Summary
פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.
Abstract
אורגנואידים המוח האנושי הבדיל מתאי גזע עובריים להציע את ההזדמנות הייחודית לחקור אינטראקציות מסובכות של סוגי תאים מרובים במערכת תלת ממדית. כאן אנו מציגים שיטה ברורה יחסית וזולה אשר מפיקה אורגנואידים במוח. בפרוטוקול זה האדם בתאי גזע רב עוצמה מנותקים לאשכולות קטנים במקום תאים בודדים גדל במדיה בסיסית ללא מטריצה הטרוולוגי מטריקס מטריצות או גורמי גדילה אקסוגניים, המאפשר רמזים התפתחותיים מהותי כדי לעצב את ה גידול של אורגאיד. מערכת פשוטה זו מייצרת מגוון של סוגי תאי המוח כולל התאים גליה ו microglial, בתאי גזע, ונוירונים של המוח הקדמי, אמצע המוח, ו הראש. אורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה גם להציג את הסימנים של הזמן המתאים וארגון מרחבית הפגינו על ידי תמונות ברייטפילד, היסטולוגיה, immunofluorescence ובזמן אמת הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( רביעיית-PCR). מכיוון שאורגנואידים אלה מכילים סוגי תאים מחלקים שונים של המוח, הם יכולים להיות מנוצלים ללימוד מספר רב של מחלות. לדוגמה, במאמר האחרון הדגמנו את השימוש באורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה לחקר ההשפעות של היפוקסיה על המוח האנושי. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור מערך של קשה אחרת ללמוד תנאים כגון מגבלות נוירולוגיים, הפרעות גנטיות, ומחלות נוירולוגיות.
Introduction
בשל מגבלות מעשיות ואתיות רבות, יש קושי רב בלימוד המוח האנושי. בעוד מחקרים ניצול מכרסמים היו קריטיים להבנה שלנו של המוח האנושי, המוח העכבר יש הרבה וני1,2. מעניין, עכברים יש צפיפות עצבית כי הוא לפחות 7 פעמים פחות מאשר המוח הפרימטים3,4. למרות הפרימטים קרובים יותר לבני אדם מאשר מכרסמים מבחינה אבולוציונית, זה לא מעשי עבור רוב החוקרים לעבוד איתם. המטרה של פרוטוקול זה היתה לסכם תכונות חשובות רבות של המוח האנושי באמצעות שיטה פשוטה וזולה יותר ללא צורך במרתף הטרוולוגי מטריקס קרום או גורמי צמיחה אקסוגני תוך שמירה על מגוון תאי המוח וארגון הסלולר.
עבודת המעצבים מן המעבדה sasai בשימוש סרום חופשי התרבות של embryoid גופים (sfebq) שיטה לייצר שני ותלת מימדי התאים העצביים מתאי גזע עובריים (escs)5,6. הרבה שיטות של אורגנואיד של המוח האנושי הלכו בדרך דומה יחסית של escs7,8. לעומת זאת, פרוטוקול זה מתחיל עם אשכולות של escs האדם הפרטי (hESCs), בדומה לשלבים הראשוניים של עבודה הזרע של מעבדות תומסון ו ג'אנג לפני שלבי הציפוי9,10 , כמו גם את השלב ההתחלתי של פרוטוקול המוח אורגנואיד של המעבדה pasca לפני התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני11. מטריצות קרום מרתף (למשל, מטריצות) כבר נוצלו בפרוטוקולים מאורגאיד של המוח הרבים וזה הוכח להיות הגרדום האפקטיבי8. עם זאת, הנפוץ ביותר מטריצות קרום המרתף לא בא ללא סיבוכים כפי שהם שיתוף לטהר עם כמויות לא ידועות של גורמי גדילה עם אצווה לשונות אצווה במהלך הייצור12. בנוסף, מטריצות אלה יכולים לסבך את ההדמיה, ולהגדיל את הסיכון של זיהום ועלות.
