Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मानव भ्रूण स्टेम सेल से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक स्थिर स्व-निर्देशित विधि

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60379
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Stem Cell Center, Yale University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल अभी भी मस्तिष्क कोशिका प्रकार ों की विविधता और सेलुलर संगठन की कई विशेषताओं को बनाए रखते हुए एक्सोजेनस विकास कारकों या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बिना एक सरलीकृत, कम लागत वाले तरीके से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उत्पादन करने के साधन के रूप में उत्पन्न किया गया था।

Abstract

भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से विभेदित मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड त्रि-आयामी प्रणाली में कई कोशिका प्रकारों की जटिल बातचीत का अध्ययन करने का अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। यहां हम एक अपेक्षाकृत सरल और सस्ती विधि पेश करते हैं जो मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड की पैदावार करता है। इस प्रोटोकॉल में मानव pluripotent स्टेम सेल एकल कोशिकाओं के बजाय छोटे समूहों में टूट रहे है और एक विषमलोगोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या बहिर्जात विकास कारकों के बिना बुनियादी मीडिया में उगाया जाता है, आंतरिक विकास संकेतों को आकार देने की अनुमति ऑर्गेनोइड का विकास। यह सरल प्रणाली मस्तिष्क कोशिकाओं, स्टेम कोशिकाओं, और अग्रमस्तिष्क, मिडब्रेन और हिंदब्रेन के न्यूरॉन्स सहित मस्तिष्क कोशिका प्रकारों की विविधता पैदा करती है। इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न ऑर्गेनोइड ्स ब्राइटफील्ड छवियों, हिस्टोलॉजी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया द्वारा प्रदर्शित उपयुक्त अस्थायी और स्थानिक संगठन की पहचान भी प्रदर्शित करता है ( क्यूआरटी-पीसीआर) । क्योंकि इन ऑर्गेनॉइड में मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों से कोशिका प्रकार होते हैं, इसलिए उनका उपयोग कई बीमारियों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हाल ही में एक पेपर में हमने मानव मस्तिष्क पर हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न ऑर्गेनॉइड के उपयोग का प्रदर्शन किया। इस दृष्टिकोण का उपयोग न्यूरोडेवलपमेंटल बाधाओं, आनुवंशिक विकारों और न्यूरोलॉजिक रोगों जैसी स्थितियों का अध्ययन करने के लिए अन्यथा कठिन की एक सरणी की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

असंख्य व्यावहारिक और नैतिक सीमाओं के कारण मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने में काफी कठिनाई हुई है । जबकि कृंतक का उपयोग अध्ययन मानव मस्तिष्क के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण रहा है, माउस मस्तिष्क में कई विसंगतियांहैं1,2। दिलचस्प बात यह है कि चूहों में एक न्यूरोनल घनत्व होता है जो रहनुमा मस्तिष्क3,4से कम 7 गुना कम होता है। हालांकि वानरों एक विकासवादी दृष्टिकोण से कृंतक की तुलना में मनुष्यों के करीब हैं, यह ज्यादातर शोधकर्ताओं के लिए व्यावहारिक नहीं है उनके साथ काम करते हैं । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मस्तिष्क कोशिका विविधता और सेलुलर संगठन को बनाए रखते हुए विषमलोगोस बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स या एक्सोजेनस विकास कारकों की आवश्यकता के बिना एक सरलीकृत और कम महंगी विधि का उपयोग करके मानव मस्तिष्क की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को फिर से तैयार करना था।

ससाई प्रयोगशाला से प्रारंभिक कार्य ने सिग्नलीकृत भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएससी)5,6से दो और त्रि-आयामी न्यूरोनल सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए भ्रूणीय निकायों (SFEBq) विधि की सीरम मुक्त संस्कृति का उपयोग किया। कई मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड तरीकों ने सिग्नल्ड ईएससी7,8से अपेक्षाकृत समान मार्ग का अनुसरण किया है । इसके विपरीत, यह प्रोटोकॉल अलग मानव ESCs (hESCs) के समूहों के साथ शुरू होता है, जो चढ़ाना चरण9,10 से पहले थॉमसन और झांग प्रयोगशालाओं के मौलिक काम के प्रारंभिक चरणों के समान हैऔरसाथ ही बहिर्जात विकास कारकों के अलावा11से पहले पास्का प्रयोगशाला के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरण के समान है । बेसमेंट झिल्ली मैट्रिस (उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स) का उपयोग कई मस्तिष्क ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल में किया गया है और इसे एक प्रभावी पाड़8दिखाया गया है। हालांकि, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तहखाने झिल्ली मैट्रिस जटिलताओं के बिना नहीं आते हैं क्योंकि वे उत्पादन12के दौरान बैच परिवर्तनशीलता के लिए बैच के साथ विकास कारकों की अज्ञात मात्रा के साथ सह-शुद्ध होते हैं। इसके अलावा, ये मैट्रिस इमेजिंग को जटिल बना सकते हैं, और संदूषण और लागत के जोखिम को बढ़ा सकते हैं।

