Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans
Summary
Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.
Abstract
C. elegans es el sistema principal para el análisis sistemático de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos durante el desarrollo embrionario. Un desafío es que la embriogénesis se desarrolla dinámicamente durante un período de aproximadamente 13 h; esta escala temporal de medio día ha limitado el alcance de los experimentos limitando el número de embriones que se pueden crear imágenes. Aquí, describimos un protocolo de semi-alto rendimiento que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones con resolución de tiempo moderada, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es sencillo y puede ser implementado por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidad de visita puntual. La utilidad de este protocolo se demuestra utilizándolo para crear una imagen de dos cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la especificación de la capa germinal y la morfogénesis. Para analizar los datos, se construyó un programa personalizado que recorta embriones individuales de un campo de visión más amplio en todos los canales, pasos z y puntos de tiempo y guarda las secuencias de cada embrión en una pila tiff independiente. El programa, que incluye una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar, agiliza el procesamiento de datos aislando, preprocesando y orientando uniformemente embriones individuales en preparación para la visualización o el análisis automatizado. También se suministra una macro ImageJ que compila datos de embriones individuales en un archivo multipanel que muestra la proyección de fluorescencia de máxima intensidad e imágenes de campo brillante para cada embrión en cada punto de tiempo. Los protocolos y herramientas descritos en este documento fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario tras el derribo de 40 genes de desarrollo descritos anteriormente; este análisis visualizó fenotipos de desarrollo previamente anotados y reveló otros nuevos. En resumen, este trabajo detalla un método de imagen de rendimiento semi-alto junto con un programa de recorte y una herramienta de visualización ImageJ que, cuando se combina con cepas que expresan marcadores fluorescentes informativos, acelera en gran medida los experimentos para analizar desarrollo embrionario.
Introduction
El embrión C. elegans es un importante sistema modelo para la biología celular mecanicista y el análisis de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos que impulsan el desarrollo embrionario1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Hasta la fecha, gran parte de la caracterización de eventos a nivel celular y especificación del destino celular en el embrión se ha logrado utilizando experimentos de imagen uno a uno de resolución temporal relativamente alta (es decir, adquisición cada 10–100 s) de embriones que expresan marcadores fluorescentes. Aunque es muy adecuado para eventos en el orden de segundos a decenas de minutos, este enfoque se convierte técnicamente en limitante para la caracterización de procesos más largos, en el orden de horas a días. El desarrollo embrionario desde el primer escote hasta el final del alargamiento toma alrededor de 10 h. En este tiempo, métodos de semi-alto rendimiento que permitirían imágenes simultáneas de menor resolución de tiempo (es decir, adquisición a intervalos de tiempo de 5-20 min) de cohortes más grandes de embriones, de diferentes condiciones, abrirían una nueva gama de experimentos; por ejemplo, permitir esfuerzos sistemáticos de cribado a gran escala y el análisis del número suficiente de embriones para comparar las consecuencias de las perturbaciones moleculares.
Aquí, describimos un método de semi-alto rendimiento para monitorear la embriogénesis de C. elegans que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es fácil de implementar y puede ser llevado a cabo por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidades de visita puntual. Los pasos principales en este protocolo se describen en la Figura 1. En resumen, los embriones se diseccionan de adultos gravídes que expresan marcadores fluorescentes de interés y transfieren embriones jóvenes (etapa de 2-8 células) a pozos de una placa de 384 pocillos para la toma de imágenes. En este formato, el tamaño relativamente pequeño del pozo canaliza los embriones en un área estrecha, lo que facilita la identificación de campos que contienen múltiples embriones para la toma de imágenes de lapso de tiempo. Para mantener un desarrollo más o menos sincrónico en toda la cohorte de embriones, las disecciones se realizan en medios refrigerados y la placa se mantiene en hielo, lo que impide un desarrollo significativo durante la ventana de tiempo de disección de una hora. La placa se transfiere al microscopio y los embriones se filman en una habitación con temperatura controlada durante la noche, a intervalos de tiempo de 20 minutos, utilizando una lente de inmersión en aceite de 60x 1.35 NA, para recoger todo el rango z en pasos de 2 m. Cincuenta campos, cada uno con entre 1-5 embriones, se utilizan en una sola carrera nocturna. Dependiendo del experimento deseado, la resolución de tiempo podría aumentarse (por ejemplo, imágenes a intervalos de 5-10 min) disminuyendo proporcionalmente el número de campos con imágenes.
Con este protocolo, incluso una sola ejecución nocturna genera una cantidad significativa de datos (80-100 embriones repartidos en 50 campos) y experimentos más grandes pueden volverse rápidamente inmanejables con respecto al análisis de datos. Para facilitar el procesamiento, la visualización y el análisis simplificado de estos datos, se creó un programa para recortar y orientar embriones y realizar pasos de preprocesamiento (opcional), y una macro ImageJ que compila los datos para simplificar la visualización. Estos programas se pueden utilizar para procesar imágenes recopiladas utilizando enfoques convencionales, ya que son independientes del método de imagen, que requieren un solo plano de campo brillante. El primer programa toma en un campo 4D que contiene múltiples embriones (opción GUI o código fuente embryoCrop.py) o múltiples campos 4D que contienen múltiples embriones (screenCrop.py), refuerza estrechamente los embriones y los orienta en una configuración anterior-posterior. Estos programas también ofrecen a los usuarios la opción de realizar la resta en segundo plano, la corrección de deriva y la corrección de atenuación. Los archivos resultantes son pilas tiff preprocesadas y estrechamente recortadas para cada embrión que son modificables para el análisis automatizado de imágenes. Para facilitar la visualización de todos los embriones para cada condición, se escribió una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), que ensambla todos los embriones de una condición dada en una sola pila tiff y matrices de imágenes de campo brillante y color de proyección de máxima intensidad ( RGB), en paralelo, para cada embrión. Los métodos fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario después de derribar 40 genes de desarrollo descritos anteriormente en un par de cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la capa germinal especificación y morfogénesis10,11. Juntos, el protocolo de imágenes embrionarias de rendimiento semi-alto y las herramientas de procesamiento de imágenes permitirán experimentos de mayor número de muestras y esfuerzos de cribado a gran escala destinados a comprender los procesos de desarrollo. Además, estas cepas también proporcionarán un medio eficaz para examinar los efectos de las perturbaciones moleculares en la embriogénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe un conjunto de herramientas y métodos que se desarrollaron para permitir esfuerzos a mayor escala para perfilar la función de los genes en el desarrollo embrionario en C. elegans. Nuestro método de semi-alto rendimiento permite imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo embrionario a una resolución de 20 minutos para 80-100 embriones en un solo experimento. Si bien este protocolo se puede adaptar para su uso con cualquier cepa de marcador deseada, este trabajo demuestra el potencial…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales patrocinado por la Universidad de California San Diego Institucional De investigación y el Premio de Desarrollo Académico de Carrera (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. y K.O. contaron con el apoyo del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, que también les proporcionó fondos de investigación utilizados para apoyar este trabajo. Estamos agradecidos a Andrew Chisholm por su consejo en las primeras fases de este proyecto, Ronald Biggs por las contribuciones a este proyecto después de la fase inicial de desarrollo del método, y Dave Jenkins y Andy Shiau por el apoyo y el acceso a la molécula de descubrimiento pequeño sistema de imágenes de alto contenido del grupo.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
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