בעוד מאורגנואידים המוח האנושי יכול לשמש כדי לענות על שאלות רבות, יש מגבלות מסוימות לזכור. עבור אחד, החל בתאי גזע עובריים, אורגנואידים דומה יותר למוח בוגר מאשר המוחות הישנים וככזה לא יכול להיות מודלים אידיאליים עבור מחלות המתרחשות בגיל הזקנה, כמו מחלת אלצהיימר. שנית, בעוד הפרוטוקול שלנו מצאו סמנים של המוח הקדמי, אמצע המוח התפתחות המוח אשר שימושיים כדי ללמוד את ההשפעה של טיפול או מחלה על תאים מאזורי מוח מרובים בהופעה, ניתן לעקוב אחר פרוטוקולים אחרים כדי להתרכז באזורי מוח ספציפיים13,14. לבסוף, הגבלה נוספת של מודלים אורגנואיד הוא זה של גודל, בעוד האורך הממוצע של המוח האנושי כ 167 מ"מ, אורגנואידים המוח עשה עם שימוש של עצבנות לגדול עד 4 מ"מ8 ואת האורגנואידים שנוצר על ידי פרוטוקול זה לגדול ל 1-2 מ"מ ידי 10 שבועות. למרות זאת, פרוטוקול זה מספק כלי חשוב לחקר רקמת המוח האנושי והאינטראקציה של סוגי תאים מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקת תאי גזע
- לשמור על H9 hESCs על שכבה של גורם צמיחה מופחתת מטריקס קרום המרתף (לראות את הטבלה של חומרים, מעתה ואילך פשוט המכונה מטריצה) על פי הוראות היצרן.
- כדי לחלוק את אחד 6-באר צלחת או 1 10 ס"מ צלחת, לשלב 100 μL של מטריקס עם 5.9 mL של מדיום שונה של הקרח הקרה של Dulbecco (DMEM)/F12 מדיה. לוחות לעטוף בסרט פרפין ולאחסן לילה ב 4 ° c. השתמש בהם ביום שלמחרת לפני שאתם משתמשים בתאי הזדקנות לאחר שעודפי המולטימדיה/המדיה משופחת.
- תרבות התאים שבוע לשבוע בקירוב 1:12 מפוצל כל 7 ימים. שמור על התאים באמצעות מדיה mTESR-1 ב 37 ° c, אינקובטור נמוך חמצן (5% O2, 5% CO2). רענן מדיה מדי יום. מריחואנה מבדילים בין תאים מהתרבות בין מעברים בעזרת כלי זכוכית.
- H9 תאים צריך להיות מעבר ארבעה עד שישה ימים לפני ניצול אותם כדי לייצר אורגנואידים. התאים צריכים להיות מיושנים בערך 1:8 יחס של אשכולות תאים. כדי לעשות זאת, להתחיל על ידי שטיפה את התאים עם מדיה F12 dmem ו הנתק את התאים עם פרוטאז נייטרלי (למשל, dispase, מעתה המכונה פשוט פרוטאז), לשטוף עם dמאמ/F-12, ואת הצלחת כמו אשכולות תא 30-60 על פני 4 צלחות (6-טוב או 10 ס מ) ב ~ 20% ה יומיים לפני הקציר, מעבר אותם לאינקובטור רגיל (21% O2, 5% CO2). לוחיות הרישוי אמורות להגיע ל-~ 80% שליטה בזמן התחלת היווצרות מבנה ארגונית.
2. דיסוציאציה של hESCs לתרבות ארגונית
- מחלקים את פתרון מלאי הפרוטאז (5 U/mL).
הערה: אנחנו בדרך כלל להקפיא למטה 1 mL מתחת ל-20 ° c לשימוש במשך מספר חודשים. - לדלל את הפתרון מלאי פרוטאז לריכוז העבודה על ידי הוספת 1 מ ל של פתרון המניה פלוס 5 מ ל/F12 עבור כל 6-היטב או 10 ס"מ צלחת של hESCs.