जबकि मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उपयोग कई सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है, ध्यान में रखने के लिए कुछ सीमाएं हैं। एक के लिए, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से शुरू, ऑर्गेनोइड अधिक बारीकी से वृद्ध दिमाग की तुलना में अपरिपक्व दिमाग के समान है और इस तरह अल्जाइमर रोग की तरह बुढ़ापे में होने वाली बीमारियों के लिए आदर्श मॉडल नहीं हो सकता है । दूसरा, जबकि हमारे प्रोटोकॉल में फोरब्रेन, मिडब्रेन और हिंदब्रेन विकास के मार्कर मिले जो संगीत कार्यक्रम में कई मस्तिष्क क्षेत्रों से कोशिकाओं पर उपचार या बीमारी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, अन्य प्रोटोकॉल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों13,14पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पालन किया जा सकता है। अंत में, ऑर्गेनॉइड मॉडल की एक और सीमा आकार की है, जबकि मानव मस्तिष्क की औसत लंबाई लगभग 167 मिमी, आंदोलन के उपयोग के साथ बने मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड 4 मिमी8 तक बढ़ते हैं और इस प्रोटोकॉल द्वारा गठित ऑर्गेनॉइड 10 सप्ताह तक 1-2 मिमी तक बढ़ जाते हैं। फिर भी, यह प्रोटोकॉल मानव मस्तिष्क के ऊतकों और कई कोशिका प्रकारों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. स्टेम सेल रखरखाव

  1. विकास कारक की एक परत पर H9 hESCs बनाए रखें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कम (सामग्री की मेजदेखें, अब से बस मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
    1. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट या १ १० सेमी पकवान कोट करने के लिए, बर्फ के ५.९ mL के साथ मैट्रिक्स के १०० μL गठबंधन-ठंडा है Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM)/F12 मीडिया । पैराफिन फिल्म में प्लेटें लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें। अतिरिक्त मैट्रिक्स/मीडिया को एस्पिरेटेड होने के बाद अगले दिन उन्हें पासिंग कोशिकाओं के लिए उपयोग करें ।
  2. संस्कृति सप्ताह के लिए कोशिकाओं को लगभग एक 1:12 विभाजन अनुपात हर 7 दिनों में सप्ताह । 37 डिग्री सेल्सियस, कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर (5% ओ2,5% सीओ2)में MTESR-1 मीडिया का उपयोग कर कोशिकाओं को बनाए रखें। रोजाना मीडिया को रिफ्रेश करें। कांच के उपकरणों का उपयोग करके मार्ग के बीच संस्कृति से कोशिकाओं को अलग करना निराई।
  3. एच9 कोशिकाओं को ऑर्गेनॉइड का उत्पादन करने के लिए उपयोग करने से चार से छह दिन पहले मार्गित किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को सेल समूहों के लगभग 1:8 अनुपात में पारित किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, DMEM F12 मीडिया के साथ कोशिकाओं को धोने और एक तटस्थ प्रोटीज़ के साथ कोशिकाओं को अलग करके शुरू (जैसे, dispase, अब से बस प्रोटीज के रूप में संदर्भित), DMEM के साथ कुल्ला/ फसल से दो दिन पहले, उन्हें नियमित इनक्यूबेटर (21% ओ2,5% सीओ2)में संक्रमण करें। ऑर्गनॉइड गठन शुरू करते समय प्लेटें ~ 80% कन्फ्लनरी तक पहुंचनी चाहिए।

2. ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए एचईसी का विसोशन

  1. अलीकोट प्रोटीज़ स्टॉक सॉल्यूशन (5 यू/एमएल) ।
    नोट: हम आम तौर पर कई महीनों में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 mL aliquots नीचे फ्रीज ।
  2. प्रत्येक 6-अच्छी तरह से या hESCs के 10 सेमी प्लेट के लिए DMEM/F12 के शेयर समाधान के 1 mL जोड़कर काम एकाग्रता के लिए प्रोटीज़ स्टॉक समाधान को पतला करें ।
  3. Aspirate और सेल संस्कृति मीडिया को हटा दें, फिर प्रॉटीज़ समाधान के साथ एचएसईसी को कवर करें। इनक्यूबेटर में 10-15 किमी के लिए या जब तक कॉलोनियों के किनारों को गोल न करें और मैट्रिक्स से अलग होना शुरू न करें।
  4. थाली झुकाव, प्रोटीज़ समाधान aspirate, और धीरे DMEM के साथ कोशिकाओं को धोने/ 10 सेमी प्लेट का उपयोग करते समय 6-अच्छी प्लेट और 6 mL का उपयोग करते समय प्रत्येक धोने के लिए 2 mL/अच्छी तरह से उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि इस कदम को निष्पादित करते समय कॉलोनीवासी मैट्रिक्स से जुड़े रहें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से (या 10 सेमी प्लेट के लिए 5 mL) के लिए ताजा mTESR मीडिया के बारे में 1.5 mL वापस जोड़ें और कोमल पाइपिंग का उपयोग कर प्लेट से कोशिकाओं को फ्लश करें।
  6. एक 10 mL पिपेट का उपयोग करना, धीरे aspirate और थाली के भीतर एचएसईएससी बांटना जब तक वे अपने मूल आकार के लगभग 1/30वें तक पहुंचने । कॉलोनी समूहों को इन चरणों के पूरा होने पर ~ 250-350 माइक्रोन आकार के वर्गों के समान होना चाहिए।

3. ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी

  1. कोशिकाओं को एक अल्ट्रा-कम अटैचमेंट T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) के बिना एमटीईएसआर मीडिया का 30 एमएल होता है।
  2. अगले दिन, फ्लास्क (एस) को झुकाएं कि कोने में लाइव कोशिकाएं पूल (यह पहले दिन 5-10 मिन ले सकती है, लेकिन क्लस्टर बड़े होने के रूप में जल्दी हो जाएगी)।
    नोट: यदि बड़ी संख्या में कोशिकाएं हैं जिन्होंने इस चरण या बाद के किसी भी चरण में फ्लास्क के नीचे का पालन किया है, तो कोशिकाओं को एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित करें। पहले दो दिनों तक मृत कोशिकाओं की आबादी अधिक होना सामान्य बात है। जब मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन, संभव के रूप में सेल मलबे के रूप में ज्यादा से अधिक को दूर करने के लिए सुनिश्चित हो ।
  3. एक बार कोशिकाओं को व्यवस्थित, मीडिया और मृत कोशिकाओं को जीवित कोशिकाओं युक्त मीडिया के बारे में 10 mL छोड़ने से aspirate ।
  4. कम bFGF मीडिया के ~20 मिलीग्राम जोड़ें (DMEM/F12 1x N2, 1x B27, 1x एल ग्लूटामाइन, 1x NEAA, ०.०५% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), और ०.१ m मोनोथिओग्लिसरोल (एमटीजी) के साथ पूरक के साथ पूरक 30 एनजी/mL bFGF) ।
  5. 2 दिन कोशिकाओं की जांच करें। अगर ज्यादातर कोशिकाएं स्वस्थ और चमकीली दिखती हैं तो कुछ भी करने की जरूरत नहीं है। हालांकि, अगर कोशिकाओं के एक तिहाई से अधिक अंधेरा दिखाई देते हैं, मीडिया की जगह (चरण ३.२ में के रूप में एक ही झुकाव तकनीक का उपयोग कर) कम bFGF मीडिया के ~20 mL के साथ 20 एनजी/
  6. 3 दिन, मीडिया के आधे की जगह (चरण ३.२ में झुकाव तकनीक का उपयोग कर) कम bFGF मीडिया के 20 mL के साथ 10 एनजी के साथ पूरक/
  7. 5 दिन, मध्यम के आधे की जगह (चरण ३.२ में झुकाव तकनीक का उपयोग कर) तंत्रिका प्रेरण मीडिया के 20 mL के साथ (NIM: DMEM/F12, 1x N2 पूरक, ०.१ m M MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) ।
    नोट: यदि कोशिकाओं या ऑर्गेनॉइड के कोई बड़े समूह हैं जो दूसरों की तुलना में बहुत बड़े हैं, तो उन्हें संस्कृति से हटा दिया जाना चाहिए। माइक्रोस्कोप के नीचे उपस्थिति से आकार का अनुमान लगाया जाता है; उदाहरण के लिए, रीटिकल के साथ एक आईपीस का उपयोग करना। अधिकांश ऑर्गेनॉइड इसी तरह आकार के होते हैं (लगभग 100 ± 20 माइक्रोन)। हमने ऑर्गेनॉइड को हटा दिया जो दूसरों की तुलना में लगभग 2x छोटे या बड़े थे।
  8. हर दूसरे दिन NIM के साथ मध्यम (~ 15 mL) (झुकाव तकनीक का उपयोग कर) के आधे की जगह ।
  9. संस्कृति में 3 सप्ताह के बाद, मीडिया के लिए 100x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें (NIM: DMEM/F12, 1x N2 पूरक, ०.१ mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) 1x की अंतिम एकाग्रता पर अगर वांछित । हर दूसरे दिन मीडिया को रिफ्रेश करें।
    नोट: इस फैशन में, हमने संस्कृति में 6 महीने तक ऑर्गेनॉइड बनाए रखा।

