Summary
Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.
Abstract
Pancreas adenocarcinoom (PDAC) behoort tot de meest dodelijke maligniteiten. Onlangs zijn de volgende-generatie organoïde cultuur methoden die de 3-dimensionale (3D) modellering van deze ziekte mogelijk maken beschreven. Patiënt-afgeleide organoïde (Bob) modellen kunnen worden geïsoleerd van zowel chirurgische specimens als kleine biopsieën en vormen snel in de cultuur. Belangrijker is dat organoïde modellen de pathogene genetische veranderingen in de tumor van de patiënt behouden en voorspellend zijn voor de behandelings respons van de patiënt, waardoor translationele studies mogelijk zijn. Hier bieden we uitgebreide protocollen voor het aanpassen van weefselcultuur workflow om 3D, matrix Embedded, organoïde modellen te bestuderen. We geven gedetailleerde methoden en overwegingen voor het isoleren en doorgeven van primaire PDAC organoïden. Verder beschrijven we hoe op maat gemaakte organoïde-media worden bereid en kwaliteitscontrole in het laboratorium. Ten slotte beschrijven we assays voor downstreamkarakterisatie van de organoïde modellen zoals isolatie van nucleïnezuren (DNA en RNA), en drug testen. Belangrijk is dat we kritische overwegingen voor de implementatie van organoïde methodologie in een onderzoek laboratorium.
Introduction
Het pancreas adenocarcinoom (PDAC) is een dodelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een late diagnose bij de meeste patiënten, een gebrek aan effectieve therapieën en een resulterende lage totale overlevingskans van 5 jaar die minder dan 10%1blijft. Slechts 20% van de patiënten wordt gediagnosticeerd met een gelokaliseerde ziekte die geschikt is voor curatieve chirurgische ingrepen2,3. De resterende patiënten worden doorgaans behandeld met een combinatie van chemotherapeutische middelen die werkzaam zijn bij een minderheid van de patiënten4,5. Om deze dringende klinische behoeften aan te pakken, zijn onderzoekers actief bezig met vroegtijdige detectie strategieën en de ontwikkeling van effectievere therapieën. Om de klinische vertaling van belangrijke ontdekkingen te versnellen, maken wetenschappers gebruik van genetisch gemanipuleerde muismodellen, patiënt afgeleide xenografts, monolaag cellijnen, en, meest recentelijk, organoïde modellen6.
Driedimensionale epitheliale organoïde cultuur met behulp van groeifactor en WNT-ligand rijke voorwaarden ter stimulering van de proliferatie van niet-getransformeerde voorlopercellen werden voor het eerst beschreven voor de muis darm7 en werden snel aangepast aan de normale menselijke alvleesklier weefsel8. Naast normale ductale weefsel, organoïde methodologie maakt het mogelijk voor de isolatie, uitbreiding, en studie van de menselijke PDAC8. Belangrijk is dat de methode de oprichting van organoïden uit chirurgische specimens ondersteunt, evenals fijne en kern naald biopsieën, waardoor onderzoekers alle stadia van de ziekte9,10kunnen bestuderen. Belangwekkend, patiënt-afgeleide organoïden even goed beschreven tumor Transcriptomic subtypen en kan ontwikkeling van precisie geneeskunde platformen9,11.
De huidige organoïde protocollen voor PDAC maken de succesvolle expansie van meer dan 70% van de patiënt monsters van chemo-naïeve patiënten9mogelijk. Hier presenteren we de standaardmethoden die door ons laboratorium worden gebruikt om patiënt afgeleide PDAC-organoïden te isoleren, uit te breiden en te karakteriseren. Andere organoïde methodologieën van PDAC zijn12,13 beschreven, maar geen vergelijking van deze methode is grondig uitgevoerd. Omdat deze technologie relatief nieuw is en snel vordert, verwachten we dat deze protocollen zullen blijven evolueren en verbeteren; de principes van weefselbehandeling en organoïde cultuur zullen echter nuttig blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke weefsel verzameling voor onderzoek gebruik werd beoordeeld en goedgekeurd door onze interne Review Board (IRB). Alle volgende protocollen worden onder aseptische omstandigheden uitgevoerd in een laboratoriumomgeving voor weefselkweek in zoogdieren.
1. Media voorbereiding
- Geconditioneerde media voorbereiding.
Opmerking: de menselijke alvleesklier organoïde media vereist overvloedige groeifactoren en voedingsstoffen evenals geconditioneerde media suppletie om voldoende groei stimulatie te bieden voor organoïde expansie. Beide geconditioneerde mediums die hieronder worden beschreven, worden bereid uit in de handel verkrijgbare cellijnen (Zie tabel met materialen). Raadpleeg de websites van de fabrikant voor volledige protocollen en materialen.- Produceer R-spondin1 geconditioneerde media volgens het Protocol van de fabrikant.
- Vouw eerst de 293T cellen uit die R-spondin1 uitdrukken met behulp van geschikte antibiotica (Zeocin) selectiemethoden in de aanwezigheid van overvloedig serum (10%). Bij het produceren van geconditioneerde media, trekt u de antibiotica selectie en het serum weg, zodat er geen antibiotica en serum aanwezig zijn in de uiteindelijke geconditioneerde media. Belangrijk is dat de geconditioneerde media na de inzameling (0,2 μm) gesteriliseerd moeten worden om kruisbesmetting te voorkomen.
- Bewaar aliciteerde geconditioneerde media bij 4 °C voor kortstondig gebruik (binnen 6 maanden) of bij-20 °C voor lange termijn opslag (meer dan 6 maanden). Vries-dooi cycli moeten worden vermeden.
- Produceer media van L-WNT-3A met airconditioning volgens het Protocol van de fabrikant.
- Vouw eerst de L-M (TK-) cellen uit die L-WNT-3A uitdrukken met behulp van geschikte antibiotica (G-418) selectiemethoden in de aanwezigheid van overvloedig serum (10%). Bij het produceren van geconditioneerde media, de antibiotica selectie intrekken en wegspoelen, zodat er geen antibioticum aanwezig is in de uiteindelijke geconditioneerde media; echter, handhaven van het serum gedurende de kweek en conditionering. Belangrijker is dat de verzamelde geconditioneerde media filter gesteriliseerd (0,2 μm) moet zijn om kruisbesmetting te voorkomen.
- Bewaar de aliciteerde geconditioneerde media bij 4 °C voor kortstondig gebruik, of-20 °C voor lange termijn opslag. Vries-dooi cycli moeten worden vermeden.
- Voor kwaliteitscontrole voert u een TOPFLITS test uit om de Wnt-activiteit van R-spondin1 en de L-WNT-3A-media alleen en in combinatie met een eerder gepubliceerd protocol14te testen.
- Produceer R-spondin1 geconditioneerde media volgens het Protocol van de fabrikant.
- Basale media voorbereiding: gebruik basale media voor de bereiding van volledige organoïde media en wasstappen voor organoïde werk. Supplement Advanced DMEM/F-12 met glutamine bij een uiteindelijke concentratie van 1x, HEPES (10 mM) en Penicillaire/streptomycine (100 U/mL). De basale media bewaren bij 4 °C.
- Organoid complete media voorbereiding: aanvulling van de basale media met R-spondin1 geconditioneerde media in een uiteindelijke concentratie van 10% v/v, L-WNT-3A geconditioneerde media met een eindconcentratie van 50% v/v, menselijk EFG (50 ng/mL), humane FGF (100 ng/mL), humaan gastrine I (10 nM), muis Noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), B27 supplement (1x), Nicotinamide (10 mM), N-Acetylcysteïne (1,25 mM) en Primocine (100 μg/mL).
- Voor primaire organoïde isolaties, ontdooide organoïde culturen en culturen beginnend met enkele cellen, omvatten Rho kinase remmer Y-27632 bij een eindconcentratie van 10,5 μM.
- Bereid de menselijke organoïde complete media op ijs en bewaar deze op 4 °c voor gebruik binnen een maand. Om deze reden, raden wij aan verse wekelijkse voorbereiding van de media.
2. isolatie van PDAC Organoïden
Let op: ontdooien de kelder membraan extract (BME) oplossing (groeifactor verlaagd; Zie tabel van de materialen) op ijs in een 4 ° c omgeving (koelkast of koude ruimte) voor ten minste 12 h voorafgaand aan gebruik. Incuberen de weefselkweek platen voor de organoïde cultuur in een incubator van 37 °c gedurende ten minste 12 uur voorafgaand aan gebruik.
- Verzamelen en vervoeren van een chirurgisch verwijderde tumor specimen voor onderzoek in een gebufferde opslagoplossing om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Gebruik basale media of een in de handel verkrijgbare weefsel opslagoplossing.
- Doorgaan met het isoleren van organoïden zo snel mogelijk na ontvangst van het preparaat. Weefsel kan worden opgeslagen in de opslagoplossing tot 24 uur na de operatie en nog steeds organoïden opleveren.
- Eenmaal in het laboratorium, overdracht van tumor naar een 10 cm weefselcultuur schotel en verwijder opslagoplossing.
- Tijdens het hanteren van het weefsel met metalen Tang, gehakt de tumor met een #10 scalpel in kleine fragmenten van 1 mm3 of kleiner. Grotere fragmenten zullen langer duren om te verteren; Daarom, streven naar het genereren van homogeen weefsel fragment maten. Als het weefsel al is uitgesplitste of kleiner is dan 1 mm3 fragmenten, sla deze stap dan over.
- Breng de weefsel fragmenten over in een conische buis van 15 mL met 10 mL basale media. Meng door de buis meerdere malen te inverteren. Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 5 minuten. Na het draaien, verwijder de basale media zorgvuldig om te voorkomen dat het verliezen van weefsel fragmenten.
- Voeg aan de buis met de weefsel fragmenten 9 mL basale media en 1 mL 10x zachte Collagenase/hyaluronidase oplossing toe. Om klontering van cellen tijdens de spijsvertering te voorkomen, aanvulling op deze oplossing met 20 μL van 10 mg/mL DNAse I oplossing. Meng door de buis meerdere malen te inverteren.
- Incuberen de enzymatische spijsvertering bij 37 °C op een nutator of rotator. Voor een adequate menging tijdens de spijsvertering, moeten de weefsel fragmenten voortdurend door de oplossing bewegen.
Opmerking: de timing voor deze enzymatische dissociatie van de tumor moet voor elk monster empirisch worden bepaald. Een succesvolle vertering van de tumor wordt gekenmerkt door de afname van de grootte van de weefsel fragmenten totdat ze niet duidelijk te onderscheiden zijn met het blote oog. Tegelijkertijd zal de ondoorzichtigheid van de oplossing toenemen naarmate microscopische weefsel fragmenten vrijkomen. - Na 30 min, verwijder de conische buis van de 37 ° c incubator en observeer. Als de weefsel fragmenten nog steeds duidelijk zichtbaar zijn, gaat u verder met de dissociatie bij 37 °C met constante menging. Herhaal deze waarneming elke 30 minuten totdat de meeste of alle weefsel fragmenten zijn losgekoppeld. Afhankelijk van de striktheid van het mengen, evenals de grootte en hoeveelheid van tumor fragmenten, deze stap kan nemen zo weinig als 30 min voor kleine specimens of zo lang als 12 h voor grotere tumormonsters.
- Zodra de enzymatische dissociatie is voltooid, centrifugeer de buis op 200 x g gedurende 5 minuten. Na het draaien moet een celpellet zichtbaar zijn en moet het supernatant helder zijn, wat aangeeft dat alle cellen uit de oplossing zijn gesponnen. Als dat niet het geval is, herhaalt u de spin.
- Verwijder voorzichtig de supernatant om te voorkomen dat de celpellet verliest. Was de cellen onmiddellijk met 10 mL basale media door de buisjes met inversie zachtjes te mengen. Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de basale media om te voorkomen dat cellen verloren gaan en herhaal deze wasstap nog één keer voor een totaal van twee wasjes.
- Na de tweede wasbeurt, verwijder alle basale media zorgvuldig en plaats de buis op ijs voor 5 min.
- Plaats op dit moment een aliquot van organoïde complete media in een waterbad van 37 °c tot voorverwarmen.
- Meng de celpellet met ijskoud BME met behoud van de buis op ijs. De zaai dichtheid moet hoog zijn voor organoïde isolatie. Gebruik voor een kleine pellet (~ 50 μL volume) 200 μL BME, terwijl voor een grote pellet (~ 200 μL volume) 800 μL BME gebruikt. Meng de cellen en BME op ijs met behulp van een P200 pipet totdat de oplossing homogeen lijkt terwijl het maken van bubbels in de oplossing wordt vermeden.
- Spot een koepel van 100 μL in het midden van een put van een voorverwarmde 12-put plaat met behulp van een P200 pipet. Herhaal dit totdat alle BME-oplossingen zijn afgeleverd. Breng de plaat voorzichtig over in de incubator van 37 °C zodat de BME-gel stollen.
- Haal na 10 minuten de plaat op en voeg 1 ml voorverwarmde organoïde complete media toe per put. Verdeel de media aan de zijkant van de put om verstoring van de BME Dome te voorkomen.
- Observeer de celfragmenten met behulp van een omgekeerde weefselkweek Microscoop met een 4x-lens in brightfield.
Opmerking: enkelvoudige cellen en microscopische weefsel fragmenten moeten duidelijk zichtbaar zijn. Een succesvolle isolatie wordt gekenmerkt door het verschijnen van meer dan 10 organoïden na 24 – 48 h; de cultuur moet binnen een week Confluent Health zijn. Aangezien tumor specimens heterogeen zijn, zijn sommige organoïde isolaties uitdagender omdat slechts een paar organoïden per put groeien, zoals weergegeven in Figuur 1. Laat in dit geval de cultuur maximaal twee weken aanhouden om het aantal cellen dat beschikbaar is voor het doorvoeren te maximaliseren. Om het Media verbruik en de verdamping tijdens de kweek te voorkomen, vult u de culturen met 200 μL voorverwarmde organoïde complete media om de 5 dagen.
3. passage van PDAC Organoïden
- Haal de plaat uit de weefselkweek incubator. Met een steriele cellifter moet u de BME Dome voorzichtig optillen zodat deze in de volledige media zweeft. Vermijd het schrapen van de bodem van de put om geen monolaag cellen aan het plastic te verwijderen, omdat dit meestal fibroblasten zijn.
- Met een P1000 pipet breng je de BME Dome en de media voorzichtig over naar een conische buis van 15 mL. Herhaal deze stap voor elke organoid-bevattende goed.
- Was elke put voorzichtig die werd geoogst met 1 mL koude basale media, en breng over naar de 15 mL tube met de organoïden.
- Meng de oplossing en organoïden grondig met een P1000 pipet en draai gedurende 5 minuten omlaag bij 200 x g . Na het spinnen verschijnt een BME-laag met organoïden in suspensie en een organoïde-pellet aan de onderkant van de buis. Verwijder voorzichtig de supernatant, Vermijd verlies van de BME/organoid laag. Plaats de buis op ijs.
- Voeg 10 mL ijskoude celherstel oplossing (CRS) toe aan de buis en meng door inversie grondig. Dit zal de eiwit matrices van de opgestijfde BME op 4 °c depolymeriseren. Inincuberen op ijs gedurende 30 minuten tijdens het mengen om de 3 minuten in de omversie. Indien beschikbaar, plaats de buis op een roterende mixer in een koude kamer of 4 °C koelkast gedurende 30 min.
- Na de incubatie van 30 minuten, spin naar beneden op 200 x g gedurende 5 min. De organoïde pellet moet duidelijk zijn terwijl de BME-laag weg moet zijn. Als de BME-laag in omvang is afgenomen maar nog steeds zichtbaar is, inbroed dan 30 minuten extra bij 4 °C met mengen en herhaal spin.
- Zodra de BME is gedepolymeriseerd, verwijder de CRS verlaten achter de organoïde pellet. Was de organoïden met 10 mL basale media door te mengen met inversie. Draai gedurende 5 minuten op 200 x g en verwijder het supernatant. Plaats de buis gedurende ten minste 5 minuten met de organoïde korrel op ijs.
- Indien gewenst, als een preparaat van één cel gewenst is, incuberen de organoïden met 3 mL trypsine aangevuld met 30 μL van 10 mg/mL DNAse I oplossing om klontering van cellen tijdens de spijsvertering te voorkomen.
- Incubatie van de enzymatische reactie bij 37 °c met zachte inversie mengen elke 2 min tot 10 min. Bewaak en bevestig de succesvolle eencellige dissociatie onder brightfield Microscoop.
- Om de enzymatische reactie te stoppen, voeg 10 mL ijskoude basale media toe en spin naar beneden bij 200 x g gedurende 5 minuten.
- Was cellen met 10 mL basale media door te mengen met zachte inversie. Spin naar beneden bij 200 x g gedurende 5 minuten en verwijder de supernatant en herhaal de wassing nog een keer. Plaats de buis gedurende ten minste 5 minuten met de celpellet op ijs.
Opmerking: we raden aan om deze stap elke 3-5 passages tijdens regelmatig onderhoud van de organoïden om homogene cultuur met een groot aantal organoïden te genereren.
- Voeg ijskoude BME toe aan de celpellet en meng zachtjes op het ijs tot de oplossing homogeen is met een P200 pipet. Vermijd het opwekken van bubbels in het mengsel, Pipetteer op en neer ten minste 5 – 10x, plaats de punt van de pipet dicht bij de onderkant van de buis om de organoïden mechanisch te breken. Als een gids, gebruik 4 – 6x het volume van de BME/cel pellet zodanig dat de kloof verhouding is niet meer dan 1:2 van de ene passage naar de andere.
- Spot een koepel van 100 μL in het midden van een put van een voorverwarmde 12-put plaat met behulp van een P200 pipet; Herhaal dit totdat alle BME-oplossingen zijn afgeleverd. Breng de plaat voorzichtig over in de incubator van 37 °C zodat de BME-gel stollen. Haal na 10 minuten de plaat op en voeg 1 ml voorverwarmde organoïde complete media toe per put. Verdeel de media aan de zijkant van de put om verstoring van de BME Dome te voorkomen.
- Organoïden moeten worden hervormd en binnen 24 uur beginnen te groeien. Organoid culturen zijn meestal doorgangen ooit 7-10 dagen afhankelijk van de cultuur dichtheid en celproliferatie. Vul indien nodig de culturen met 200 μL voorverwarmde organoïde complete media om de 5 dagen om de groeifactor depletie en verdamping te compenseren.
4. invriezen en ontdooien van PDAC-Organoïden
- Om de organoïden te bevriezen, gaat u verder om de organoïden te oogsten en de BME te depolymeriseren zoals beschreven in stap 3.1 – 3.7.
- Voeg aan de celpellet 1 mL Vries medium toe, meng zachtjes en breng het mengsel over naar een vooraf gelabelde cryoflacon.
- Plaats de cryovial in een Vries container om een veilige constante temperatuurdaling te handhaven en plaats in een vriezer van 80 °C. Na 24 tot 48 h, de bevroren flacons overbrengen naar vloeibare stikstof opslag. Organoïden kunnen worden cryopreserved voor maanden tot jaren met behulp van deze methode.
- Om de organoïden te ontdooien, haalt u de bevroren cryovial op uit de opslag van vloeibare stikstof. Vervoer de bevroren injectieflacon op droogijs naar de weefselkweek kamer.
- Plaats de bevroren cryovial in het waterbad van 37 °C om de organoïden snel te ontdooien en breng de inhoud van de injectieflacon over in een conische buis van 15 mL met 9 mL basale media die tot kamertemperatuur zijn opgewarmd.
- Draai gedurende 5 minuten op 200 x g en verwijder het supernatant. Plaats de buis gedurende ten minste 5 minuten met de organoïde korrel op ijs.
- Ga verder met respenderen in BME en plaat de organoïden zoals beschreven in de stappen 3.9 – 3.11.
Opmerking: Organoïde culturen herstellen langzaam na een vries/dooi-cyclus, daarom kunnen culturen tot twee weken voor de passage worden gekweekt.
5. karakterisering van PDAC Organoïden
Opmerking: de karakterisering van de organoïden moet worden uitgevoerd op een gevestigde cultuur na verschillende passages om het risico van besmetting van niet-epitheliale celtypen zoals fibroblasten en immuuncellen te verminderen.
- Nucleïnezuur extractie van PDAC organoïden
- Plaat organoïden op een 12-put plaat gewijd aan nucleïnezuur extractie. Plaat niet meer dan 100 μL BME per put. Voor voldoende DNA/RNA-opbrengst, plaat ten minste 2 – 4 putten per cultuur. Kweek organoïden tot 5 dagen totdat culturen dicht bij de Confluent Health zijn, maar verstoken zijn van het buitensporige celvuil dat zich ophoopt in culturen op langere termijn.
- Haal de plaat uit de 37 ° c incubator en Verwijder volledig alle sporen van organoïde complete media, waardoor alleen de BME koepel met de organoïden op de plaat.
- Voeg 900 μL zuur fenol reagens (zie tabel met materialen) toe aan elk goed en meng grondig met een P1000 pipet totdat de oplossing homogeen wordt. De BME zal volledig worden opgelost in het zuur fenol reagens en organoïden zullen na een korte incubatie van 5 minuten lyse zijn.
Let op: zuur fenol is een gevaarlijke chemische stof die chemische brandwonden kan veroorzaken. Voorzichtig omgaan met de juiste bescherming en techniek. - Breng de homogene oplossing over in een buis van 2 mL en voeg 200 μL chloroform toe. Inincuberen 5 min en centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
- Ga naar de RNA-en DNA-extractie volgens het Protocol van de fabrikant. RNA kan worden geëxtraheerd uit de waterige fase terwijl DNA kan worden geëxtraheerd uit de interfase en organische fase. Eenmaal gezuiverd en gekwantificeerd, kunnen RNA en DNA geïsoleerd van verschillende putjes van dezelfde cultuur worden samengevoegd om de opbrengst te verhogen.
Opmerking: (1) Hoewel we sterk aanbevelen om deze nucleïnezuurextractie methode voor RNA te gebruiken, zijn er veel goede methoden om DNA van gekweekte cellen te isoleren. (2) om de aanwezigheid van tumorcellen binnen de organoïde cultuur te achterhalen, raden we aan om het DNA te sequentiëren met behulp van uw favoriete sequentie methode van de volgende generatie om mutaties binnen PDAC Hallmark-genen te identificeren (kras, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Farmacotypie van PDAC organoïden
- Isoleer enkelvoudige cellen uit organoïden zoals hierboven beschreven in de stappen 3.1 – 3.8. Om het aantal cellen te maximaliseren, oogst ten minste 10 confluente putten van een 12 putplaat
- Respendeer enkele cellen in 1 ml humane organoïde complete media. De aanwezigheid van kleine celklonters (~ 2 – 10 cellen) is acceptabel, maar grotere celklonten zullen de downstream-analyse negatief beïnvloeden.
- Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller en record cel levensvatbaarheid. Bereken het totale aantal cellen en levensvatbare cellen aanwezig in de 1 mL suspensie.
- Voor therapeutische testen, plaat 1.000 levensvatbare cellen per put van een 384 put plaat. Voor een 384 goed plaat schatten we dat we 400.000 levensvatbare cellen zullen gebruiken (berekend voor 400 Wells).
- Bereid de cellen voor op het plateren door te mengen op ijs 800 μL BME met 7,2 ml organoïde complete media die de cellen bevatten. Houd mengsel op ijs en plaat 20 μL per put van een 384 goed plaat. Gebruik een 12-kanaals pipet en een reservoir dat op ijs wordt gehouden om de cellen efficiënt te plaat. Om overmatige verdamping van de plaat te voorkomen, kunnen de buitenste putten worden gebruikt als een reservoir (60 μL PBS of water per putje), maar dit zal leiden tot een verlies van 76 experimentele putten.
- Draai de plaat gedurende 1 minuut op 100 x g in een zwenk emmer. Hierdoor kan het kleine 20 μL volume en de organoïden zich aan de onderkant van de plaat vestigen.
- Plaats de plaat in de weefselkweek Incubator van 37 °C om organoïden te laten vormen. Controleer na 24 uur of er organoïden aanwezig zijn met een brightfield-Microscoop.
- Overgaan tot doseren therapeutische verbindingen opgelost in DMSO op de plaat met behulp van een drug printer of gelijkwaardig instrument. Test elke dosis van het medicijn in ten minste drievat putten. Om een effectieve dosis-respons analyse uit te voeren, Bepaal het doseringsbereik voor elk medicijn empirisch, beginnend met een laag, ineffectief, dosis en eindigend met een hoge dosis waar het maximale effect wordt waargenomen. Voorbeelden van doseringsbereik voor chemotherapeutische verbindingen zijn onlangs gepubliceerd9.
- Bloot de cellen aan de therapeutische verbindingen voor 3 – 5 dagen.
- Indien gewenst, aan het einde van de test, afbeelding van de plaat te evalueren van het therapeutische effect op organoïde grootte, aantal, en morfologie.
- Evalueer de levensvatbaarheid met 20 μL per put van het levensvatbaarheid van de luminescentie cel (Zie tabel met materialen) volgens het Protocol van de fabrikant. Een luminometer is nodig voor data-acquisitie en een grafische software voor data-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ter illustratie van de uitdagingen in verband met het isoleren van organoïden van PDAC, tonen we de oprichting van een patiënt afgeleide organoïde cultuur van een kleine hypocellulaire tumor monster. Na de initiële plating waren slechts enkele organoïden zichtbaar per put, zoals weergegeven in Figuur 1. Organoïden mochten groter worden in de periode van 2 weken en werden volgens ons protocol doorgegeven om een robuustere cultuur te creëren, zoals te zien is in de vroege en late passage 1 representatieve Foto's (Figuur 1). Het is belangrijk op te merken dat de grotere Cystic organoïden waargenomen in de late primaire isolaat gemakkelijk werden opgesplitst in kleinere fragmenten tijdens het mengen van organoïden met ijskoude BME, zoals beschreven in stap 2,13.
Om de uitkomst van het protocol voor farmacotypie te demonstreren, bereidden we enkele cellen voor van een gevestigde en snel groeiende representatieve PDAC organoïde zoals beschreven in dit protocol. 1.000 levensvatbare cellen werden per put geplateerd en konden gedurende 24 uur herstellen voordat cytotoxische chemotherapeutische middelen, Gemcitabine en paclitaxel, werden gedoseerd. We voerden een 9-punts dosisrespons test uit in drievlaat beginnend met een lage dosis van 100 pM en eindigend met een hoge dosis van 2 μM. Na 5 dagen behandeling werden representatieve Foto's genomen voor voertuigen (DMSO), 2 μM Gemcitabine en 2 μM met paclitaxel behandelde putjes (Figuur 2). Onmiddellijk na het nemen van de Foto's, de levensvatbaarheid van de cel werd beoordeeld met behulp van luminescentie cel levensvatbaarheid reagens en getekend met behulp van grafische software (Figuur 2).
Figuur 1: representatieve Foto's worden getoond voor een PDAC organoïde isolatie en na de eerste passage. Zowel vroege (1 – 3 dagen) als late (7 – 10 dagen) tijdpunten zijn aangetoond om de organoïde groei in de loop van de tijd te illustreren. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: dosisrespons analyse. Links Representatieve dosisrespons analyse verkregen met behulp van een gevestigde PDAC organoïde cultuur, met standaarddeviatie van triplicaten weergegeven als foutbalken. Tijdelijk Foto's ter illustratie van het effect aan het einde van de test van het voertuig (DMSO), evenals 2 μM Gemcitabine en 2 μM paclitaxel. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we de huidige protocollen voor het isoleren, uitbreiden en karakteriseren van patiënten afgeleide PDAC organoïden. Ons huidige succespercentage van het oprichten van organoïde cultuur is meer dan 70%; Daarom, deze methoden zijn nog niet geperfectioneerd en worden verwacht te verbeteren en evolueren in de tijd. Er moet belangrijke aandacht worden geschonken aan de steekproefgrootte, aangezien PDAC een lage neoplastische cellulariteit heeft. Dientengevolge, kleine specimens zal bevatten weinig tumorcellen, en zal alleen het genereren van een handvol organoïden. Bovendien krijgen veel patiënten een chemotherapie-en/of chemoradiatie-gebaseerde neoadjuvante behandeling voorafgaand aan chirurgische ingreep15. Als de behandeling is effectief voor een bepaalde patiënt, het tumorweefsel kan worden verstoken van levensvatbare cellen. Verwerving van chemo-naïeve patiënt monsters heeft de voorkeur voor de initiële optimalisatie van deze methoden, maar dit is niet altijd mogelijk. Interessant is dat we hebben geconstateerd dat ischemie tijd na chirurgische verwijdering van het tumorweefsel is niet een belangrijk criterium voor succesvolle organoïde isolatie, zolang het monster wordt verwerkt binnen 24 h.
Alvleesklier ductaal adenocarcinoom is een ziekte gekenmerkt door een sterke desmoplastische reactie en afzetting van een dichte stromale matrix. Hoewel organoïden een uitstekend hulpmiddel zijn voor de snelle isolatie en uitbreiding van het epitheel compartiment, wordt de complexe stroma van PDAC niet samengevat in het model. Andere methodologieën zoals patiënt afgeleide xenotransplantaten16 of Air Liquid interface Culture17 zorgen voor een stromale compartiment, maar ze kunnen een uitdaging zijn om snel uit te breiden. Bij het kiezen van een modelsysteem, de onderzoeker moet zorgvuldig overwegen de sterke en zwakke punten van elke6.
De heterogene biologie van deze ziekte beïnvloedt de organoïde inrichting, omdat sommige patiënt-afgeleide organogeniden extreem goed groeien in onze omstandigheden, terwijl andere veel langzamer zijn door vergelijking. De bovenstaande protocollen beschrijven een WNT ligand rijke voorwaarde om te isoleren en uit te breiden alle patiënt-afgeleide organoïden, maar anderen hebben aangetoond dat sommige patiënten tumoren kunnen groeien in de afwezigheid van WNT geconditioneerde media11,12. Verder testen zal nodig zijn om te bepalen of het gebruik van een reeks van media-omstandigheden verbetert de succesvolle oprichting van organoïden, zoals onlangs werd aangetoond voor ovariële kanker organoïden18. Deze multiplex aanpak is echter beperkt door het lage aantal tumorcellen die kunnen worden geïsoleerd van kleine patiënt monsters. Bovendien kunnen normale niet-getransformeerde ductale organoïden ontstaan uit een organoïde-isolatie, vooral als het tumorweefsel grenst aan normaal weefsel9. Om het risico van normale organoïde verontreiniging te verminderen, kunnen grotere weefselmonsters worden onderverdeeld in kleinere onafhankelijke fragmenten met behulp van morfologische verschillen zoals goed gevasculariseerde (bloed is zichtbaar) versus hypovasculaire gebieden, en harde knobbeltjes versus zacht weefsel.
De methoden en protocollen die hier worden beschreven, zijn de huidige standaard benaderingen die in ons laboratorium worden gebruikt voor organoïde-isolatie en moeten worden getest en aangepast voor elke laboratoriumomgeving. Bijvoorbeeld, de enzymatische dissociatie (stappen 2,6 aan 2,9) van het tumorweefsel is vooral belangrijk om te optimaliseren. Kleine apparatuurverschillen (nutator versus Rotator mixer) kunnen leiden tot aanzienlijk verschillende timing voor deze stap. Bovendien kan de weefsel dissociatie fijnafgesteld worden door de concentratie van het Collagenase/hyaluronidase mengsel te verhogen of te verminderen. Er moet voor worden gezorgd dat alle monsters niet op dezelfde wijze worden behandeld. In sommige gevallen kunnen organoïden bijvoorbeeld worden geïsoleerd van ascites-vloeistof van gevorderde PDAC-patiënten zonder mechanische of enzymatische dissociatie.
DNA-sequencing is de huidige gouden standaard om de aanwezigheid of afwezigheid van tumor organoïden te bepalen, aangezien PDAC wordt gedreven door frequente mutaties in KRAS, TP53, SMAD4 en CDKN2A. Transcriptomic analyse kan verschillende tumor subtypen onthullen terwijl farmacotyping patiënt-specifieke therapeutische kwetsbaarheden kan ontdekken9. Deze protocollen stellen PDAC-onderzoekers in staat om hun eigen bibliotheek met patiënt afgeleide organoïden te ontwikkelen en om de biologie van deze modellen te profiel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de steun van de UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository en weefsel technologie gedeelde bron, leden van de Lowy laboratorium, en de UC San Diego Department of Surgery, afdeling Chirurgische oncologie. AML wordt royaal ondersteund door NIH CA155620, een SU2C CRUK Lustgarten Foundation pancreatic cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), en donoren van het Fonds om pancreaskanker te genezen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C.
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