- מנושף ומסיר את מדיית תרבות התא, ולאחר מכן מכסים את hESCs עם פתרון הפרוטאז. מניחים צלחות בחממה עבור 10-15 דקות או עד שקצות המושבות מסתובבים ומתחילים להיפרד מהמטריקס.
- הטה את הצלחת, ומכה את פתרון הפרוטאז, ושטוף בעדינות את התאים באמצעות DMEM/F12 שלוש פעמים. השתמש 2 mL/גם עבור כל כביסה בעת שימוש צלחת 6-הבאר ו 6 מ ל כאשר משתמש בצלחת 10 ס מ. ודא שמושבות נשארות מצורפות למטריצה בעת ביצוע שלב זה.
- הוסף בחזרה על 1.5 mL של מדיית mTESR טרי לכל טוב (או 5 מ ל על צלחת 10 ס מ) ולשטוף את התאים החוצה את הצלחת באמצעות ליטוף עדין.
- באמצעות שימוש בפיפטה בגודל 10 מ ל, בעדינות לחלק את hESC ולוותר בתוך הצלחת עד שהם מגיעים כ 1/30th מהגודל המקורי שלהם. אשכולות המושבה צריכים להידמות לריבועים בגודל של ~ 250-350 יקרומטר בסיום שלבים אלה.
3. הדור של אורגנואידים
- העברת תאים לתוך מצורף יחיד אולטרה נמוך T75 תרמוס המכיל 30 מ ל של mTESR מדיה ללא מקדם בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ (bFGF).
- למחרת, להטות את הבקבוקון (עם) כך את הבריכה תאים חיים בפינה (זה יכול לקחת 5-10 דקות ביום הראשון, אבל יהיה מהיר ככל האשכולות לגדול).
הערה: אם יש מספר גדול של תאים שדבקו בתחתית הבקבוקון בשלב זה או בצעדים הבאים, העבר את התאים לבקבוקון חדש. זה נורמלי להיות אוכלוסיה גבוהה של תאים מתים ביומיים הראשונים. בעת ביצוע שינויי מדיה, הקפד להסיר את הפסולת הסלולרית ככל האפשר. - לאחר התאים להתיישב, לאכול את התקשורת ואת התאים מת עוזב כ 10 מ ל של מדיה המכילה את התאים החיים.
- הוסף ~ 20 מ ל של מדיה bFGF נמוכה (Dמאמ/F12 שיושלם עם 1x N2, 1x B27, 1x L-גלוטמין, 1x NEAA, 0.05% בסרום שור (BSA), ו 0.1 מ"מ מונטגליצרול (MTG) שיושלם עם 30 ng/mL bFGF).
- . תבדקו את התאים ביום השני אם רוב התאים נראים בריאים ובהירים, אין צורך לעשות דבר. עם זאת, אם יותר משליש תאים מופיעים כהה, להחליף את המדיה (באמצעות אותה טכניקה הטיה כמו בשלב 3.2) עם ~ 20 mL של מדיה נמוכה bFGF שיושלם עם 20 ng/mL bFGF.
- ביום 3, להחליף חצי של התקשורת (באמצעות טכניקת הטיית בשלב 3.2) עם 20 מ ל של מדיה נמוכה bFGF בתוספת 10 ng/mL bFGF.
- ביום 5, להחליף חצי בינונית (באמצעות טכניקת הטיית בשלב 3.2) עם 20 מ ל של מדיה השראה עצבית (נים: DMEM/F12, 1x תוספת, 0.1 mM הגברת NEAA, 2 μg/mL הפארין).