4. आरएनए निष्कर्षण और तैयारी

  1. धीरे-धीरे 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क से लगभग 15 ऑर्गेनोइड (आकार के आधार पर) निकालें और 1.5 मिलील ट्यूब में रखें।
    1. धीरे-धीरे सेंट्रलाइज (1 मिन के लिए 200 x ग्राम) में ऑर्गेनॉइड को गोली दें, और तीन बार 1x डुल्बेकको के पीबीएस (डीपीबीएस) के साथ कुल्ला करें।
  2. मान्य प्रणाली या प्रोटोकॉल (जैसे, आरएनई किट) का उपयोग करके आरएनए निकालें।
  3. प्रत्येक नमूने के ऑप्टिकल घनत्व मूल्य को 260 और 280 एनएम पर मापें।
  4. मान्य प्रणाली या प्रोटोकॉल (जैसे, आईस्क्रिप्ट सीडीएनए संश्लेषण किट) का उपयोग करके सीडीएनए तैयार करें।
  5. कम से कम एक हाउसकीपिंग जीन सहित पूर्व-मान्य प्राइमर(टेबल 1)का उपयोग करके क्यूआरटी-पीसीआर प्रदर्शन करें।

5. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. निर्धारण
    1. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) सॉल्यूशन तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. बाँझ रेजर का उपयोग करना, एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट की टिप काट।
    3. कट ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे ऑर्गेनॉइड निकालें, क्योंकि उन्हें आसानी से अलग किया जा सकता है, खासकर जब वे बड़े हो जाते हैं, और उन्हें अतिरिक्त मीडिया या डीपीबीएस के साथ 6-अच्छी प्लेट में रखें।
    4. प्लेट झुकाएं, मीडिया को एस्पिरेट करें, और 1x डीपीबीएस से बदलें। कोशिकाओं को दो अतिरिक्त बार 1x डीपीबीएस के साथ कुल्ला करें।
    5. डीपीबीएस को 4% पीएफए सॉल्यूशन से बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रखें।
      नोट: जबकि हम 2 दिनों के लिए तय (छोटे ऑर्गनॉइड के लिए) 7 दिनों (ऑर्गनॉइड और gt;3 महीने के लिए), कम समय (जैसे, 16-24 घंटे) भी संभव हो सकता है ।
    6. डीपीबीएस में 30%, 20% और 10% सुक्रोज समाधान तैयार करें।
    7. पीएफए में निर्धारण के बाद, 10% सुक्रोज समाधान के साथ बदलें और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रखें।
    8. 10% सुक्रोज को 20% सुक्रोज से बदलें और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रखें।
    9. 20% सुक्रोज को 30% सुक्रोज से बदलें और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रखें।
  2. जमे हुए वर्ग
    1. सूखी बर्फ की एक सपाट परत तैयार करें और उसके ऊपर एक लेबल प्लास्टिक मोल्ड रखें।
    2. मोल्ड में इष्टतम काटने तापमान मध्यम (OCT) की एक पतली परत डालो और यह (कुछ सेकंड के भीतर) कठोर करने के लिए शुरू करते हैं ।
    3. टिप कट के साथ एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर मोल्ड में OCT के शीर्ष पर कुछ ऑर्गोनॉइड रखें और ऑर्गेनॉइड के स्थान पर करीब से ध्यान दें।
    4. धीरे-धीरे अक्टूबर में जोड़ें जब तक मोल्ड भरा न हो जाए और ऑर्गेनॉइड कवर न हो जाएं। इसे अतिरिक्त 10 मिन के लिए पूरी तरह से कठोर होने दें।
      नोट: 10 से अधिक ठंड जबकि अनुभागन के लिए कई ऑर्गनॉइड के आदर्श सापेक्ष प्लेसमेंट को सुनिश्चित करने में मदद करता है, अधिक तेजी से फ्रीज करने के लिए इथेनॉल-ड्राई आइस मिक्स या तरल नाइट्रोजन का उपयोग करना संभव है।
    5. एक मार्कर के साथ ऑर्गेनॉइड के सापेक्ष स्थान को चिह्नित करें ताकि काटते समय उन्हें ढूंढना आसान हो सके।
    6. मोल्डों को बैग या बॉक्स में रखें और वर्गों को काटने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. क्रायोस्टैट का उपयोग करना, 10 माइक्रोन वर्गों का टुकड़ा और लेबल पर ऊतक जगह, सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड ।
