在高于 23 °C 的温度下运行会导致控制条件下的胚胎杀伤力大幅上升，因此不可取。另一个关键考虑因素是胚胎选择和解剖过程中的分散。应注意避免将较老的胚胎转移到成像井中，因为孵化动物时往往会将相邻的胚胎从视野中移出;在媒体中加入麻醉剂可降低这种发病率。胚胎的分散，以避免大块的胚胎，也是一个关键的变量。当胚胎被转移到毛细管中太薄的孔中，或者当胚胎在解剖过程中没有充分分散时，就会发生结块。另一个考虑因素是点选择和焦点平面调谐需要时间。在这个过程中，板没有放在冰上，所以胚胎立即开始发育。对于本研究中使用的自定义标记菌株，在从冰上取出板后，大约有 90 分钟的窗口，以在标记开始表示之前完成板扫描和点选择。这足以在我们的仪器上设置这些菌株，但其他显微镜和应变可能会提供额外的时间挑战，将需要故障排除。最后，我们描述的方法采用60倍油目标，以20分钟的时间间隔收集50个油田的z堆栈。正如我们强调的，可以通过减少图像的字段数来增加时间分辨率。例如，10 个字段可以以 4 分钟的时间分辨率进行成像。增加时间分辨率的第二种选择是使用较低的放大倍率、高数值光圈目标;在这种情况下，较大的视野允许在更高的时间分辨率下对大量胚胎进行成像，而空间分辨率只有适度的降低。
为了在更大范围内实现数据处理和可视化，我们构建了自定义工具，并免费提供这些工具。最有用的工具是自定义裁剪 GUI，它不需要编程专业知识来操作。GUI 可用于在所有发育阶段裁剪和定向胚胎，并且与所有标记物兼容，因此不仅对发育生物学家有用，而且对研究早期胚胎过程的研究人员也很有用。由于GUI的输出是精确裁剪、定向、缩放、漂移校正的数据，因此数据可以很容易地输入自动化分析管道，使此工具可用于分析过去和未来的数据;如果使用适当的菌株，所得数据文件可用作现有自动分析机制的输入，如胚胎生成对齐工具25。为了使用该程序，用户必须意识到裁剪算法需要为每个步骤和时间点收集亮场或 DIC 图像。此外，用户还应注意，前后定向算法是基于细菌层报告器和形态生成报告菌株中红色信号的分布构建的，如本作品所示。因此，需要逐个案例研究评估其他标记菌株中 AP 方向的准确性。GUI 已在三个不同的共聚焦成像平台上收集数据，并且适用于多 tiff 堆栈和 tiff 系列。除了用户友好版本外，还提供了 GUI 的源代码和该程序的批处理版本，但需要注意的是，需要编程体验，并且需要遵循文件结构和命名约定。最后，构建了一个 ImageJ 处理宏，用于在每个 RNAi 条件下对所有胚胎进行原始图像堆栈，并编译一个信息数组，以显示每个时间点在亮场和荧光最大强度投影中的所有胚胎。此工具可以适应用户的规范，是一个有用的宏，使数据探索和质量控制评估更简单。
半高通量的拍摄方法以及本文所述的胚胎裁剪和图像处理工具将有助于分析C.elegans胚胎发育，使用各种突变体、扰动和标记菌株。在我们自己的实验室中，一个利用这些方法从两个定制工程菌株中薄膜胚胎的大型屏幕目前正在进行中，这些菌株是在敲除开发所需的2000个基因后描述的。最后，这项努力的数据将作为进一步资源，以增强在胚胎生成过程中了解细胞命运规范和形态遗传事件的努力。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有
Acknowledgments
S.D.O.得到了美国国家普通医学研究所赞助，加州大学圣地亚哥分校机构研究和学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）。A.D.和K.O.得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所也为他们提供了用于支持这项工作的研究资金。我们感谢安德鲁·奇斯霍尔姆在这个项目的早期阶段的建议，罗纳德·比格斯在最初方法开发阶段后为这个项目做出了贡献，戴夫·詹金斯和安迪·肖为小分子发现提供支持和访问组的高含量成像系统。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25 mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C.
- Wang, J. T., Seydoux, G.
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
- Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J.
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