הערה: אם ישנם אשכולות גדולים של תאים או אורגנואידים הגדולים בהרבה מהאחרים, יש להסירם מהתרבות. גודל מוערך על ידי המראה תחת המיקרוסקופ; לדוגמה, באמצעות עינית עם reticle. רוב האורגנואידים הם בגודל דומה (בערך 100 ± 20 μm). הסרנו את האורגנואידים שהיו בערך. שני קטנים או גדולים מהאחרים - להחליף חצי בינוני (~ 15 מ"ל) (באמצעות טכניקת הטיית) עם נים בכל יום אחר.
- לאחר 3 שבועות בתרבות, להוסיף 100x פניצילין/סטרפטומיצין למדיה (נים: DMEM/F12, 1x N2 תוספת, 0.1 mM הגברת NEAA, 2 μg/mL הפארין) בריכוז הסופי של 1x אם תרצה. . תרענן את המדיה כל יומיים
הערה: בצורה זו שמרו על האורגנואידים של עד 6 חודשים בתרבות.
4. הוצאת רנ א והכנה
- בעדינות לחלץ כ 15 אורגנואידים (בהתאם לגודל) מן הבקבוקון באמצעות צינור 10 מ"ל ומקום לתוך שפופרת 1.5 mL.
- בעדינות הגלולה האורגנואידים בצנטריפוגה (200 x g עבור 1 דקות), ולשטוף עם ה-PBS של שיתוף 1X של דולפי (dpbs) שלוש פעמים.
- לחלץ RNA באמצעות מערכת או פרוטוקול מאומתים (לדוגמה, RNeasy kit).
- למדוד את ערך צפיפות אופטית של כל מדגם ב 260 ו 280 nm.
- הכן cDNA באמצעות מערכת או פרוטוקול מאומת (למשל, iScript cDNA ערכת סינתזה).
- בצעו רביעיית-PCR באמצעות התחל מראש (שולחן 1) כולל גן אחד לפחות של משק בית.
5. אימונוהיסטוכימיה
- קיבעון
- הכינו פתרון של 4% פאראמפורמלדהיד והניחו אותו ב -4 ° c.
- תחתוך את הקצה של. פיפטה העברה סטרילית
- בעדינות לחלץ אורגנואידים באמצעות העברה לחתוך את הצנרת, כפי שהם יכולים להישבר בקלות בנפרד, במיוחד כאשר הם גדלים גדולים, ולמקם אותם לצלחת 6-היטב עם מדיה נוספת או DPBS.
- להטות את הצלחת, לנפח את התקשורת, ולהחליף עם 1x DPBS. שטפו את התאים באמצעות 1x DPBS פעמיים נוספות.
- החליפו את ה-DPBS עם 4% הפתרון החצי-בחצי הכולל והניחו על שייקר ב -4 ° c.
הערה: בזמן שתיקנו במשך יומיים (עבור אורגנואידים קטנים) ל -7 ימים (עבור אורגנואידים > 3 חודשים), פעמים קצרות יותר (לדוגמה, 16-24 h) יכולים להיות גם אפשריים. - הכינו 30%, 20% ו -10% סוכרוז פתרונות ב-DPBS.
- לאחר קיבוע בשנת הג, להחליף עם 10% סוכרוז פתרון ומקום על שייקר ב -4 ° c עבור 24 שעות.
- החליפו את ה-10% סוכרוז עם 20% סוכרוז והניחו על שייקר ב -4 ° c במשך 24 שעות.
- החליפו 20% סוכרוז ב-30% מעלות ומניחים על שייקר ב -4 ° c במשך 24 שעות.
- מקטעים קפואים
- הכינו שכבה שטוחה של קרח יבש והניחו עובש פלסטי מתויג על גבי זה.
- יוצקים שכבה דקה של בינוני בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך התבנית ומאפשרים לה להתחיל להארדן (תוך כמה שניות).
- מניחים כמה אורגנואידים על החלק העליון של OCT בתבנית באמצעות פיפטה העברה עם הקצה לחתוך ולשים לב קרוב למיקום של האורגנואידים.
- הוסיפו לאט את אוקטובר עד שעובש מלא והאורגנואידים מכוסים. תן לו להיות מרדן לחלוטין עבור 10 דקות נוספות.
הערה: בזמן הקפאת מעל 10 דקות מסייע להבטיח מיקום יחסי אידיאלי של אורגנואידים מרובים עבור הצבת, אפשר להשתמש בתערובת הקרח אתנול יבש או חנקן נוזלי כדי להקפיא מהר יותר. - סמן את המיקום היחסי של האורגנואידים עם סמן כדי להקל על מיקומם בעת חיתוך.
- מקם את התבניות בשקית או בקופסה ואחסן ב-80 ° c עד שמוכן לחתוך את המקטעים.
- באמצעות קריוסטט, פרוסה 10 יקרומטר סעיפים ומניחים את הרקמה על תווית, טעונה באופן חיובי שקופיות.
- צביעת
- הכנת פתרון חסימה (0.3% טריטון X-100, 4% סרום חמור רגיל ב-PBS).
- השתמש בעט הידרופובי לצייר סביב המערכת של הרקמה.
- שטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד.
- החלף את ה-PBS בפתרון חסימה של 1 h בטמפרטורת החדר.
- החלף את פתרון חסימת עם פתרון נוגדן (נוגדן בריכוז המתאים, 0.1% טריטון X-100, 4% סרום חמור רגיל ב-PBS) ב 4 ° c ללילה.
- ביום שלמחרת, שטוף את השקופית 3 פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד.
- החלף את ה-PBS עם הנוגדן המשני המתאים (בריכוז המתאים) מדולל בתמיסה הנוגדן עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3 פעמים עבור 10 דקות בכל פעם עם 1x PBS.
- החל את 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) כתם לשטוף שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד עם 1x PBS.
- כיסוי מוספית מחליק לקדמת השקופיות עם הפתרון הגובר, לייבש את טמפרטורת החדר בחושך, ולאחסן בחשיכה ב -4 ° c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג נציג ברייטפילד תמונות של מספר נקודות זמן כדי להדגים מה התאים/האורגנואידים נראים כמו בכל השלבים השונים של הפרוטוקול. HESCs הוסרו מלוח התרבות רקמה, שבור לחתיכות קטנות, והניח בתוך T75 מצורף אולטרה נמוך בקבוקון שבו הם יצרו כדורים. חשוב לציין כי התאים נראים בהירים ודומים בגודלם, ללא תאים אפלים ומתים במרכזים של אשכולות אלה. התאים הוסלו בהדרגה. ביום 5, הם הושמו בתקשורת השראה עצבית והם נשארו בתקשורת הזאת לאורך תקופת התרבות. למרות האורגנואידים לקבל גדול יותר ולכן כהה יותר לאורך זמן, חשוב לשים לב של מבנים דמויי שושנת העצבים (חיצים שחורים) הנמצאים במהלך פיתוח המוח מאורגאיד ולהרחיב. רוזטות מצביעים על ייזום של בידול עצבי ומכילים תכונות של הצינור העצבי העובריים, הצגת מאפייני האפיתל וסביב לומן פסגה15.
כתמים של האורגנואידים עם המטאוקסילין והאאוזין במשך 5 חודשים בתרבות הצביע על כך שאין כמויות אדירות של נמק אפילו במרכזים, שהיה מתוך דאגה ראשונית בהתחשב במערכת התרבות הקפואה (איור 2א). אורגנואידים אלה הפגינו מורפולוגיה היסטולוגית דומה לקליפת האדם המבוססת על הערכה מיקרוסקופית קלה על ידי נוירופתולוגית מנוסה (איור 2ב). על ידי היסטולוגיה, מורפולוגיות תאים ייחודיים רבים נצפו דמוי גליה (ראש חץ כחול), נוירונים (חץ ראש אדום), תאים עם מורפולוגיה של קג'אל-רטיס (חיצים שחורים), ו נוירופיל (ראש חץ כתום) (איור 2ב, ג).