  3. धुंधला
    1. ब्लॉकिंग समाधान (0.3% ट्राइटन एक्स-100, पीबीएस में 4% सामान्य गधा सीरम) तैयार करें।
    2. ऊतक की परिधि के चारों ओर आकर्षित करने के लिए हाइड्रोफोबिक पैप पेन का उपयोग करें।
    3. 5 मिन के लिए 3 बार पीबीएस के साथ स्लाइड्स कुल्ला.
    4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान के साथ PBS की जगह ।
    5. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी समाधान (उचित एकाग्रता पर एंटीबॉडी, 0.1% ट्राइटन एक्स-100, 4% सामान्य गधा सीरम) के साथ अवरुद्ध समाधान को बदलें।
    6. अगले दिन, प्रत्येक 10 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3 बार स्लाइड धोएं।
    7. पीबीएस को उचित माध्यमिक एंटीबॉडी (उचित एकाग्रता पर) के साथ बदलें जो कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एंटीबॉडी समाधान में पतला होता है।
    8. 1x पीबीएस के साथ हर बार 10 मिन के लिए 3 बार कुल्ला।
    9. 4', 6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल (डीपीआई) दाग लगाएं और 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिन के लिए तीन बार कुल्ला करें।
    10. बढ़ते समाधान के साथ स्लाइड के सामने कवरस्लिप प्रत्यय, अंधेरे में कमरे के तापमान पर सूखी चलो, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 कई समय अंक के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों को प्रदर्शित करने के लिए क्या कोशिकाओं/ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के विभिंन चरणों में की तरह दिखते है दिखाता है । एचएसईसी को ऊतक संस्कृति प्लेट से हटा दिया गया था, जो छोटे टुकड़ों में टूट गया था, और एक T75 अल्ट्रा-कम लगाव फ्लास्क में रखा गया था जहां उन्होंने गोले बनाए थे। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं इन समूहों के केंद्रों में अंधेरे, मरने वाली कोशिकाओं के बिना आकार में उज्ज्वल और समान दिखती हैं। कोशिकाओं को धीरे-धीरे बीएफएफएफ से छुड़ाया गया। 5 दिन उन्हें न्यूरल इंडक्शन मीडिया में रखा गया और वे संस्कृति काल में इस मीडिया में बने रहे । यद्यपि ऑर्गेनॉइड बड़े हो जाते हैं और इस प्रकार समय के साथ गहरे होते हैं, लेकिन तंत्रिका रोसेट जैसी संरचनाओं (काले तीर) पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है जो मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड विकास और विस्तार में मौजूद हैं। रोसेट तंत्रिका भेदभाव की शुरुआत का संकेत देते हैं और भ्रूण तंत्रिका ट्यूब की विशेषताएं होते हैं, जो एपिथेलियल विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं और एक एपिकल लुमेन15के आसपास होते हैं।

संस्कृति में 5 महीने में हेमैटोक्सिलिन और eosin के साथ ऑर्गेनॉइड के धुंधला संकेत दिया है कि केंद्रों में भी परिगलन की विशाल मात्रा में नहीं थे, जो स्थिर संस्कृति प्रणाली(चित्रा 2ए)को देखते हुए प्रारंभिक चिंता का विषय था । इन ऑर्गेनॉइड ने एक अनुभवी न्यूरोपैथोलॉजिस्ट(चित्रा 2बी)द्वारा हल्के सूक्ष्म मूल्यांकन के आधार पर मानव प्रांतस्था के समान हिस्टोलॉजिक आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया। हिटोलॉजी द्वारा, कई अद्वितीय कोशिका मॉर्फोलोजी ग्लिया (नीले तीर सिर), न्यूरॉन्स (लाल तीर सिर), काजल-रेट्ज़ियस आकृति विज्ञान (काले तीर) के साथ कोशिकाओं, और न्यूरोपिल (नारंगी तीर सिर)(चित्रा 2बी, सी)जैसी देखी गई।

