Summary
膵管腺癌の患者由来オルガノイド培養は、高忠実度で上皮腫瘍細胞コンパートメントを表す急速に確立された3次元モデルであり、この致死性悪性腫瘍に対する翻訳研究を可能にする。ここでは、オルガノイドを確立し、伝播する方法を詳細に提供するとともに、これらのモデルを用いて関連する生物学的アッセイを行う方法を提供する。
Abstract
膵管腺癌(PDAC)は、最も致死的な悪性腫瘍の一つである。近年、この疾患の3次元(3D)モデリングを可能にする次世代オルガノイド培養法が挙げられている。患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、外科検体および小さな生検の両方から単離し、培養中に急速に形成することができる。重要なことに、オルガノイドモデルは、患者の腫瘍で検出された病原性遺伝子変化を保持し、患者の治療応答を予測するので、翻訳研究を可能にする。ここでは、3D、マトリックス埋め込み、オルガノイドモデルを研究するために組織培養ワークフローを適応するための包括的なプロトコルを提供します。原発性PDACオルガノイドの分離と伝播に関する方法と考慮事項について詳しく説明します。さらに、実験室でオルガノイドメディアがどのように調製され、品質を制御しているかを説明します。最後に、核酸(DNAおよびRNA)の単離、薬物検査などのオルガノイドモデルの下流特性評価のためのアッセイについて説明します。重要なことは、研究室でオルガノイド方法論を実装するための重要な考慮事項を提供することです。
Introduction
膵管腺癌(PDAC)は、ほとんどの患者における後期診断、有効な治療法の欠如、および結果として10%1未満のままである低5年全体生存率を特徴とする致死性疾患である。患者のわずか20%が治癒外科的介入に適した局所疾患と診断される2、3.残りの患者は、典型的には、患者4、5の少数派に有効である化学療法剤の組み合わせで治療される。これらの差し迫った臨床ニーズに対応するために、研究者は早期発見戦略とより効果的な治療法の開発に積極的に取り組んでいます。重要な発見の臨床翻訳を加速するために、科学者は遺伝子操作されたマウスモデル、患者由来の異種移植片、単層細胞ライン、および、最近ではオルガノイドモデル6を採用している。
未変形前駆細胞の増殖を刺激する増殖因子およびWnt-リガンド豊富な条件を用いた三次元上皮オルガノイド培養は、まずマウス腸7について説明し、正常ヒト膵臓組織8に迅速に適応した。正常な乳管組織に加えて、オルガノイド方法論は、ヒトPDAC8の単離、膨張、および研究を可能にする。重要なことに、この方法は、外科検体からのオルガノイドの確立、ならびに細かいおよびコア針生検を支持し、研究者が疾患9、10のすべての段階を研究することを可能にする。興味深いことに、患者由来のオルガノイドは、よく記述された腫瘍転写サブタイプを要約し、精密医療プラットフォーム9、11の開発を可能にし得る。
PDACのための現在のオルガノイドプロトコルは、化学ナイーブ患者9からの患者サンプルの70%以上の正常な拡張を可能にする。ここでは、患者由来のPDACオルガノイドを単離、拡張、および特徴付けるために、当社の研究室で採用されている標準的な方法を提示します。他のPDACオルガノイド方法論は、12、13に記載されているが、これらの方法の比較は徹底的に行われていない。この技術は比較的新しく、急速に進歩しているので、これらのプロトコルは進化し続け、改善されることを期待しています。しかし、組織の取り扱いとオルガノイド培養の原理は引き続き有用であろう。
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Protocol
研究用のすべてのヒト組織収集は、当社の内部審査委員会(IRB)によって審査され、承認されました。以下のプロトコルのすべては、哺乳動物組織培養実験室環境において無菌条件下で行われる。
1. メディアの準備
- 条件付きメディアの準備。
注:ヒト膵臓オルガノイドメディアは、豊富な成長因子と栄養素だけでなく、オルガノイド拡張のための十分な成長刺激を提供するために条件付きメディア補充を必要とします。後述する両方の条件付き培地は、市販の細胞株から調製される(材料表を参照)。完全なプロトコルと材料については、製造元のウェブサイトを参照してください。- メーカーのプロトコルに従ってR-spondin1条件付きメディアを生成します。
- まず、豊富な血清(10%)の存在下で適切な抗生物質(ゼオシン)選択方法を用いてR-spondin1を発現する293T細胞を展開する。条件付き媒体を製造する場合は、最終的な条件付き媒体に抗生物質および血清が存在しないような抗生物質選択および血清を撤回し、洗い流す。重要なのは、コンディショニングされた媒体は、クロスコンタミネーションを防ぐために、回収後(0.2μm)でフィルターを殺菌する必要があります。
- 短期使用の場合は4°C(6ヶ月以内)、長期保存の場合は-20°C(6ヶ月以上)にアリクォートされた条件付けされたメディアを保管してください。凍結融解サイクルは避けるべきです。
- メーカーのプロトコルに従ってL-Wnt-3Aの条件付きメディアを生産します。
- まず、豊富な血清(10%)の存在下で適切な抗生物質(G-418)選択方法を用いてL-Wnt-3Aを発現するL-M(TK-)細胞を展開する。条件付きメディアを製造する場合は、最終的な条件付きメディアに抗生物質が存在しないような抗生物質の選択を撤回し、洗い流す。しかし、培養およびコンディショニングを通して血清を維持する。重要なのは、収集された条件化された媒体は、クロス汚染を防ぐためにフィルター殺菌(0.2μm)でなければならない。
- 短期使用の場合は4°C、長期保存の場合は-20°Cで、アリクォートされた条件付けされた媒体を保管してください。凍結融解サイクルは避けるべきです。
- 品質管理のために、TopFLASHアッセイを実行して、R-spondin1およびL-Wnt-3A調整されたメディアのWnt活性を単独で、以前に公開されたプロトコル14に従って組み合わせてテストする。
- メーカーのプロトコルに従ってR-spondin1条件付きメディアを生成します。
- 基礎メディアの準備:完全なオルガノイドメディアの調製だけでなく、オルガノイドの仕事のための洗浄ステップのための基底媒体を使用します。1xの最終濃度でグルタミンを補う高度なDMEM/F-12、HEPES(10 mM)、ペニシリン/ストレプトマイシン(100 U/mL)を補う。基礎媒体を4°Cで保管してください。
- オルガノイド完全なメディア調製:10%v/vの最終濃度でR-spondin1調整されたメディアで基底媒体を補完し、L-Wnt-3Aは50%v/vの最終濃度で、次の濃度で、 ヒトEGF(50ng/mL)、ヒトFGF(100ng/mL)、ヒトガストリンI(10nM)、マウスノギン(100ng/mL)、A83-01(500 nM)、B27サプリメント(1x)、ニコチンアミド(10mM)、N-アセチルシステイン(1.25 mM)、およびプリモチン(10m0/m0)。
- 一次オルガノイド単離の場合、解凍されたオルガノイド培養物、および単一細胞から始まる培養物には、10.5μMの最終濃度でRhoキナーゼ阻害剤Y-27632が挙げられる。
- 氷の上に人間のオルガノイド完全な媒体を準備し、1ヶ月以内に使用するために4 °Cで保存します。このため、メディアの新鮮な毎週の準備をお勧めします。
2. PDACオルガノイドの分離
注:使用前に少なくとも12時間、4°C環境(冷蔵庫またはコールドルーム)の氷上で基底膜抽出物(BME)溶液(成長因子低減;材料表)を解凍してください。オルガノイド培養用の組織培養プレートを使用前に少なくとも12時間、37°Cのインキュベーターでインキュベートする。
- 組織の生存率を維持するために、緩衝貯蔵溶液で研究するために外科的に除去された腫瘍標本を収集し、輸送する。基底媒体または市販の組織貯蔵溶液を使用してください。
- 検体を受け取った後、できるだけ早くオルガノイドを単離に進める。組織は、手術後24時間まで貯蔵溶液に保存することができ、まだオルガノイドを生み出す。
- 実験室で腫瘍を10cmの組織培養皿に移し、貯蔵溶液を除去する。
- 金属鉗子で組織を扱っている間、1mm3以下の小さな断片に#10メスで腫瘍をミンチします。フラグメントが大きいほど、消化に時間がかかります。したがって、均質な組織断片サイズを生成することを目指す。組織が既に分解されているか、1 mm3フラグメントより小さい場合は、この手順をスキップします。