כדי לקחת מבט מעמיק על ביטוי הגנים בתוך התאים, מבוצע רביעיית ה-PCR. עבור התוצאות המוצגות באיור 3, כל סרגל מייצג 3 קבוצות נפרדות של תאים שגדלו בנפרד ונקצרו בנקודת הזמן שצוינה. דגימות אלה היו לאחר מכן בטריליטה עם זוג מתחל כדי הגן המצוין בנוסף הגן של משק הבית, החוצה dh. המשלח גלוטמט, Vglut1 (איור 3A), התבטא ב2.5 שבועות, גדל ב 5 שבועות, ונשאר עקבי עד 5 חודשים בתרבות. סמן מוח מקדמי, Foxg1 (איור 3ב), התבטא ברמות נמוכות עד 5 שבועות בתרבות. סמן שכבה עמוקה, Tbr1 (איור 3ג), הגיע לשיאו בסביבות 5 שבועות וירד לאחר מכן, בעוד סמן השכבה העליונה, Satb2 (איור 3ד), גדל עם הזמן.
הביטוי של סמן גחוני (Eng1) (איור 3E), המוח המובל/השדרה סמן Hoxb4 (איור 3F), כמו גם את אוליגודנדרוציטים סמן, Olig2 (איור 3G), הכל גדל לאורך זמן. לעומת זאת, הסמן תא גזע, Sox2 (איור 3H), ירד לאורך זמן. הסמן הגליאל, Fap (איור 3I), השיאה בחמישהשבועותונשאר קבוע יחסית לאחר מכן. בנוסף, הנתונים האימונומלואוטיים היו עקביים עם נתוני רביעיית ה-PCR. במהלך 10 שבועות היה ביטוי חזק של Foxg1 (איור 4א). Sox2 ביטוי היה מוגבל יותר לאזורים הדומים לאזור התת-ממדי (svz) (איור 4ב, ג). מעניין, היה גם ביטוי מסוים של סמן התא הרדיאלי החיצוני גליה, הופה (איור 4ד).
איור 1: סקירה של תנאי גדילה אורגנואיד ומורפולוגיה. (א) סכמטית של שינויי מדיה. (ב-מ) דמויות מייצגות של אורגנואידים כפי שהם הבשיל. (ב-מ) H9 hESCs (ב) השתמשו כדי ליצור את אורגנואידים המוח. אורגנואידים על (ג) יום 2 ב 20 Ng/ML bfgf מדיה, ו (ד) יום 3 ו (E) יום 4 ב 10 ng/mL bfgf מדיה. (F-M) אורגנואידים ב מדיה אינדוקציה עצבית (נים) בימים 5 (ו), 8 (ז), 10 (ח), 17 (אני) 35 (J, K), ו 70 (L, M). חיצים מצביעים על רוזטות עצביות. סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אורגנואידים דמיון משותף היסטולוגית לרקמת המוח האנושי. H & E כתמים של האורגנואידים בחמישה חודשים (א) עם כמה בשכבות הדומה לקליפת האדם (ב). בהגדלה גבוהה יותר תא מורפולוגיות הרבה נצפו כולל גליה (ראש חץ כחול), נוירונים (חץ ראש אדום), נוירופיל (ראש חץ כתום), ותאים עם מורפולוגיה Cajal-רטיוס (החצים שחורים) (B, C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי של גנים נוירותפתחותיים בתוך המוח אורגנואידים לאורך זמן. נתונים כמותיים RT-PCR באמצעות SYBR ירוק הערכת הביטוי של Vglut1 (א), Foxg1 (ב), Tbr1 (ג), Satb2 (ד), En1 (E), Hoxb4 (F), OLIG2 (G), Sox2 (ח) ו-gfap (I). קווי שגיאה = מתכוון ל-± סטיית תקן (n ≥ 3). דמות זו שונתה מ-16. עיין בטבלה 1 לקבלת מידע פריימר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי של חלבונים נוירותפתחותיים בתוך המוח אורגנואידים ב 10 שבועות. Immunofluorescence חשף ביטוי חזק של Foxg1 (א), ביטוי מקומי של Sox2 (ב, C) ואת הנוכחות של hopx (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ג'ין | רצף (5 עד 3 ') | אמפליקון | אקסון | |