कोशिकाओं के भीतर जीन अभिव्यक्ति पर गहराई से अधिक देखने के लिए, क्यूआरटी-पीसीआर किया गया था। चित्रा 3में दिखाए गए परिणामों के लिए, प्रत्येक बार स्वतंत्र रूप से उगाई जाने वाली कोशिकाओं के 3 अलग-अलग बैचों का प्रतिनिधित्व करता है और निर्दिष्ट समय बिंदु पर काटा जाता है। इसके बाद इन नमूनों को हाउसकीपिंग जीन, गप्धके अलावा इंगित जीन के लिए प्राइमर जोड़ी के साथ ट्रिपलकेट में चलाया गया । ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर, Vglut1 (चित्रा 3ए),2.5 सप्ताह में व्यक्त किया गया था, 5 सप्ताह में वृद्धि हुई है, और संस्कृति में 5 महीने के माध्यम से लगातार बने रहे। एक अग्रमस्तिष्क मार्कर, Foxg1 (चित्रा 3बी),संस्कृति में 5 सप्ताह तक कम स्तर पर व्यक्त किया गया था । गहरी परत मार्कर, Tbr1 (चित्रा 3सी),लगभग 5 सप्ताह नुकीला और बाद में कमी आई है, जबकि ऊपरी परत मार्कर, Satb2 (चित्रा 3डी),समय के साथ वृद्धि हुई ।

वेंट्रल मार्कर Engrailed1 (Eng1)(चित्रा 3ई),हिंदब्रेन/रीढ़ की हड्डी मार्कर Hoxb4 (चित्रा 3एफ),साथ ही ओलिगोडेनरोसाइट मार्कर, Olig2 (चित्रा 3जी)की अभिव्यक्ति, सभी समय के साथ वृद्धि हुई । इसके विपरीत, स्टेम सेल मार्कर, Sox2 (चित्रा 3एच),समय के साथ कमी आई । ग्लिल मार्कर, एफएपी (चित्रा 3I),5 सप्ताह में नुकीला और बाद में अपेक्षाकृत स्थिर रहे। इसके अलावा इम्यूनोफ्लोरेसेंस डाटा क्यूआरटी-पीसीआर डेटा के अनुरूप था। 10 हफ्तों में Foxg1 (चित्रा 4ए)की एक मजबूत अभिव्यक्ति थी । Sox2 अभिव्यक्ति उपवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड)(चित्रा 4बी, सी)जैसी क्षेत्रों तक सीमित थी। दिलचस्प बात यह है कि बाहरी रेडियल ग्लियल सेल मार्कर, हॉपएक्स (चित्रा 4डी)की कुछ अभिव्यक्ति भी थी।

Figure 1
चित्रा 1: ऑर्गेनोइड विकास की स्थिति और आकृति विज्ञान का अवलोकन। (क)मीडिया परिवर्तन की योजनाबद्ध । (बी-एम) ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवियां परिपक्व होते ही। (B-M) मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड बनाने के लिए एच9 एचईसी(बी)का उपयोग किया गया था। 20 एनजी/एमएल बीएफजीएफ मीडिया में(सी)दिन 2 पर ऑर्गेनोइड्स, और(डी)दिन 3 और(ई)दिन 4 में 10 एनजी/एमएल बीएफजीएफ मीडिया । (एफ-एम) 5 दिन(एफ),8(जी),10(एच),17(I)35(जे,K),और 70(एल,एम)पर तंत्रिका प्रेरण मीडिया (एनआईएम) में ऑर्गेनोइड्स। तीर तंत्रिका रोसेट की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ऑर्गेनॉइड ने मानव मस्तिष्क के ऊतकों में हिस्टोलॉजिक समानताएं साझा कीं। एच एंड ई 5 महीने(ए)में ऑर्गेनॉइड का धुंधला मानव प्रांतस्था(बी)जैसी कुछ परत के साथ। उच्च आवर्धन में ग्लिया (नीला तीर सिर), न्यूरॉन्स (लाल तीरसिर), न्यूरोपिल (नारंगी तीर सिर), और काजल-रेट्ज़ियस आकृति विज्ञान (काले तीर)(बी, सी)के साथ कोशिकाओं सहित कई कोशिका आकृतियां देखी गईं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: समय के साथ मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के भीतर न्यूरोडेवलपमेंटल जीन की अभिव्यक्ति। मात्रात्मक आरटी-पीसीआर डेटा SYBR ग्रीन का उपयोग करVglut1(A),Foxg1(बी),Tbr1(सी),Satb2(D),En1(ई),Hoxb4(एफ),Olig2 (जी),Sox2(एच),और GFAP(I)की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन । त्रुटि सलाखों = मतलब ± मानक विचलन (एन ♫ 3) । इस आंकड़े को16से संशोधित किया गया है . प्राइमर जानकारी के लिए टेबल 1 देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 10 सप्ताह में मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के भीतर न्यूरोडेवलपमेंटल प्रोटीन की अभिव्यक्ति। इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने फॉक्सजी1(ए),सोक्स 2(बी, सी)की स्थानीय अभिव्यक्ति और हॉपएक्स(डी)की उपस्थिति की एक मजबूत अभिव्यक्ति का खुलासा किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन अनुक्रम (5' से 3') एम्प्लिस एक्सॉन
En1 F GGACAATGACGTTGAAA
सीजीसीएजीसीए		 149 2
आर AAGGTCGTAAGCGGTTT
जीजीसीटीएजीा		 2
फॉक्सजी1 F AGAAGAACGGCAAGTAC
बेहूदा		 188 1
आर TGTTGAGGACAGATTTG
टीजीजीसी		 1
गगध F ACCACAGTCCATGCCAT
Cac		 449 8
आर CACCACCCTGTGTGCTGTGTGTGT
एजीसीसी		 9
जीएफएपी F AGATCCGCACGCAGT
एटीजी		 80 4
आर TCTGCAACTTGCG
Gta		 5-अप्रैल
होक्सबी4 F AAAGCACCCTCTCTACTG
CCAGATA		 80 2
आर ATGGGCACGAAgaGAGAGA
जीजीगा		 2
ओलिग्2 F CCCTGAGGCTTTTCGGA
जीसीजी		 451 1
आर GCGGCTGTTGATCTTGA
जीएसीजीसी		 2
Satb2 F TAGCCAAGAATGCCCT
सीटीसी		 94 6
आर AAACTCCTGGCACTTGG
टीटीजी		 7
सॉक्स2 F CCCAGCAGACTTCACAT
Gt		 150 1
आर CCTCCCATTTTCTCGT
Ttt		 1
Tbr1 F GTCACCGCCTACCAGAAa
Cac		 101 4
आर ACAGCCGGTGTAGATCG
टीजी		 6
Vglut1 F CAGAGTTTTCCTCTTTG
सीटीटीजी		 183 5-अप्रैल
आर जीसीजीसीटीसीसीजीटीटीएजीजी
जीटीजी		 6

