Ett semi-högt dataflöde Imaging metod och data visualisering Toolkit för att analysera C. elegans embryonal utveckling
Summary
Detta arbete beskriver ett semi-högt dataflöde protokoll som tillåter samtidig 3D Time-lapse Imaging av embryogenes i 80-100 C. elegans embryon i en enda över natten springa. Dessutom ingår verktyg för bildbehandling och visualisering för att effektivisera dataanalysen. Kombinationen av dessa metoder med anpassade reporter stammar möjliggör detaljerad övervakning av embryogenes.
Abstract
C. elegans är det främsta systemet för systematisk analys av cellöde specifikation och morfogenetiska händelser under embryonal utveckling. En utmaning är att embryogenes dynamiskt utspelar sig under en period av ca 13 h; Denna halvdag långa tidsskalan har begränsat omfattningen av experiment genom att begränsa antalet embryon som kan avbildas. Här beskriver vi en semi-högt dataflöde protokoll som möjliggör samtidig 3D tidsförlopp avbildning av utvecklingen i 80 – 100 embryon vid måttlig tid upplösning, från upp till 14 olika förhållanden, i en enda övernattning. Protokollet är enkelt och kan implementeras av alla laboratorier med tillgång till ett Mikroskop med punkt besöks kapacitet. Nyttan av detta protokoll visas genom att använda den för att bilden två specialbyggda stammar uttrycker fluorescerande markörer optimerad för att visualisera viktiga aspekter av bakterie-skikt specifikation och morfogenes. För att analysera data, ett anpassat program som Beskär enskilda embryon ur ett bredare synfält i alla kanaler, z-steg, och tidpunkter och sparar sekvenser för varje embryo i en separat TIFF-stacken byggdes. Programmet, som innehåller ett användarvänligt grafiskt användargränssnitt (GUI), effektiviserar databehandling genom att isolera, förbehandling, och enhetligt orientera enskilda embryon som förberedelse för visualisering eller automatiserad analys. Levereras också är en ImageJ makro som sammanställer enskilda embryo data till en multi-panel fil som visar maximal intensitet fluorescens projektion och brightfield bilder för varje embryo vid varje tidpunkt. De protokoll och verktyg som beskrivs häri validerades genom att använda dem för att karakterisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna utvecklingsgener; denna analys visualiseras tidigare kommenterade utvecklingsmässiga fenotyper och avslöjade nya. Sammanfattnings, detta arbete Detaljer en semi-högt dataflöde Imaging metod tillsammans med ett beskärnings program och ImageJ visualiseringsverktyg som, när de kombineras med stammar som uttrycker informativa fluorescerande markörer, kraftigt accelererar experiment för att analysera embryonal utveckling.
Introduction
C. elegans embryot är ett viktigt modellsystem för mekanistisk cellbiologi och analys av cell öde specifikation och morfogenetiska händelser drivande embryonal utveckling1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Hittills har mycket av karakteriseringen av både cellulära-nivå händelser och cell öde specifikation i embryot uppnåtts med hjälp av relativt hög temporala upplösning en-vid-en-tid bildbehandling experiment (dvs., förvärv varje 10-100 s) av embryon som uttrycker fluorescerande markörer. Även om det lämpar sig väl för händelser i storleksordningen sekunder till tiotals minuter, blir denna metod tekniskt begränsande för karakterisering av längre processer, på order av timmar till dagar. Embryonal utveckling från första klyvning till slutet av förlängningen tar ca 10 h. Vid denna tidsskala, semi-högt genomflöde metoder som skulle möjliggöra samtidig lägre tidsupplösning bildbehandling (dvs., förvärv på 5 – 20 min tidsintervall) av större kohorter av embryon, från olika förhållanden, skulle öppna upp en ny rad experiment; till exempel möjliggöra systematiska storskaliga screening insatser och analys av tillräckligt antal embryon för jämförelser av konsekvenserna av molekylära störningar.
Här beskriver vi en semi-högt genomflöde metod för övervakning C. elegans embryogenes som möjliggör samtidig 3D tidsförlopp avbildning av utvecklingen i 80 – 100 embryon, från upp till 14 olika förhållanden, i en enda övernattning. Protokollet är enkelt att genomföra och kan utföras av alla laboratorier med tillgång till ett Mikroskop med punkt besökande kapacitet. De viktigaste stegen i detta protokoll beskrivs i figur 1. I korthet, embryon dissekeras från dräktiga vuxna uttrycker fluorescerande markörer av intresse och överföra unga embryon (2-8 cell Stadium) till brunnar i en 384-brunn plattan för avbildning. I detta format, den relativt små väl storlek trattar embryon i ett smalt område, vilket underlättar identifieringen av fält som innehåller flera embryon för Time-lapse Imaging. För att bibehålla en ungefär synkron utveckling över kohorten av embryon, är dissektioner utförs i kylda medier och plattan hålls på is, vilket förhindrar betydande utveckling under den timlånga dissektion tidsfönster. Plattan överförs till Mikroskop och embryon är filmade i ett temperaturkontrollerat rum över natten, på 20 min tidsintervall, med hjälp av en 60x oljeimmersion 1,35 NA lins, att samla in hela z-Range i 2 μm steg. 50 fält, som var och en innehåller mellan 1 – 5 embryon, avbildas i en enda övernattning. Beroende på önskat experiment kan tidsupplösningen ökas (t. ex. bildtagning med 5 – 10 minuters mellanrum) genom att proportionellt minska antalet avbildade fält.
Med detta protokoll, även en enda över natten kör genererar en betydande mängd data (80-100 embryon utspridda över 50 fält) och större experiment kan snabbt bli ohanterliga med avseende på dataanalys. För att underlätta bearbetning, visualisering och effektivisera analys av dessa data, ett program byggdes för att beskära ut och orientera embryon och utföra Pre-processing steg (tillval), och en ImageJ makro som sammanställer data för att förenkla visning. Dessa program kan användas för att bearbeta bilder som samlats in med konventionella metoder, eftersom de är oberoende av avbildnings metoden, vilket kräver endast ett enda brightfield-plan. Det första programmet tar i en 4D fält som innehåller flera embryon (GUI alternativ eller källkod embryoCrop.py) eller flera 4D fält som innehåller flera embryon (screenCrop.py), tätt grödor embryon och orienterar dem i en anterior-posterior konfiguration. Dessa program ger också användarna möjlighet att utföra bakgrunds subtraktion, avdrift korrigering, och dämpning korrigering. De resulterande filerna är enhetligt förbehandlade, tätt beskurna TIFF stackar för varje embryo som är tillägg till automatiserad bildanalys. För att göra det enklare att se alla embryon för varje villkor, en ImageJ Macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) skrevs, som monterar alla embryon från ett givet tillstånd till en enda TIFF-stack och matriser brightfield bilder och maximal intensitet projektion färg ( RGB) överlagringar, sida vid sida, för varje embryo. Metoderna validerades genom att använda dem för att karakterisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna utvecklingsgener i ett par specialbyggda stammar uttrycker fluorescerande markörer optimerad för att visualisera viktiga aspekter av köns skiktet specifikation och morfogenes10,11. Tillsammans kommer semi-High genomströmning embryo Imaging Protocol och verktyg bildbehandling möjliggör högre prov antal experiment och storskaliga screening insatser för att förstå utvecklingsprocesser. Dessutom, dessa stammar kommer också att ge ett effektivt sätt att undersöka effekterna av molekylära störningar på embryogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver en uppsättning verktyg och metoder som utvecklats för att möjliggöra större ansträngningar för att profilera funktionen av gener i embryonal utveckling i C. elegans. Vår semi-högt genomströmning metod tillåter 3D tidsförlopp avbildning av embryonal utveckling vid 20 min upplösning för 80 – 100 embryon i ett enda experiment. Även om detta protokoll kan anpassas för användning med någon önskad markör stam (er), detta arbete visar potentialen av metoden med hjälp av tv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. stöddes av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper-sponsrade University of California San Diego institutionell forskning och akademiska karriärutveckling Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. och K.O. stöddes av Ludwig Institutet för cancer forskning, som också gav dem forskningsfinansiering som används för att stödja detta arbete. Vi är tacksamma mot Andrew Chisholm för hans råd i de tidiga faserna av detta projekt, Ronald Biggs för bidrag till detta projekt efter den inledande metoden utvecklingsfasen, och Dave Jenkins och Andy shiau för stöd och tillgång till den lilla molekyl upptäckten koncernens system för hög innehålls avbildning.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