| En1 | F | מיכל ברוך CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT מיכל ברקת |
2 | ||
| Foxg1 | F | מיכל הכהן גאגא |
188 | 1 |
| R | כמוסות מגנט מיכל הג |
1 | ||
| למעלה | F | מיכל כנעני מועצת |
449 | 8 |
| R | כמוסות מטברכות מיכל בגין |
9 | ||
| מיכל הגופי | F | מוטי שלמה ATG |
80 | 4 |
| R | מיכל שגיא GTA |
5-Apr | ||
| Hoxb4 | F | מיכל לוי מיכל שינה |
80 | 2 |
| R | המנון באגה מיכל בגין |
2 | ||
| Olig2 | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA GCG |
451 | 1 |
| R | המנון באילת מיכל שגיא |
2 | ||
| Satb2 | F | מיכל כנעני CTC |
94 | 6 |
| R | לינה ברוך TTG |
7 | ||
| Sox2 | F | מדריך GT |
150 | 1 |
| R | מיכל שונוב TTT |
1 | ||
| Tbr1 | F | GTCACCGCCTACCAGAA מועצת |
101 | 4 |
| R | מיכל בגין TG |
6 | ||
| Vglut1 | F | מדריך מאג מיכל כנעני |
183 | 5-Apr |
| R | GCGACTCCGTTCTAAGG חברתנו |
6 |
שולחן 1: רצף פריימר המשמש עבור כמותי RT-PCR באיור 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדומה למודלים אורגנואיד אחרים, זוהי מערכת מלאכותית המגיעה עם מספר אזהרות. למרות שהיה אצווה קטנה וריאציה אצווה במונחים של רמות הביטוי הכולל, אורגנואידים בודדים הראו הבדלים. לדוגמה, המיקום של האזורים החיוביים של סוקס-2 לא היה זהה בכל אורגנואיד (איור 3). בעוד qPCR מתאים לחפש שינויים כוללים באצוות של תאים, שיטות נוספות כגון RNAseq תא יחיד יהיה מנוצל במחקרים עתידיים כדי לאסוף מידע נוסף על בסיס תא אחר תא. מגבלה נוספת של מערכת זו, היא שהיא אינה משלבת את ואצלב בתוך האורגנואידים כפי שנעשה בכמה מחקרים שנעשו לאחרונה17,18,19. עם זאת, מעבר hESCs מסביבת חמצן נמוך עד גבוה יכול להיות דומה יותר לאנאירובית למעבר אירובי בעובר מתפתח.
הצעדים הקריטיים בפרוטוקול זה הם היווצרות של הנוירוספירות, כמו גם התחזוקה המתאימה, כולל שינויי מדיה עם מדיית התרבות המתאימה כדי להבטיח תאים בריאים וחומרים מזינים נאותים לאורגנואידים הגדלים ללא צפיפות יתר . כדי לפתור הפצת תאים או בידול לקוי, אנו ממליצים להתחיל באצווה טרייה של ESCs מעבר נמוך ומדיה טרייה המוכנה לרבות תוספי מזון. מדי פעם יכול להיות וריאציה אצווה של ריאגנטים וחומרים. כך, אנו ממליצים לרכוש בקבוקים מרובים של ריאגנטים כגון N2 ו-ultra-נמוך מבחנות מצורף אשר הם מאותו הרבה, כל עוד הם יכולים להיות מנוצל כמות סבירה של זמן.
בניגוד לרבים מפרוטוקולי המוח האחרים, שיטה זו אינה משתמשת בביוריאקטור; במקום זאת התאים נשארים מחוץ לשינויים מהתקשורת. זה דומה לעבודה קודמת עם נוירוספירות, אשר בסופו של דבר נשברו לגזרים כדי להפוך את התרבויות הנוירואליות הדו20. במודל זה התאים נשמרים בפורמט תלת-ממדי ומותר לגדול עד 6 חודשים בתרבות. נמצא כי בעת שימוש באשכולות קטנים במקום לצבירה של תאים בודדים כי האורגנואידים נראו בהירים יותר, שאנו מפרשים פחות נמק. כפי שדווח בעבר, כאשר אשכולות המוח אורגנואיד הוערכו על ידי היסטולוגיה ו immunofluorescence במהלך 5 חודשים, לא היו אזורים ברורים של נמק16. למרות שהחל אשכולות קטנים של תאים מציג מגוון קטן בגודל של אורגנואידים נוצר, רוב האורגנואידים היו בגודל דומה בערך.
השימוש הטרוולוגי מטריקס קרום המרתף וביוריאקטור יש גם יתרונות וחסרונות. סוגי תאים מסוימים, או מארגני מוח גדולים יותר עשויים להעדיף צמיחה תחת תנאי אחד או אחר. מטריצות קרום מרתף או הידרוג'לים אחרים עשויים להועיל באופן סלקטיבי להוסיף גורמי גדילה לאזורים מסוימים או ליצור תבניות ספציפיות. למרות מטריצות קרום המרתף הוכחו לתמוך ארגון תלת מימדי ובידול15, כדאי להדגיש כי חלק מהמוצרים הללו יש הרכב מוגדר ומשתנה גרוע הכולל כמויות של גורמי צמיחה12. בנוסף לפישוט זרימת העבודה תוך הקפדה על אורגנואידים המוח, העדר מטריצת קרום מרתף עשוי גם לשפר שיטות דימות תלת ממדיות.
הפיתוח של מערכת המודל המוחית הזאת מציע גישה חדשה ליישומים פוטנציאליים רבים. לדוגמה, עלבונות רעילים כמו היפוקסיה, היפררגליקמיה, hypercapnia, וזיהום בין היתר, עשוי להיבדק עם מערכת זו. בנוסף, הפרעות נוירוהתפתחותיות ניתן ללמוד עם מערכת זו על ידי הפעלת בתאי גזע מהונדסים גנטית או החולה ספציפי המושרה תאים גזע pluripotent hPSCs). היכולת להוסיף סוגי תאים שונים במהלך תרבות ארגונית גם מציעה את האפשרות ללמוד אינטראקציות המוח הגידול. בהתחשב בפשטות הפרוטוקול וחוסר החומרים המיוחדים, אנו מקווים כי גישה זו עשויה להיחשב על ידי מעבדות הן בתוך ומחוץ לתחום כשיטה פוטנציאלית אחת עם יתרונות ייחודיים משלו כדי להתקדם במהירות זו התקדמות ומשמעת מרגשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.G.K. הוא חבר SAB עבור Dansar IT ו ג'ין בתוך התא.
Acknowledgments
אנו מודים לליבת תאי הגזע של ייל (YSCC), ומרכז הסרטן של ייל (YCC) לסיוע. אנחנו מודים לד ר יונג קים. על סקירת הנוירופתולוגיה שלו עבודה זו נתמכה על ידי הרפואה הרגנרטיבית של קונטיקט הקרן, מארס של מטבעות המלך, ו nhlbi R01HL131793 (S.G.K.), מרכז הסרטן של ייל ואת אוניברסיטת ייל ביולוגיה אימון תוכנית nci CA193200 (אי) ומתנה נדיבה מוגבלת של יוסף ו . לוסיל מאסי
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