तालिका 1: चित्रा 3 में मात्रात्मक आरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर दृश्य।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के समान, यह एक कृत्रिम प्रणाली है जो कई चेतावनी के साथ आती है। यद्यपि समग्र अभिव्यक्ति के स्तर के संदर्भ में बैच भिन्नता के लिए थोड़ा बैच था, व्यक्तिगत ऑर्गेनॉइड ने मतभेदों को प्रदर्शित किया। उदाहरण के लिए, सोक्स-2 सकारात्मक क्षेत्रों का स्थान हर ऑर्गेनोइड(चित्रा 3)में समान नहीं था। जबकि क्यूपीसीआर कोशिकाओं के बैचों में समग्र परिवर्तन ों की तलाश करने के लिए उपयुक्त है, सेल-बाय-सेल आधार पर अधिक जानकारी इकट्ठा करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में एकल सेल आरएनएक्यू जैसी अतिरिक्त तकनीकों का उपयोग किया जाएगा। इस प्रणाली की एक अन्य सीमा यह है कि यह ऑर्गेनोइड के भीतर वैकुलचर को एकीकृत नहीं करता है जैसा कि हाल के कुछ अध्ययनों में किया गया है17,18,19। हालांकि, एक कम से उच्च ऑक्सीजन वातावरण के लिए hESCs संक्रमण और अधिक बारीकी से एक विकासशील भ्रूण में एरोबिक संक्रमण के लिए एरोबिक के समान हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम न्यूरोस्फीयर का गठन और साथ ही उचित संस्कृति मीडिया के साथ मीडिया परिवर्तन सहित उचित रखरखाव के लिए स्वस्थ कोशिकाओं और भीड़ के बिना बढ़ते ऑर्गनॉइड के लिए पर्याप्त पोषक तत्वों को सुनिश्चित कर रहे है . अपर्याप्त सेल प्रसार या भेदभाव को परेशान करने के लिए, हम कम मार्ग ESCs और पूरक सहित हौसले से तैयार मीडिया के एक नए बैच के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं । कभी-कभी अभिकर्मकों और सामग्रियों का बैच भिन्नता हो सकती है। इस प्रकार, हम एन 2 और अल्ट्रा-कम अटैचमेंट फ्लास्क जैसे अभिकर्मकों की कई बोतलें खरीदने की सलाह देते हैं जो एक ही लॉट से होते हैं जब तक कि उनका उचित समय में उपयोग किया जा सकता है।