- 10 mLの基底媒体を含む15mL円錐状チューブに組織断片を移す。チューブを数回反転して混ぜます。チューブを200 x gで5分間遠心分離します。スピン後、組織断片を失うことを避けるために慎重に基底媒体を取り除きます。
- 組織断片を含むチューブに基底媒体9mLと10xジェントルコラゲラーエーゼ/ヒアルロニダーゼ溶液の1 mLを加える。消化中に細胞の塊を避けるために, 10 mg/mL DNAse I 溶液の 20 μL でこのソリューションを補う.チューブを数回反転して混ぜます。
- ヌータまたはローテーターで37°Cで酵素消化をインキュベートします。消化中に十分な混合のために、組織断片は常に溶液を通って移動する必要があります。
注:腫瘍のこの酵素解離のタイミングは、すべての検体に対して経験的に決定されなければならない。腫瘍の消化が成功すると、肉眼でははっきりと見分けがつかないまで組織断片のサイズが小さくなることを特徴とする。それに続いて、溶液の不透明度は、顕微鏡組織断片が放出されるにつれて増加するであろう。 - 30分後、37°Cのインキュベーターから円錐管を取り出し、観察します。組織断片がまだはっきりと見える場合は、一定の混合で37°Cで解離を続けます。ほとんどの組織断片またはすべての組織断片が解剖されるまで、30分ごとにこの観察を繰り返します。混合のストリンジェンシーと腫瘍断片の大きさと量に応じて、このステップは小さな標本の場合は30分、より大きな腫瘍サンプルの場合は12時間ほどかかることがあります。
- 酵素解離が完了したら、チューブを200 x gで5分間遠心分離します。スピン後、細胞ペレットが見えるようにし、上清が透明で、すべての細胞が溶液から紡ぎ出されたことを示す必要があります。そうでない場合は、スピンを繰り返します。
- 細胞ペレットを失うことを避けるために慎重に上清を除去します。チューブを反転と穏やかに混合して、すぐに10 mL基底媒体で細胞を洗浄します。200 x gでチューブを5分間遠心分離します。
- 2回目の洗浄後、すべての基底媒体を慎重に取り出し、チューブを氷の上に5分間置きます。
- このとき、オルガノイド完全媒体のアリコートを37°水浴に入れ、予め温める。
- 氷の上にチューブを維持しながら、氷冷BMEと細胞ペレットを混合します。オルガノイド分離のシード密度は高いはずです。小さなペレット(約50°Lの容積)の場合は200μLのBMEを使用し、大きなペレット(約200°Lの容積)の場合は800 μLのBMEを使用します。溶液に気泡を作らないようにしながら、溶液が均質に見えるまで、p200ピペットを使用して氷上の細胞とBMEを混合します。
- p200ピペットを使用して、予め温めた12ウェルプレートの井戸の中央に100μLドームを見つけることができます。すべての BME ソリューションが分配されるまで、この手順を繰り返します。プレートを37°インキュベーターに慎重に移し、BMEゲルを固化させます。
- 10分後、プレートを取り出し、ウェルごとに1mLの事前温めオルガノイド完全な媒体を追加します。BMEドームの混乱を避けるために、井戸の側面にメディアを分配します。
- 明視野の4xレンズを用いて反転組織培養顕微鏡を用いて細胞断片を観察する。
注:単一の細胞および顕微鏡組織断片ははっきりと見えるべきである。正常な分離は、24-48時間後に10以上のオルガノイドの出現によって特徴付されます。文化は1週間以内にコンフルエントであるべきです。腫瘍標本は異種性であり、図1に示すように、一部のオルガノイド分離は、少数のオルガノイドが十分に成長するので、より困難である。この場合、培養を最大2週間継続して、受け継ぎに使用できる細胞の数を最大化します。培養中のメディアの消費と蒸発を考慮して、5日ごとに200μLの前温加絡オルガノイド完全媒体で培養物をトップアップします。
3. PDACオルガノイドの受け渡し
- 組織培養インキュベーターからプレートを取り出します。滅菌セルリフターを使用して、BMEドームをゆっくりと持ち上げて、完全な媒体に浮かびます。これらは通常線維芽細胞であるため、プラスチックに付着した単層細胞を除去しないように井戸の底部を削らないようにしてください。
- p1000ピペットを使用して、慎重に15 mL円錐管にBMEドームとメディアを転送します。オルガノイド含有井戸ごとにこの手順を繰り返します。
- 1mLの冷基底媒体で収穫した各井戸を軽く洗浄し、オルガノイドを含む15mLチューブに移す。
- 溶液とオルガノイドをp1000ピペットと完全に混合し、200 x gで5分間スピンダウンします。回転後、懸濁液中にオルガノイドを含むBME層とオルガノイドペレットがチューブの底部に現れる。BME/オルガノイド層の損失を避けて、慎重に上清を除去してください。チューブを氷の上に置きます。
- 10 mLの氷冷細胞回収液(CRS)をチューブに加え、反転して十分に混ぜます。これは、4°Cでゲル化BMEのタンパク質マトリックスを脱重合します。反転によって3分ごとに混合しながら、氷上で30分間インキュベートします。可能な場合は、冷蔵室または4°C冷蔵庫の回転ミキサーに30分間チューブを置きます。
- 30分間インキュベーション後、200 x gで5分間スピンダウンします。BME層がなくなる間、オルガノイドペレットは明らかであるべきです。BME層のサイズが小さくなったが、まだ目に見える場合は、混合と繰り返しスピンで4°Cでさらに30分間インキュベートします。
- BMEが脱合したら、オルガノイドペレットの後ろに残っているCRSを取り除きます。反転と混合して10 mL基底媒体でオルガノイドを洗浄します。200 x gで5分間スピンダウンし、上清を取り除く。オルガノイドペレットでチューブを氷の上に少なくとも5分間置きます。
- 必要に応じて、単一の細胞調製が望まれる場合は、消化中に細胞の塊を避けるために、3mLトリプシンを10mg/mL DNAse I溶液で補充してオルガノイドをインキュベートする。
- 37°Cで酵素反応を37°Cでインキュベートし、2分間ごとに穏やかな反転混合を行い、最大10分間監視し、明視野顕微鏡で単一細胞解離の成功を確認します。
- 酵素反応を止めるには、10 mLの氷冷基底媒体を加え、200 x gで5分間スピンダウンします。
- 穏やかな反転と混合することにより、10 mL基底媒体で細胞を洗浄します。200 x gで5分間スピンダウンし、上清を取り除き、もう一度洗浄を繰り返します。細胞ペレットでチューブを氷の上に少なくとも5分間置きます。
注:オルガノイドの定期的なメンテナンス中に3〜5箇所ごとにこのステップを実行して、多数のオルガノイドを有する均質な培養物を生成することをお勧めします。
- 細胞ペレットに氷冷BMEを加え、p200ピペットを使用して溶液が均質になるまで氷上で穏やかに混合します。混合物中の気泡の発生を避けながら、ピペットは少なくとも5〜10倍、ピペットの先端をチューブの底部の近くに置き、機械的にオルガノイドを分解するのに役立ちます。ガイドとして、BME/細胞ペレットの体積を4~6倍にして、分割比が一方の通路から他方の通路まで1:2以下にしないようにします。
- p200ピペットを使用して、事前に温めた12ウェルプレートの井戸の中央に100°Lドームをスポット。すべての BME ソリューションが分配されるまで繰り返します。プレートを37°インキュベーターに慎重に移し、BMEゲルを固化させます。10分後、プレートを取り出し、ウェルごとに1mLの事前温めオルガノイド完全な媒体を追加します。BMEドームの混乱を避けるために、井戸の側面にメディアを分配します。
- オルガノイドは、24時間以内に改革し、成長を開始する必要があります。必要に応じて、5日ごとに200°Lの前温みオルガノイド完全媒体で培養物をトップアップし、成長因子の枯渇と蒸発を補います。
4. PDACオルガノイドの凍結と解凍
- オルガノイドを凍結するには、オルガノイドの収穫に進み、ステップ3.1~3.7に記載されているようにBMEを脱重合します。
- 細胞ペレットに1mLの凍結媒体を加え、穏やかに混合し、予め標識された凍結膜に混合物を移す。
- 凍結容器に凍結容器に入れ、安全な一定温度低下を維持し、-80°Cの冷凍庫に入れます。24〜48時間後、凍結バイアルを液体窒素貯蔵に移す。オルガノイドは、この方法を使用して数ヶ月から数年にわたって凍結保存することができます。
- オルガノイドを解凍するには、液体窒素貯蔵から凍結凍結凍結凍結を取り出す。ドライアイスで冷凍バイアルを組織培養室に運ぶ。
- 冷凍凍結した凍結凍結を37°水浴に入れ、オルガノイドを急速に解凍し、バイアルの内容物を9mLの基底媒体を含む15mLの円錐形チューブに移し、室温まで温めた。
- 200 x gで5分間スピンダウンし、上清を取り除く。オルガノイドペレットでチューブを氷の上に少なくとも5分間置きます。
- BME で再サスペンドに進み、手順 3.9 ~ 3.11 の説明に従ってオルガノイドをプレートします。
注:オルガノイド培養は凍結/融解サイクル後にゆっくりと回復するので、培養物は通過する前に最大2週間成長する可能性があります。
5. PDACオルガノイドの特性評価
注:オルガノイドの特性評価は、線維芽細胞や免疫細胞などの非上皮細胞型からの汚染のリスクを減少させるために、いくつかの通路の後に確立された培養物で行われるべきである。
- PDACオルガノイドからの核酸抽出
- 核酸抽出専用の12ウェルプレート上のプレートオルガノイド。プレートは、井戸あたり100°L以下のBMEです。十分なDNA/RNA収率を得るための場合は、培養物あたり少なくとも2〜4ウェルをプレートします。培養物がコンフルエントに近づくまで最大5日間オルガノイドを成長させるが、長期培養で蓄積する過剰な細胞残骸を欠く。
- 37°インキュベーターからプレートを取り出し、オルガノイド完全媒体のすべての痕跡を完全に除去し、プレート上にオルガノイドを含むBMEドームのみを残します。
- 900 μLの酸性フェノール試薬(材料表参照)を各ウェルに加え、溶液が均質になるまでp1000ピペットを使用して十分に混合します。BMEは酸性フェノール試薬に完全に溶解し、オルガノイドは短い5分のインキュベーション後に溶解します。
注意:酸性フェノールは、化学熱傷を引き起こす可能性のある有害な化学物質です。適切な保護とテクニックを使用して注意して取り扱います。 - 均質溶液を2mLチューブに移し、200μLのクロロホルムを加えます。5分間インキュベートし、12,000 x gで4°Cで15分間インキュベートします。
- 製造元のプロトコルに従って RNA および DNA 抽出に進みます。RNAは水相から抽出でき、DNAは相相および有機相から抽出することができます。一度精製および定量化すると、同じ培養物の異なるウェルから単離されたRNAおよびDNAをプールして歩留まりを高めることができる。
注:(1)この核酸抽出法をRNAに用いることは強くお勧めしますが、培養細胞からDNAを分離するための良い方法はたくさんあります。(2)オルガノイド培養中の腫瘍細胞の存在を確認するために、PDACホールマーク遺伝子(KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A)内の変異を同定するために、好ましい次世代シーケンシング法を用いてDNAをシーケンシングすることをお勧めします。
- PDACオルガノイドのファーマコタイピング
- ステップ3.1~3.8で前述したように、オルガノイドから単一細胞を単一細胞に分離する。細胞数を最大化するために、12ウェルプレートの少なくとも10のコンフルエントウェルを収穫
- 1 mL のヒトオルガノイド完全な媒体で単一細胞を再中断する。小さなセル束(~2~10個のセル)の存在は許容されますが、セルの塊が大きいほど下流解析に悪影響を及ぼします。
- 自動セル カウンタを使用してセルをカウントし、セルの実行可能性を記録します。1 mL 懸濁液中に存在する細胞と生存細胞の総数を計算します。
- 治療試験のために、プレート1,000個の生存可能な細胞を384ウェルプレートのウェル当たりに。384ウェルプレートの場合、400,000個の生存可能なセル(400ウェルで計算)を使用すると推定されます。
- BMEの氷800μLに、細胞を含むオルガノイド完全媒体の7.2mLと混合してめっき用の細胞を準備します。384ウェルプレートのウェルあたり氷とプレート20°Lに混合物を保ちます。細胞を効率的にプレートするために、氷の上に保持された12チャンネルピペットと貯水池を使用してください。プレートからの過度の蒸発を避けるために、外側の井戸は、貯蔵所(井戸あたり60°L PBSまたは水)として使用することができますが、これは76の実験井戸の損失につながります。
- スイングバケットで1分間、プレートを100 x gでスピンダウンします。これにより、小さな20°Lの体積とオルガノイドがプレートの底部に沈着することができます。
- 37°Cの組織培養インキュベーターにプレートを入れ、オルガノイドを形成できるようにします。24時間後、明視野顕微鏡を用いてオルガノイドの存在を確認する。
- DMSOに溶解した治療用化合物を、薬物プリンタまたは同等の器具を用いてプレート上に溶解させる。少なくとも三重の井戸で各薬物用量をテストします。効果的な用量応答分析を行うには、経験的に各薬物の用量範囲を決定し、低、非効果、用量から始まり、最大効果が観察される高用量で終わる。化学療法化合物の用量範囲の例は、最近9として発表されている。
- 細胞を治療用化合物に3~5日間さらします。
- 場合によっては、アッセイの終わりに、プレートを画像化し、オルガノイドサイズ、数、および形態に対する治療効果を評価する。
- 製造業者のプロトコルに従って、発光細胞生存率試薬(材料表参照)のウェルあたり20°Lを使用して生存率を評価します。データ取得にはルミノメータとデータ分析用のグラフ作成ソフトウェアが必要です。
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Representative Results
PDACからのオルガノイドの分離に関連する課題を例示するために、小さな低細胞腫瘍サンプルから患者由来オルガノイド培養物の確立を示す。最初のめっき後、図1に示すように、ウェルごとに少数のオルガノイドしか見えなかった。オルガノイドは、2週間のスパンにわたって大きく成長させられ、より堅牢な文化を確立するために、我々のプロトコルに従って通過させられました(図1)。後期一次単離物で観察されたより大きな嚢胞性オルガノイドは、ステップ2.13で説明したように、氷冷BMEとオルガノイドの混合中に容易に小さな断片に分解されることに注意することが重要である。
ファーマコタイピングプロトコルの結果を実証するために、このプロトコルに記載されているように、確立され、急速に成長している代表的なPDACオルガノイドから単一細胞を調製した。1,000個の生存可能な細胞をウェル当たりにめっきし、細胞傷害性化学療法剤、ゲムシタビンおよびパクリタキセルがドーサドー化される前に24時間以上回収させた。100pMの低用量から始まり、2μMの高用量で終わる三重で9点用量応答アッセイを行った。5日間の治療の後、代表的な写真を車両(DMSO)、2μMゲムゲシタビン、および2μMパクリタキセル処理井戸のために撮影した(図2)。写真を撮った直後に、発光細胞生存率試薬を用いて細胞生存率を評価し、グラフ化ソフトウェアを用いてプロットした(図2)。
図1:代表的な写真は、PDACオルガノイド分離および最初の通路の後に示されている。初期(1~3日)と後半(7~10日)の両方のタイムポイントは、時間の経過に続くオルガノイドの成長を示すために示されています。スケール バー = 200 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図2:用量応答分析(左)確立されたPDACオルガノイド培養を用いて得られた代表的な用量応答分析は、誤差棒として示される三重の標準偏差を有する。(右)車両(DMSO)処理のアッセイ終了時の効果を示す写真は、2μMゲムシタビンおよび2μMパクリタキセルと同様に。スケール バー = 100 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
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Discussion
ここでは、患者由来PDACオルガノイドを分離、拡張、特徴付けするための現在のプロトコルを提示する。オルガノイド培養の確立に関する現在の成功率は70%を超えています。したがって、これらの方法はまだ完成されておらず、時間の経過とともに改善と進化が期待されています。PDACは腫瘍性細胞性が低いため、サンプルサイズに対して重要な考慮事項を考慮する必要があります。その結果、小さな標本は腫瘍細胞をほとんど含んでおらず、ほんの一握りのオルガノイドしか生成しません。さらに、多くの患者は、外科的介入15の前に化学療法および/または化学放射線ベースのネオアジュバント治療を受ける。治療が特定の患者に対して有効である場合、腫瘍組織は生存可能な細胞を欠いている可能性がある。これらの方法の初期最適化には化学ナイーブ患者サンプルの取得が好ましいが、これは必ずしも可能ではない。興味深いことに、腫瘍組織の外科的除去後の虚血時間は、サンプルが24時間以内に処理される限り、オルガノイド単離を成功させるための主要な基準ではないことがわかりました。
膵管腺癌は、強い脱形成反応および緻密な間質マトリックスの沈着を特徴とする疾患である。オルガノイドは、上皮コンパートメントの迅速な分離および膨張のための優れたツールであるが、モデルはPDACの複雑な間質を再現しない。患者由来異種移植片16または空気液体界面培養17のような他の方法論は、間質区画を可能にするが、それらは迅速に拡大するのが困難であり得る。モデルシステムを選択する際には、研究者はそれぞれ6の長所と短所を慎重に検討する必要があります。
この疾患の異種生物学は、一部の患者由来のオルガノイドが我々の状態で非常によく成長する一方で、他の人は比較してはるかに遅いので、オルガノイドの確立に影響を与えます。上記のプロトコルは、すべての患者由来オルガノイドを単離および拡張するWntリガンド豊富な状態を記述し、さらに他の患者の腫瘍はWnt条件付き媒体11、12の不在下で増殖できることを示している。さらなる検査は、最近卵巣癌オルガノイド18について実証されたように、様々な媒体条件を使用してオルガノイドの確立を増強するかどうかを決定するために必要とされる。しかし、この多重アプローチは、小さな患者サンプルから単離することができる腫瘍細胞の数が少なることによって制限される。さらに、正常な未形の乳管オルガノイドは、特に腫瘍組織が正常組織9に隣接している場合に、オルガノイド単離から生じ得る。正常なオルガノイド汚染のリスクを減らすために、より大きな組織サンプルは、血管化(血液が見える)と低血管領域、硬い結節対軟組織などの形態学的な違いを用いて、より小さな独立した断片に細分化することができる。
ここで説明する方法とプロトコルは、オルガノイド分離のための私達の実験室で使用される現在の標準的なアプローチであり、それらは各実験室の環境のためにテストされ、適応されるべきである。例えば、腫瘍組織の酵素解離(ステップ2.6〜2.9)は、最適化するために特に重要である。小型機器の違い(ヌータタとローテーターミキサー)は、このステップで大幅に異なるタイミングにつながる可能性があります。さらに、組織解離は、コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ混合物の濃度を増加または減少させることによって微調整することができる。すべてのサンプルを同じ方法で処理しないように注意する必要があります。例えば、オルガノイドは、機械的または酵素的解離することなく、高度なPDAC患者からの腹水から単離することができる場合もある。
DNAシーケンシングは、PDACがKRAS、TP53、SMAD4およびCDKN2Aの頻繁な突然変異によって駆動される腫瘍オルガノイドの有無を決定するための現在のゴールドスタンダードです。トランスクリプトミック分析は、薬物タイピングが患者特異的な治療の脆弱性を明らかにすることができる間、異なる腫瘍サブタイプを明らかにすることができます9.これらのプロトコルは、PDAC研究者が患者由来オルガノイドの独自のライブラリを開発し、これらのモデルの生物学をプロファイルすることを可能にします。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
UCサンディエゴムーアズがんセンターバイオリポジトリと組織技術共有リソース、ローリー研究所のメンバー、および外科腫瘍学部門のUCサンディエゴ外科部門のサポートに感謝しています。AMLは、NIH CA155620、SU2C CRUKルストガルテン財団膵臓がんドリームチーム賞(SU2C-AACR-DT-20-16)、膵臓癌を治すための基金への寄付者によって寛大にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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