Summary
Culturas organóides derivadas do paciente de adenocarcinoma ductal pancreático são um modelo tridimensional rapidamente estabelecido que representa compartimentos de células tumorais epiteliais com alta fidelidade, permitindo a pesquisa translacional sobre essa malignidade letal. Aqui, fornecemos métodos detalhados para estabelecer e propagar organóides, bem como para realizar ensaios biológicos relevantes usando esses modelos.
Abstract
O adenocarcinoma ductal pancreatic (PDAC) está entre as malignidades as mais letais. Recentemente, métodos de cultura organóide de última geração que permitem a modelagem tridimensional (3D) desta doença foram descritos. Os modelos organóides (DOP) derivados do paciente podem ser isolados de espécimes cirúrgicos, bem como de pequenas biópsias e se formar rapidamente na cultura. É importante ressaltar que os modelos organóides preservam as alterações genéticas patogênicas detectadas no tumor do paciente e são preditivos da resposta ao tratamento do paciente, possibilitando estudos translacionais. Aqui, fornecemos protocolos abrangentes para adaptar o fluxo de trabalho da cultura do tecido para estudar modelos organóides em 3D, matriz embutida. Detalhamos métodos e considerações para isolar e propagar organóides PDAC primários. Além disso, descrevemos como a mídia organóide medida é preparada e a qualidade controlada em laboratório. Finalmente, descrevemos ensaios para caracterização a jusante dos modelos organóides, como isolamento de ácidos nucleicos (DNA e RNA) e testes de drogas. É importante ressaltar que fornecemos considerações críticas para a implementação da metodologia organóide em um laboratório de pesquisa.
Introduction
O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é uma doença letal caracterizada pelo diagnóstico tardio na maioria dos pacientes, a falta de terapias eficazes e uma baixa taxa de sobrevida global resultante de 5 anos que permanece inferior a 10%1. Apenas 20% dos pacientes são diagnosticados com uma doença localizada adequada para intervenção cirúrgica curativa2,3. Os pacientes restantes são tratados tipicamente com uma combinação de agentes quimioterápicos que são eficazes em uma minoria dos pacientes4,5. Para atender a essas necessidades clínicas prementes, os pesquisadores estão trabalhando ativamente em estratégias de detecção precoce e no desenvolvimento de terapias mais eficazes. Para acelerar a tradução clínica de descobertas importantes, os cientistas estão empregando modelos de camundongos geneticamente modificados, xenoenxertos derivados de pacientes, linhas de células monocamadas e, mais recentemente, modelos organóides6.
A cultura epiteliana tridimensional do organóide do epitelida usando o fator de crescimento e as condições ricas do Wnt-ligand para estimular a proliferação de pilhas untransformed do progenitor foi descrita primeiramente para o intestino7 do rato e foi adaptada rapidamente ao tecido pancreatic humano normal8. Além do tecido ductal normal, a metodologia organóide permite o isolamento, expansão e estudo do PDAC humano8. Importante, o método suporta o estabelecimento dos organoids dos espécimes cirúrgicos, assim como biópsias finas e do núcleo da agulha, permitindo que os investigadores estudem todos os estágios da doença9,10. Curiosamente, organóides derivados do paciente recapitulam subtipos transcritormicos tumorais bem descritos e podem permitir o desenvolvimento de plataformas de medicina de precisão9,11.
Os protocolos organóides atuais para PDAC permitem a expansão bem-sucedida de mais de 70% das amostras de pacientes de pacientes quimio-ingênuos9. Aqui apresentamos os métodos padrão empregados pelo nosso laboratório para isolar, expandir e caracterizar organóides PDAC derivados do paciente. Outras metodologias organóides do PDAC foram descritas12,13, mas nenhuma comparação desses métodos foi realizada minuciosamente. Como essa tecnologia é relativamente nova e avança rapidamente, esperamos que esses protocolos continuem a evoluir e melhorar; no entanto, os princípios do manuseio de tecidos e da cultura organóide continuarão a ser úteis.
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Protocol
Toda a coleta de tecidos humanos para uso de pesquisa foi revisada e aprovada pelo nosso Internal Review Board (IRB). Todos os seguintes protocolos são realizados condições assépticas em um ambiente de laboratório de cultura de tecidos de mamíferos.
1. Preparação para a mídia
- Preparação condicionada dos meios.
NOTA: A mídia organóide pancreática humana requer fatores de crescimento e nutrientes abundantes, bem como suplementação de mídia condicionada para fornecer estimulação de crescimento suficiente para a expansão organóide. Ambos os meios condicionados descritos abaixo são preparados a partir de linhas celulares comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais). Para protocolos e materiais completos, consulte os sites dos fabricantes.- Produzir R-spondin1 mídia condicionada de acordo com o protocolo do fabricante.
- Primeiro, expanda as células 293T que expressam R-spondin1 usando métodos de seleção adequados de antibióticos (Zeocina) na presença de soro abundante (10%). Ao produzir meios condicionados, retire e lave a seleção e o soro antibióticos de tal forma que nenhum antibiótico e soro estão presentes nos meios de comunicação condicionados finais. É importante ressaltar que os meios de comunicação condicionados devem ser filtrados esterilizados após a coleta (0,2 μm) para evitar a contaminação cruzada.
- Armazenar aliquoted mídia condicionada em 4 °C para uso a curto prazo (dentro de 6 meses) ou em -20 °C para armazenamento a longo prazo (mais de 6 meses). Os ciclos de congelamento-degelo devem ser evitados.
- Produzir L-Wnt-3A mídia condicionada de acordo com o protocolo do fabricante.
- Primeiro, expanda as células L-M (TK-) expressando L-Wnt-3A usando métodos de seleção adequados de antibióticos (G-418) na presença de soro abundante (10%). Ao produzir meios de comunicação condicionados, retire e lave a seleção de antibióticos de tal forma que nenhum antibiótico está presente nos meios de comunicação condicionados finais; no entanto, manter o soro em todo o cultivo e condicionamento. É importante ressaltar que os meios de comunicação condicionados coletados devem ser filtrados esterilizados (0,2 μm) para evitar a contaminação cruzada.
- Guarde a mídia alicitada condicionada a 4 °C para uso a curto prazo, ou -20 °C para armazenamento a longo prazo. Os ciclos de congelamento-degelo devem ser evitados.
- Para controle de qualidade, realize um ensaio TOPFLASH para testar a atividade wnt de R-spondin1 e a mídia condicionada l-Wnt-3A sozinha e em combinação de acordo com um protocolo publicado anteriormente14.
- Produzir R-spondin1 mídia condicionada de acordo com o protocolo do fabricante.
- Preparação basal dos meios: Use meios basal para a preparação de meios completos do organoid assim como etapas de lavagem para o trabalho organoid. Suplemento avançado DMEM/F-12 com glutamina em uma concentração final de 1x, HEPES (10 mM) e penicilina/estreptomicina (100 U/mL). Armazenar mídia basal em 4 °C.
- Organoid Preparação completa da mídia: Complemente a mídia basal com r-spondin1 mídia condicionada em uma concentração final de 10% v / v, L-Wnt-3A mídia condicionada em uma concentração final de 50% v / v, EGF humano (50 ng/mL), FGF humano (100 ng/mL), Gastrin Humano I (10 nM), Mouse Noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), suplemento B27 (1x), Nicotinamida (10 mM), N-acetilcysteine (1,25 mM) e Primocin (100 μg/mL).
- Para isolamentos organóides primários, culturas organóides descongeladas e culturas que começam com células individuais incluem o inibidor de quinase Rho Y-27632, com uma concentração final de 10,5 μM.
- Prepare os meios completos organóides humanos no gelo e guarde a 4°C para uso dentro de um mês. Por esta razão, recomendamos uma nova preparação semanal dos meios de comunicação.
2. Isolamento de Organóides PDAC
NOTA: Descongele a solução de extrato de membrana do porão (BME) (fator de crescimento reduzido; ver Tabela de Materiais) no gelo em um ambiente de 4 °C (geladeira ou sala fria) por pelo menos 12 h antes do uso. Incubar as placas de cultura de tecidos para a cultura organóide em uma incubadora de 37 °C por pelo menos 12 h antes do uso.
- Coletar e transportar um espécime tumoral removido cirurgicamente para pesquisa em uma solução de armazenamento tampão para manter a viabilidade do tecido. Use mídia basal ou uma solução de armazenamento de tecido comercialmente disponível.
- Prossiga para isolar organóides o mais rápido possível após receber o espécime. O tecido pode ser armazenado na solução de armazenamento até 24 h pós-cirurgia e ainda produzir organóides.
- Uma vez no laboratório, transfira o tumor para um prato de cultura de tecido de 10 cm e remova a solução de armazenamento.
- Ao manusear o tecido com fórceps metálicos, picar o tumor com um #10 bisturi em pequenos fragmentos de 1 mm3 ou menor. Fragmentos maiores levarão mais tempo para digerir; portanto, o objetivo é gerar tamanhos homogêneos de fragmentos de tecido. Se o tecido já estiver desagregado ou em fragmentos menores do que 1 mm3, pule esta etapa.
- Transfira os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de mídia basal. Misture invertendo o tubo várias vezes. Centrífuga do tubo a 200 x g por 5 min. Após a rotação, remova os meios basal com cuidado para evitar fragmentos de tecido perdedores.
- Ao tubo que contém os fragmentos de tecido adicione 9 mL de mídia basal e 1 mL de 10x solução de colagem suave/hialuronidase. Para evitar a aglomeração de células durante a digestão, complemente esta solução com 20 μL de 10 mg/mL DNAse I solução. Misture invertendo o tubo várias vezes.
- Incubar a digestão enzimática a 37 °C em um nutator ou rotador. Para a mistura adequada durante a digestão, os fragmentos de tecido devem estar constantemente se movendo através da solução.
NOTA: O sincronismo para esta dissociação enzimática do tumor deve ser determinado empiricamente para cada espécime. Uma digestão bem sucedida do tumor é caracterizada pela diminuição no tamanho dos fragmentos do tecido até que não sejam claramente discerníveis ao olho despido. Concomitantemente, a opacidade da solução aumentará à medida que fragmentos de tecido microscópicos forem liberados. - Após 30 min, retire o tubo cônico da incubadora de 37 °C e observe. Se os fragmentos de tecido ainda são claramente visíveis, continue a dissociação a 37 °C com mistura constante. Repita esta observação a cada 30 min até que a maioria ou todos os fragmentos de tecido tenham sido dissociados. Dependendo da dilha da mistura, bem como o tamanho ea quantidade de fragmentos de tumor, este passo pode demorar tão pouco quanto 30 min para pequenos espécimes ou enquanto 12 h para amostras de tumor maior.
- Uma vez que a dissociação enzimática está completa, centrífuga o tubo em 200 x g para 5 min. Após a rotação, uma pelota de célula deve ser visível e o supernatant deve ser claro, indicando que todas as células foram giradas para fora da solução. Se aquele não for o caso, repita a rotação.
- Retire cuidadosamente o supernatant para evitar perder a pelota celular. Lave imediatamente as células com 10 mL de mídia basal, misturando suavemente os tubos com inversão. Centrífuga do tubo a 200 x g para 5 min. Cuidadosamente remover a mídia basal para evitar a perda de células e repetir este passo de lavagem mais uma vez para um total de duas lavagens.
- Após a segunda lavagem, retire todos os meios basal com cuidado e coloque o tubo no gelo por 5 min.
- Neste momento, coloque um alibamento de organóide sinuoso completo em um banho de água de 37 °C para pré-aquecer.
- Misture a pelota celular com BME gelada, mantendo o tubo no gelo. A densidade de semeades deve ser elevada para o isolamento organóide. Para uma pequena pelota (~50 μL volume) use 200 μL de BME, enquanto que para uma grande pelota (~ 200 μL volume) usar 800 μL de BME. Misture as células e BME no gelo usando uma pipeta p200 até que a solução pareça homogênea, evitando a criação de bolhas na solução.
- Avise uma cúpula de 100 μL no centro de um poço de uma placa de 12 poços pré-aquecida usando uma pipeta p200. Repita isso até que toda a solução BME tenha sido dispensada. Transfira cuidadosamente a placa para a incubadora de 37 °C para permitir que o gel BME se solidifique.
- Após 10 min, recuperar a placa e adicionar 1 mL de mídia pré-aquecido organóide completo por poço. Dispensar a mídia do lado do poço para evitar a interrupção da cúpula BME.
- Observe os fragmentos celulares usando um microscópio de cultura de tecido invertido usando uma lente 4x em brightfield.
NOTA: Células individuais e fragmentos de tecido microscópico devem ser claramente visíveis. Um isolamento bem sucedido é caracterizado pelo aparecimento de mais de 10 organóides após 24-48 h; a cultura deve ser confluente dentro de uma semana. Como os espécimes tumorais são heterogêneos, alguns isolamentos organóides são mais desafiadores, pois apenas alguns organóides crescem por poço, como mostrado na Figura 1. Neste caso, permita que a cultura continue por até duas semanas para maximizar o número de pilhas disponíveis para a passagem. Para dar conta do consumo de mídia e evaporação durante a cultura, completar as culturas com 200 μL de organóide pré-aquecido mídia completa a cada 5 dias.
3. Passaging de Organóides PDAC
- Recuperar a placa da incubadora da cultura do tecido. Com um levantador de células estéreis, levante suavemente a cúpula BME de tal forma que está flutuando na mídia completa. Evite raspar o fundo do poço de modo a não remover quaisquer células monocamadas ligadas ao plástico, como estes são tipicamente fibroblastos.
- Com uma pipeta p1000, transfira cuidadosamente a cúpula e a mídia da BME para um tubo cônico de 15 mL. Repita este passo para cada poço contendo organóides.
- Lave delicadamente cada poço que foi colhido com 1 mL de mídia fria basal, e transferir para o tubo de 15 mL contendo os organóides.
- Misture completamente a solução e organóides com uma pipeta p1000 e gire para baixo em 200 x g para 5 min. Após a fiação, uma camada de BME contendo organóides em suspensão e uma pelota organóide aparecerá na parte inferior do tubo. Retire cuidadosamente o supernatant, evitando a perda da camada BME/organóide. Coloque o tubo no gelo.
- Adicione 10 mL de solução de recuperação de células geladas (CRS) ao tubo e misture completamente por inversão. Isso irá despolimerizar as matrizes de proteína do BME gelificado em 4 °C. Incubar no gelo por 30 min ao misturar cada 3 min pela inversão. Se disponível, coloque o tubo em uma batedeira rotativa em uma sala fria ou geladeira de 4 °C por 30 min.
- Após a incubação de 30 min, gire para baixo em 200 x g para 5 min. A pelota organóide deve ser aparente, enquanto a camada de BME deve ter ido embora. Se a camada de BME é diminuída em tamanho, mas ainda visível, incubar por um adicional de 30 min em 4 °C com mistura e rotação repetida.
- Uma vez que o BME foi depolymerized, remova o CRS que sae atrás da pelota organoid. Lave os organóides com 10 mL de mídia basal, misturando-se com a inversão. Desça a 200 x g por 5 min e retire o supernatant. Coloque o tubo com a pelota organóide no gelo por pelo menos 5 min.
- Opcionalmente, se for desejada uma única preparação celular, incubar os organóides com trippsina de 3 mL complementada com 30 μL de 10 mg/mL DNAse I solução para evitar aglomeração de células durante a digestão.
- Incubar a reação enzimática a 37 °C com inversão suave misturando cada 2 min por até 10 min. Monitor e confirmar a dissociação bem sucedida de célulaúnica microscópio de campo brilhante.
- Para parar a reação enzimática, adicione 10 mL de mídia gelada gelada e gire para baixo em 200 x g para 5 min.
- Lave as células com 10 mL de mídia basal, misturando-se com inversão suave. Despine-se a 200 x g por 5 min e retire o supernatant e repita a lavagem mais uma vez. Coloque o tubo com a pelota de célula no gelo por pelo menos 5 min.
NOTA: Recomendamos realizar esta etapa a cada 3-5 passagens durante a manutenção regular dos organóides para gerar cultura homogênea com um grande número de organóides.
- Adicione o bme frio do gelo à pelota da pilha e misture delicadamente no gelo até que a solução seja homogênea usando uma pipeta p200. Evitando gerar bolhas na mistura, pipeta para cima e para baixo pelo menos 5-10x, colocando a ponta da pipeta perto do fundo do tubo para ajudar mecanicamente quebrar os organóides. Como guia, use 4-6x o volume da pelota BME/cell de tal forma que a proporção de divisão não é superior a 1:2 de uma passagem para a outra.
- Avise uma cúpula de 100 μL no centro de um poço de uma placa de 12 poços pré-aquecida usando uma pipeta p200; repita até que toda a solução BME tenha sido dispensada. Transfira cuidadosamente a placa para a incubadora de 37 °C para permitir que o gel BME se solidifique. Após 10 min, recuperar a placa e adicionar 1 mL de mídia pré-aquecido organóide completo por poço. Dispensar a mídia do lado do poço para evitar a interrupção da cúpula BME.
- Organóides devem reformar e começar a crescer dentro de 24 h. Culturas organóides são normalmente passagens sempre 7-10 dias, dependendo da densidade cultural e proliferação celular. Se necessário, completar as culturas com 200 μL de pré-aquecido organóide mídia completa a cada 5 dias para compensar o esgotamento do fator de crescimento e evaporação.
4. Congelamento e Descongelamento de Organóides PDAC
- Para congelar os organóides, proceder à colheita dos organóides e despolimerizar o BME, como descrito nos passos 3.1-3.7.
- Para a pelota celular, adicione 1 mL de mídia gelada, misture suavemente e transfira a mistura para um criovial pré-rotulado.
- Coloque o criovial em um recipiente congelante para manter uma diminuição de temperatura constante segura e coloque em um freezer de -80 °C. Após 24 a 48 h, transfira os frascos congelados para o armazenamento líquido de nitrogênio. Organóides podem ser criopreservados por meses a anos usando este método.
- Para descongelar os organóides, recuperar o criovial congelado do armazenamento líquido de nitrogênio. Transporte o frasco congelado no gelo seco ao quarto da cultura do tecido.
- Coloque o criovial congelado no banho de água de 37 °C para descongelar rapidamente os organóides e transfira o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de mídia basal aquecido à temperatura ambiente.
- Desça a 200 x g por 5 min e retire o supernatant. Coloque o tubo com a pelota organóide no gelo por pelo menos 5 min.
- Proceder a resuspender em BME e placa os organóides, como descrito nos passos 3,9-3,11.
NOTA: As culturas organóides se recuperam lentamente após um ciclo de congelamento/degelo, portanto, as culturas podem ser cultivadas por até duas semanas antes da passagem.
5. Caracterização de Organóides PDAC
NOTA: A caracterização dos organóides deve ser realizada em uma cultura estabelecida após várias passagens para diminuir o risco de contaminação de tipos de células não epiteliais, como fibroblastos e células imunes.
- Extração de ácido nucleico de organóides PDAC
- Organóides de placa em uma placa de 12 poços dedicada à extração de ácido nucleico. Placa não mais de 100 μL de BME por poço. Para o rendimento adequado do ADN/RNA, placa pelo menos 2-4 poços por a cultura. Crescer organóides por até 5 dias até que as culturas estão perto de confluent, mas desprovido dos detritos celulares excessivos que se acumulam em culturas de longo prazo.
- Recuperar a placa da incubadora de 37 °C e remover completamente todos os vestígios de mídia organóide completo, deixando apenas a cúpula BME contendo os organóides na placa.
- Adicione 900 μL de reagente fenol ácido (ver Tabela de Materiais)para cada poço e misture completamente usando uma pipeta p1000 até que a solução se torne homogênea. O BME será dissolvido completamente no reagente ácido do phenol e os organoids lyse após uma incubação curta de 5 min.
CUIDADO: O fenol ácido é um produto químico perigoso que pode causar queimaduras químicas. Lidar com cuidado usando proteções adequadas e técnica. - Transfira a solução homogênea para um tubo de 2 mL e adicione 200 μL de clorofórmio. Incubar 5 min e centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Vá para a extração de RNA e DNA de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA pode ser extraído da fase aquosa, enquanto o DNA pode ser extraído da fase interfase e orgânica. Uma vez purificado e quantificado, RNA e DNA isolados de diferentes poços da mesma cultura podem ser agrupados para aumentar o rendimento.
NOTA: (1) Enquanto recomendamos fortemente o uso deste método de extração de ácido nucleico para RNA, existem muitos bons métodos para isolar o DNA das células cultivadas. (2) Para verificar a presença de células tumorais dentro da cultura organóide, recomendamos sequenciar o DNA usando seu método de sequenciamento de próxima geração preferido para identificar mutações dentro dos genes de marca PDAC (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Farmacotipagem de organóides PDAC
- Isolar células individuais de organóides, como descrito acima nos passos 3,1-3,8. Para maximizar o número celular, colher pelo menos 10 poços de confluentes de uma placa de 12 poços
- Resuspenda células individuais em 1 mL organóide humano completo mídia. A presença de pequenos grupos celulares (~ 2-10 células) é aceitável, no entanto grupos celulares maiores afetarão negativamente a análise a jusante.
- Contar as células usando um contador de células automatizado e viabilidade celular recorde. Calcule o número total de células e células viáveis presentes na suspensão de 1 mL.
- Para testes terapêuticos, placa 1.000 células viáveis por poço de uma placa de 384 poços. Para uma placa de 384 poços estimamos que usaremos 400.000 células viáveis (calculadas para 400 poços).
- Prepare as células para o revestimento misturando no gelo 800 μL de BME com 7,2 mL de mídia completa organóide contendo as células. Mantenha a mistura no gelo e placa 20 μL por poço de uma placa de 384 poços. Use uma pipeta de 12 canais e um reservatório mantidono gelo para placa eficientedas as pilhas. Para evitar a evaporação excessiva da placa, os poços exteriores podem ser usados como um reservatório (60 μL PBS ou água por poço), mas isso levará a uma perda de 76 poços experimentais.
- Gire a placa para baixo em 100 x g para 1 min em um balde de balanço. Isso permite que o pequeno volume de 20 μL e organóides para resolver na parte inferior da placa.
- Coloque a placa na incubadora de cultura de tecido de 37 °C para permitir a forma de organóides. Após 24 h, verifique se há presença de organóides usando um microscópio de campo brilhante.
- Proceder à dosagem compostos terapêuticos dissolvidos em DMSO para a placa usando uma impressora de drogas ou instrumento equivalente. Teste cada dose de droga em poços pelo menos triplicados. Para realizar uma análise eficaz da dose-resposta, determine a escala da dose para cada droga empiricamente, começando com uma baixa, ineficaz, dose e terminando com uma dose elevada onde o efeito máximo é observado. Exemplos de faixas de dose para compostos quimioterápicos foram recentemente publicados9.
- Expor as células para os compostos terapêuticos por 3-5 dias.
- Opcionalmente, no final do ensaio, a imagem da placa para avaliar o efeito terapêutico sobre o tamanho organóide, número e morfologia.
- Avalie a viabilidade usando 20 μL por poço de reagente de viabilidade celular de luminescência (ver Tabela de Materiais) deacordo com o protocolo do fabricante. Um luminometer será necessário para a aquisição de dados e um software de grafógrafo para análise de dados.
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Representative Results
Para ilustrar os desafios associados ao isolamento de organóides do PDAC, mostramos o estabelecimento de uma cultura organóide derivada do paciente a partir de uma pequena amostra tumoral hipocelular. Após o revestimento inicial, apenas alguns organóides eram visíveis por poço, como mostrado na Figura 1. Organóides foram autorizados a crescer mais ao longo do período de 2 semanas e foram passados de acordo com o nosso protocolo para estabelecer uma cultura mais robusta, como mostrado na passagem inicial e tardia 1 quadros representativos (Figura 1). É importante notar que os organóides císticos maiores observados no isolamento primário tardio foram facilmente divididos em fragmentos menores durante a mistura de organóides com BME gelado, como descrito no passo 2.13.
Para demonstrar o resultado do protocolo de farmacotipagem, preparamos células únicas de um organóide PDAC representativo estabelecido e em rápido crescimento, conforme descrito neste protocolo. 1.000 células viáveis foram banhadas por poço e autorizadas a recuperar mais de 24 h antes que agentes quimioterápicos citotóxicos, Gemcitabine e Paclitaxel fossem dosados. Realizamos um ensaio de resposta de dose de 9 pontos em triplicado, começando com uma dose baixa de 100 pM e terminando com uma dose alta de 2 μM. Após o tratamento de 5 dias, foram tiradas fotos representativas para veículos (DMSO), 2 μM Gemcitabine e 2 μM Paclitaxel tratados poços(Figura 2). Imediatamente após tirar as fotos, a viabilidade celular foi avaliada usando reagente de viabilidade celular de luminescência e traçada usando software de grafógrafo(Figura 2).
Figura 1: Fotos representativas são mostradas para um isolamento organóide do PDAC, bem como após a primeira passagem. Tanto cedo (1-3 dias) e tarde (7-10 dias) pontos de tempo são mostrados para ilustrar o crescimento organóide ao longo do tempo. Barra de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Análise de resposta dose. (Esquerda) Análise representativa de resposta à dose obtida usando uma cultura organóide PDAC estabelecida, com desvio padrão de triplicados mostrados como barras de erro. (Direita) Fotos que ilustram o efeito no final do ensaio do tratamento do veículo (DMSO), bem como 2 μM Gemcitabine e 2 μM Paclitaxel. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Aqui, apresentamos protocolos atuais para isolar, expandir e caracterizar organóides PDAC derivados do paciente. Nossa taxa de sucesso atual de estabelecer a cultura organóide é superior a 70%; Portanto, esses métodos ainda não foram aperfeiçoados e espera-se que melhorem e evoluam ao longo do tempo. Deve ser dada uma consideração importante ao tamanho da amostra, pois o PDAC tem uma baixa celularidade neoplástica. Consequentemente, pequenos espécimes conterão poucas células tumorais e gerarão apenas um punhado de organóides. Além disso, muitos pacientes recebem tratamento neoadjuvante à base de quimioterapia e/ou quimioradiação antes da intervenção cirúrgica15. Se o tratamento é eficaz para um determinado paciente, o tecido tumoral pode ser desprovido de células viáveis. A aquisição de amostras de pacientes quimioés é preferida para otimização inicial desses métodos, mas isso nem sempre é possível. Curiosamente, descobrimos que o tempo de isquemia após a remoção cirúrgica do tecido tumoral não é um critério importante para o isolamento organóide bem sucedido, desde que a amostra seja processada dentro de 24 h.
O adenocarcinoma ductal pancreatic é uma doença caracterizada por uma reação e por uma deposição desmoplástico fortes de uma matriz estrol densa. Enquanto organóides são uma excelente ferramenta para o rápido isolamento e expansão do compartimento epiteliais, o modelo não recapitula o estroma complexo do PDAC. Outras metodologias, como xenoenxertos derivados do paciente16 ou cultura de interface de líquido de ar17 permitem um compartimento estrol, no entanto, eles podem ser um desafio para expandir rapidamente. Ao escolher um sistema modelo, o pesquisador deve considerar cuidadosamente os pontos fortes e fracos de cada6.
A biologia heterogênea desta doença impacta o estabelecimento organóide à medida que alguns organóides derivados do paciente crescem extremamente bem em nossas condições, enquanto outros são muito mais lentos em comparação. Os protocolos acima descrevem uma condição rica do ligand de Wnt para isolar e expandir todos os organóides paciente-derivados, contudo outro mostraram que os tumores de algum paciente podem crescer na ausência de meios condicionados wnt11,12. Mais testes serão necessários para determinar se o uso de uma gama de condições de mídia aumenta o estabelecimento bem sucedido de organóides, como foi recentemente demonstrado para organóides de câncer de ovário18. Esta aproximação do multiplex é entretanto limitada pelo baixo número de pilhas do tumor que podem ser isoladas das amostras pacientes pequenas. Além disso, organóides ductais normais não transformados podem surgir de um isolamento organóide, especialmente se o tecido tumoral estiver ao lado do tecido normal9. Para reduzir o risco de contaminação organóide normal, amostras de tecido maiores podem ser subdivididas em fragmentos independentes menores usando diferenças morfológicas, como bem vascularizada (o sangue é visível) versus regiões hipovasculares e nódulos duros versus tecidos moles.
Os métodos e protocolos descritos aqui são as abordagens padrão atuais usadas em nosso laboratório para isolamento organóide e devem ser testadas e adaptadas para cada ambiente laboratorial. Por exemplo, a dissociação enzimática (passos 2,6 a 2,9) do tecido tumoral é particularmente importante para otimizar. Pequenas diferenças de equipamentos (nutator vs misturador rotador) pode levar a um tempo significativamente diferente para esta etapa. Além disso, a dissociação do tecido pode ser afinada aumentando ou reduzindo a concentração da mistura collagenase/hialuronidase. Deve ser tomado cuidado para não tratar todas as amostras da mesma maneira. Por exemplo, em alguns casos organóides podem ser isolados de líquido scites de pacientes com PDAC avançados sem dissociação mecânica ou enzimática.
O sequenciamento de DNA é o padrão ouro atual para determinar a presença ou ausência de organóides tumorais, já que o PDAC é impulsionado por mutações frequentes em KRAS, TP53, SMAD4 e CDKN2A. A análise transcriptômica pode revelar diferentes subtipos tumorais, enquanto a farmacotipagem pode descobrir vulnerabilidades terapêuticas específicas do paciente9. Esses protocolos permitem que os pesquisadores do PDAC desenvolvam sua própria biblioteca de organóides derivados do paciente e perfilem a biologia desses modelos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Somos gratos pelo apoio da UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, membros do laboratório Lowy e do Departamento de Cirurgia da UC San Diego, Divisão de Oncologia Cirúrgica. A AML é generosamente apoiada pelo NIH CA155620, um Prêmio de Sonho de Câncer de Câncer Pancreático da Fundação SU2C CRUK Lustgarten (SU2C-AACR-DT-20-16) e doadores do Fundo para Curar o Câncer Pancreático.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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