कई अन्य मस्तिष्क ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल के विपरीत, यह विधि बायोरिएक्टर का उपयोग नहीं करती है; इसके बजाय कोशिकाओं को मीडिया में परिवर्तन से अलग अपेक्षाकृत स्थिर रहते हैं । यह न्यूरोस्फीयर के साथ पिछले काम के समान है, जो अंततः 2डी न्यूरोनल संस्कृतियों को20बनाने के लिए अलग हो गए थे। इस मॉडल में कोशिकाओं को 3 डी प्रारूप में रखा जाता है और संस्कृति में 6 महीने तक बढ़ने की अनुमति दी जाती है। यह पाया गया कि एकल कोशिकाओं को एकत्र करने के बजाय छोटे समूहों का उपयोग करते समय ऑर्गेनॉइड उज्जवल दिखते थे, जिसे हमने कम परिगलित के रूप में समझाया था। जैसा कि पहले बताया गया था, जब मस्तिष्क ऑर्गेनोइड समूहों का मूल्यांकन 5 महीने में हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जाता था, तो परिगलन16के कोई स्पष्ट क्षेत्र नहीं थे। यद्यपि कोशिकाओं के छोटे समूहों से शुरू होने से ऑर्गेनोइड के आकार में थोड़ी विविधता का परिचय मिलता है, लेकिन अधिकांश ऑर्गेनॉइड मोटे तौर पर समान आकार के थे।

एक विषमलॉगस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और एक बायोरिएक्टर के उपयोग के फायदे और नुकसान दोनों हैं। कुछ सेल प्रकार, या बड़े मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड एक शर्त या किसी अन्य के तहत विकास पसंद कर सकते हैं। तहखाने झिल्ली मैट्रिस या अन्य हाइड्रोगेल विशेष क्षेत्रों में विकास कारकों को चुनिंदा रूप से जोड़ने या विशिष्ट मोल्ड बनाने के लिए फायदेमंद हो सकते हैं। यद्यपि बेसमेंट झिल्ली मैट्रिस को त्रि-आयामी संगठन और विभेदन15का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इस बात पर जोर देने लायक है कि इनमें से कुछ उत्पादों में खराब परिभाषित और परिवर्तनीय संरचना है जिसमें विकास कारकों की मात्राशामिल है 12। मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड को सफ़्ट करते समय कार्यप्रवाह को सरल बनाने के अलावा, बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की अनुपस्थिति से त्रि-आयामी इमेजिंग तकनीकों में भी सुधार हो सकता है।

इस मस्तिष्क ऑर्गेनोइड मॉडल प्रणाली का विकास कई संभावित अनुप्रयोगों के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, हाइपोक्सिया, हाइपरग्लाइसीमिया, हाइपरकैप्निया और दूसरों के बीच संक्रमण जैसे जहरीले अपमान का परीक्षण इस प्रणाली के साथ किया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों या तो आनुवंशिक रूप से संशोधित स्टेम सेल या रोगी विशिष्ट मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) के साथ शुरू करके इस प्रणाली के साथ अध्ययन किया जा सकता है । ऑर्गेनोइड संस्कृति के दौरान विभिन्न सेल प्रकार ों को जोड़ने की क्षमता भी ट्यूमर-मस्तिष्क इंटरैक्शन का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करती है। प्रोटोकॉल की सादगी और महंगी, विशेषता सामग्री की कमी को देखते हुए हमें आशा है कि इस दृष्टिकोण दोनों के भीतर और क्षेत्र के बाहर प्रयोगशालाओं द्वारा अपने अद्वितीय लाभ के साथ एक संभावित विधि के रूप में इस तेजी से आगे बढ़ने के लिए विचार किया जा सकता है प्रगति और रोमांचक अनुशासन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एसजीके डैनसर आईटी और जीन-इन-सेल के लिए एक सब सदस्य है ।

Acknowledgments

हम सहायता के लिए येल स्टेम सेल कोर (वाईसीसी), और येल कैंसर सेंटर (वाईसीसी) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ जंग किम को उनकी न्यूरोपैथोलॉजी समीक्षा के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को कनेक्टिकट पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान कोष, मार्च ऑफ डिम्स, और NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), येल कैंसर केंद्र और येल कैंसर जीव विज्ञान प्रशिक्षण कार्यक्रम NCI CA193200 (E.B.) और यूसुफ और यूसुफ से एक उदार अप्रतिबंधित उपहार द्वारा समर्थित किया गया था और ल्यूसिले माद्री।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड मानव भ्रूणीय स्टेम सेल न्यूरोडेवलपमेंट न्यूरोनल भेदभाव रोग मॉडलिंग सरलीकृत विकास कारक
मानव भ्रूण स्टेम सेल से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक स्थिर स्व-निर्देशित विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boisvert, E. M., Means, R. E.,… More

Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter