Summary
이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.
Abstract
배아 줄기 세포에서 분화된 인간의 뇌 오르가노이드는 3차원 시스템에서 여러 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서 우리는 두뇌 오르가노이드를 산출하는 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 인간 다능성 줄기 세포는 단일 세포 대신 작은 클러스터로 분해되고 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자없이 기본 매체에서 성장하여 본질적인 발달 단서를 형성할 수 있게 합니다. 오르가노이드의 성장. 이 간단한 시스템은 신경교 세포와 미세 교세포, 줄기 세포 및 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌의 뉴런을 포함한 다양한 뇌 세포 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에서 생성된 오르가노이드는 또한 브라이트필드 이미지, 조직학, 면역형광 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 입증된 적절한 시간및 공간 조직의 특징을 표시합니다. qRT-PCR)을 참조하십시오. 이 오르가노이드는 두뇌의 각종 부분에서 세포 모형을 포함하기 때문에, 그(것)들은 질병의 다수를 공부를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 최근 논문에서 우리는 인간 두뇌에 저산소증의 효력을 공부하기 위한 이 프로토콜에서 생성된 organoids의 사용을 설명했습니다. 이 접근법은 신경 발달 장애, 유전 장애 및 신경질환과 같은 조건을 연구하기 어려운 배열을 조사하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
무수 한 실용적이 고 윤리적제한으로 인해 인간의 뇌를 연구하는 데 많은 어려움이 있었습니다. 설치류를 이용한 연구는 인간의 뇌에 대한 우리의 이해에 중요했지만, 마우스 뇌는 많은비유사성1,2. 흥미롭게도, 마우스는 영장류뇌보다적어도 7배 적은 뉴런 밀도를 가지고3,4. 영장류는 진화적 관점에서 설치류보다 인간에 더 가깝지만 대부분의 연구자들은 그들과 함께 일하는 것은 실용적이지 않습니다. 이 프로토콜의 목적은 뇌 세포 다양성과 세포 조직을 유지하면서 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자를 필요로하지 않고 단순화되고 저렴한 방법을 사용하여 인간 뇌의 많은 중요한 기능을 재량화하는 것이었습니다.
Sasai 실험실에서 조형 작업은 신호화 된 배아 줄기 세포 (ESCs)에서 2 차원 및 3 차원 신경 세포 유형을 생성하는 배아 체의 혈청 무료 배양 법을 사용5,6. 많은 인간의 뇌 오르가노이드 방법은 신호화된 ESCs7,8에서비교적 유사한 경로를 따랐습니다. 대조적으로, 이 프로토콜은 분리된 인간 ESCs(hESCs)의 클러스터로 시작하며, 도금 단계9,10뿐만 아니라 외인성 성장 인자(11)를 첨가하기 전에 파스카 실험실의 뇌 오르가노이드 프로토콜의 초기 단계인 톰슨 및 장 실험실의 정액 작업의 초기 단계와 유사하게 시작한다. 지하막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)는 많은 뇌 오르가노이드 프로토콜에 활용되어 왔으며 효과적인 스캐폴드8로나타났다. 그러나, 가장 일반적으로 사용되는 지하 막 매트릭스는 생산12동안 배치 가변성에 배치와 성장 인자의 알 수없는 수량과 공동 으로 공동 으로 합병증없이 오지 않는다. 또한 이러한 행렬은 이미징을 복잡하게 하고 오염 및 비용의 위험을 증가시킬 수 있습니다.
인간의 뇌 오르가노이드는 많은 질문에 대답하는 데 사용할 수 있지만, 염두에 두어야 할 특정 한계가 있습니다. 하나는, 배아 줄기 세포에서 시작, 오르가노이드는 더 밀접하게 노화 뇌보다 미성숙 한 뇌를 닮은 등 알츠하이머 병과 같은 노년기에 발생하는 질병에 대한 이상적인 모델이 아닐 수 있습니다. 둘째, 우리의 프로토콜은 여러 뇌 영역에서 세포에 대한 치료 또는 질병의 효과를 연구하는 데 유용한 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌 발달의 마커를 발견했지만, 다른 프로토콜은 특정 뇌 영역에 집중하기 위해 따를 수 있다13,14. 마지막으로, 오르가노이드 모델의 또 다른 제한은 크기의 반면, 인간의 뇌의 평균 길이는 약 167 mm, 교반의 사용으로 만든 뇌 오르가노이드는 4mm8까지 성장하고이 프로토콜에 의해 형성 된 오르가노이드는 1-2mm로 10 주까지 증가합니다. 그럼에도 불구 하 고, 이 프로토콜은 인간의 뇌 조직 및 여러 세포 유형의 상호 작용을 연구 하는 중요 한 도구를 제공 합니다.
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Protocol
1. 줄기 세포 유지 보수
- H9 hESCs를 성장 인자 감소 층의 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조, 이제부터는 단순히 매트릭스라고 함)에 유지하십시오.
- 6웰 플레이트 1개 또는 10cm 접시 1개를 코팅하려면 매트릭스 100 μL과 얼음으로 차가운 덜베코의 수정된 독수리 매체(DMEM)/F12 용지 5.9 mL를 결합합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 초과 매트릭스 /미디어가 흡입 된 후 세포를 통과하기 위해 다음 날에 사용하십시오.
- 세포를 매주 약 1:12 분할 비율로 7일마다 배양한다. 37°C, 저산소 인큐베이터(5%O2,5%CO2)에서mTESR-1 매포를 사용하여 세포를 유지한다. 매일 미디어를 새로 고칩니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 세포를 분화 제거.
- H9 세포는 오르가노이드를 생성하기 위하여 그(것)들을 이용하기 전에 4 6 일 통과되어야 합니다. 세포는 세포 군집의 대략 1:8 비율로 통과되어야 합니다. 이렇게하려면 DMEM F12 매체로 세포를 헹구고 중성 프로테아제 (예를 들어, 디스파제, 단순히 프로테아제라고 함)로 세포를 해리하고 DMEM / F-12로 헹구고 플레이트를 4 플레이트 (6-well 또는 10 cm)에서 20 % ~ 20 % 동안 30-60 세포 클러스터로 헹구습니다. 수확 2일 전에, 일반 인큐베이터(21%O2,5%CO2)로전환한다. 플레이트는 오르가노이드 형성을 시작할 때 ~ 80 % 의 합의에 도달해야합니다.
2. 오르가노이드 문화를 위한 hESCs의 해리
- 프로테아제 스톡 솔루션(5 U/mL)을 알리쿼트합니다.
참고: 일반적으로 몇 개월 동안 사용하기 위해 -20 °C에서 1 mL aliquots를 동결합니다. - 6웰 또는 10cm hESC 플레이트마다 1mL의 스톡 솔루션과 5mL의 DMEM/F12를 추가하여 프로테아제 스톡 용액을 작업 농도로 희석합니다.
- 세포 배양 배지를 흡인하고 제거한 다음 프로테아제 용액으로 hESCs를 덮습니다. 10-15 분 동안 또는 식민지의 가장자리가 반올림하고 매트릭스에서 분리하기 시작할 때까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 플레이트를 기울이고 프로테아제 용액을 흡인하고 DMEM/F12로 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다. 10cm 플레이트를 사용할 때는 6웰 플레이트와 6mL를 사용할 때는 세척할 때마다 2 mL/well을 사용하십시오. 이 단계를 수행할 때 콜로니가 행렬에 연결되어 있는지 확인합니다.
- 신선한 mTESR 용지 약 1.5 mL을 각 웰(또는 10cm 플레이트의 경우 5mL)에 다시 넣고 부드러운 파이펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 씻어내도록 합니다.
- 10mL 파이펫을 사용하여 플레이트 내에서 hESC를 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 부드럽게 흡인하고 분배합니다. 식민지 클러스터는 이 단계를 완료할 때 ~250-350 μm 크기의 사각형과 유사해야 합니다.
3. 오르가노이드의 생성
- 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)없이 30 mTESR 매질의 30 mTESR을 함유하는 단일 초저 부착 T75 플라스크내로 세포를 전달한다.
- 다음 날, 플라스크(들)를 기울여 코너에 있는 라이브 셀풀을 구하십시오(첫날에는 5-10분이 걸릴 수 있지만 클러스터가 커질수록 더 빨라집니다).
참고: 이 단계 또는 후속 단계에서 플라스크 의 바닥에 부착 된 많은 수의 세포가있는 경우 세포를 새 플라스크로 옮니다. 처음 이틀 동안 죽은 세포의 높은 인구를 가지고 정상입니다. 용지 변경을 수행할 때는 가능한 한 많은 세포 파편을 제거해야 합니다. - 일단 세포가 정착되면, 살아있는 세포를 포함하는 매체의 대략 10 mL를 떠나는 매체 및 죽은 세포를 흡인합니다.
- 낮은 bFGF 매체의 ~ 20 mL를 추가 (DMEM/F12 1 x N2로 보충, 1 x B27, 1 x L-글루타민, 1 x NEAA, 0.05% 소 혈 청 알부민 (BSA), 그리고 0.1 mM 모노티오 글리세롤 (MTG) 30 ng/mL bGF보충.
- 2일째에 세포를 확인합니다. 대부분의 세포가 건강하고 밝게 보이면 아무 것도 할 필요가 없습니다. 그러나 세포의 3분의 1 이상이 어둡게 나타나면 20 ng/mL bFGF로 보충된 낮은 bFGF 매체의 ~20 mL로 미디어(3.2단계에서와 동일한 틸팅 기법을 사용)로 교체합니다.
- 3일째에, 10 ng/mL bFGF로 보충된 20 mL의 낮은 bFGF 매체로(3.2단계에서 틸팅 기술을 사용하여) 미디어의 절반을 교체한다.
- 5일째에 배지의 절반을(3.2단계에서 틸팅 기술을 사용하여) 신경 유도 매체 20mL(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL 헤파린)로 교체합니다.
참고 : 다른 세포보다 훨씬 큰 세포 또는 오르가노이드의 큰 클러스터가있는 경우, 그들은 문화에서 제거해야합니다. 크기는 현미경의 밑에 외관에 의해 추정됩니다; 예를 들어, 레티클이 있는 접안 렌즈를 사용하십시오. 오르가노이드의 대다수는 유사하게 크기 (대략 100 ±20 μm)입니다. 우리는 다른 것 보다는 대략 2 x 더 작거나 더 큰 오르가노이드를 제거했습니다. - 격일로 중간 크기(~15mL)의 절반을 NIM으로 교체하십시오.
- 배양 3주 후, 100x 페니실린/스트렙토마이신을 배지에 추가합니다(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL 헤파린)을 원하는 경우 최종 농도에서 1x로 추가하십시오. 격일로 미디어를 새로 고칩니다.
참고 : 이 방식으로, 우리는 문화에서 최대 6 개월 동안 오르가노이드를 유지했습니다.
4. RNA 추출 및 준비
- 10 mL 파이펫을 사용하여 플라스크에서 약 15 개의 오르가노이드 (크기에 따라 다름)를 부드럽게 추출하고 1.5 mL 튜브에 넣습니다.
- 원심분리기(200 x g 1분)에 오르가노이드를 부드럽게 펠렛하고, 덜베코의 PBS(DPBS)를 3회 1회 헹구세요.
- 검증된 시스템 또는 프로토콜(예를 들어, RNeasy 키트)을 사용하여 RNA를 추출합니다.
- 260 및 280 nm에서 각 샘플의 광학 밀도 값을 측정합니다.
- 검증된 시스템 또는 프로토콜(예를 들어, iScript cDNA 합성 키트)을 사용하여 cDNA를 준비한다.
- 적어도 하나의 하우스키핑 유전자를 포함하여 미리 검증된 프라이머(표1)를사용하여 qRT-PCR을 수행한다.
5. 면역 화학
- 고정
- 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비하고 4°C에 놓습니다.
- 멸균 면도기를 사용하여 멸균 전사 파이펫의 팁을 잘라냅니다.
- 절단 전달 파이펫을 사용하여 오르가노이드를 부드럽게 추출하는데, 특히 커지면 쉽게 부서질 수 있으며, 추가 용지 또는 DPBS가 있는 6웰 플레이트에 넣습니다.
- 플레이트를 기울이고 용지를 흡인하고 1x DPBS로 교체합니다. 1x DPBS로 세포를 2회 더 헹구다.
- DPBS를 4% PFA 용액으로 교체하고 4°C의 셰이커에 놓습니다.
참고 : 2 일 동안 (작은 오르가노이드의 경우) 7 일 (오르가노이드 >3 개월), 짧은 시간 (예 : 16-24 시간)도 가능할 수 있습니다. - DPBS에서 30%, 20%, 10%의 자당 솔루션을 준비합니다.
- PFA에서 고정한 후, 10% 자당 용액으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.
- 10% 자당을 20% 자당으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.
- 20% 자당을 30% 자당으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.
- 냉동 단면
- 드라이 아이스의 평평한 층을 준비하고 그 위에 라벨플라스틱 금형을 배치합니다.
- 최적의 절삭 온도 매체 (OCT)의 얇은 층을 금형에 붓고 (몇 초 이내에) 경화하기 시작합니다.
- 팁이 잘린 전사 파이펫을 사용하여 금형의 OCT 상단에 몇 개의 오르가노이드를 놓고 오르가노이드의 위치에 주의를 기울이십시오.
- 곰팡이가 가득 차고 오르가노이드가 덮일 때까지 OCT에 천천히 추가하십시오. 10분 동안 완전히 굳어지게 하십시오.
참고: 10분 이상 동결하면 단면화에 여러 오르가노이드의 이상적인 상대적 배치를 보장하는 데 도움이 되지만, 에탄올 드라이 아이스 믹스 또는 액체 질소를 사용하여 더 빨리 동결할 수 있습니다. - 절단 시 쉽게 찾을 수 있도록 마커로 오르가노이드의 상대 위치를 표시합니다.
- 금형을 가방이나 상자에 넣고 단면을 잘라낼 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 저온 극저온을 사용하여 10 μm 섹션을 슬라이스하고 조직을 표지된 양전하 슬라이드에 놓습니다.
- 얼룩
- 차단 용액 (0.3 % 트리톤 X-100, PBS에서 4 % 일반 당나귀 혈청)을 준비하십시오.
- 소수성 pap 펜을 사용하여 조직의 둘레를 그립니다.
- 슬라이드를 PBS로 3회 5분 동안 헹구십시오.
- PBS를 실온에서 1시간 동안 차단 용액으로 교체하십시오.
- 차단 용액을 밤새 4 °C에서 항체 용액 (적절한 농도의 항체, 0.1 % 트리톤 X-100, PBS에서 4 % 정상 당나귀 혈청)으로 교체하십시오.
- 다음 날, 슬라이드를 PBS로 3회 10분 동안 세척합니다.
- PBS를 실온에서 1시간 동안 항체 용액으로 희석된 적절한 이차 항체(적절한 농도)로 대체합니다.
- 1x PBS로 매번 10분 동안 3회 헹구어 내보시기
- 4', 6-디아미디노-2-페니린돌(DAPI) 얼룩을 바르고 1x PBS로 10분동안 3회 헹구어주세요.
- 부착은 장착 용액으로 슬라이드 전면에 입술을 덮고, 어둠 속에서 실온에서 건조시키고, 4 °C에서 어둠 속에서 보관하십시오.
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Representative Results
그림 1은 프로토콜의 여러 단계에서 세포/오르가노이드가 어떻게 생겼는지 를 입증하기 위해 여러 시간 지점의 대표적인 브라이트필드 이미지를 보여줍니다. hESCs를 조직 배양 플레이트에서 제거하고, 작은 조각으로 나누어, 그들이 구체를 형성 하는 T75 초저 부착 플라스크에 배치. 세포는 이 클러스터의 중심에 있는 어둡고 죽어가는 세포 없이, 밝고 유사한 크기에서 보이는 것이 중요합니다. 세포는 점차 bFGF를 제거하였다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내 이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드는 시간이 지남에 따라 더 커지고 어두워지지만, 뇌 오르가노이드 발달과 확장 전반에 걸쳐 존재하는 신경 로제트 와 같은 구조 (검은 색 화살표)를 주의하는 것이 중요합니다. 로제트는 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경관의 특징을 포함하고, 상피 특성을 표시하고 정점루멘(15)을둘러싸고 있다.
5개월 동안 헤마톡신과 에오신을 함유한 오르가노이드의 염색은 센터에서도 막대한 양의 괴사가 없었던 것으로 나타났으며, 이는 정체된 배양 시스템을 감안할 때 초기에 우려되었던것이었다(도 2A). 이러한 오르가노이드는 숙련된 신경병리학자에 의한 가벼운 현미경 평가에 기초하여 인간 피질과 유사한 조직학적 형태를 입증하였다(그림2B). 조직학에 의해, 많은 독특한 세포 형태는 신경교애 (파란색 화살표 머리), 뉴런 (빨간 화살표 헤드), 카잘 - Retzius 형태 (검은 화살표)와 세포, 신경 필 (주황색 화살표 머리)(그림 2B, C)를닮은 관찰되었다.
세포 내의 유전자 발현을 좀 더 심층적으로 살펴보기 위해, qRT-PCR을 수행하였다. 그림 3에표시된 결과의 경우 각 막대는 지정된 시점에서 독립적으로 성장하고 수확된 셀의 3개의 개별 배치를 나타냅니다. 이들 샘플은 하우스키핑 유전자, GAPDH이외에 지시된 유전자에 프라이머 쌍을 가진 삼중항으로 실행하였다. 글루타메이트 수송기인 Vglut1(그림 3A)은2.5주에서 발현되었고, 5주에서 증가하였으며, 배양에서 5개월까지 일관되게 유지되었다. 전뇌 마커인 Foxg1(그림 3B)은배양5주까지 낮은 수준으로 발현하였다. 깊은 층 마커, Tbr1 (그림 3C),주위 피크 5 주 이후 감소, 반면 상층 마커, Satb2 (그림 3D),시간이 지남에 따라 증가.
복부 마커 Engrailed1 (Eng1)의발현(도 3E),뒷뇌 /척수 마커 Hoxb4 (도 3F),뿐만 아니라 올리고덴드로시테 마커, Olig2 (그림 3G),모두 시간이 지남에 따라 증가. 대조적으로, 줄기 세포 마커, Sox2 (그림 3H),시간이 지남에 따라 감소. 신경교 마커, FAP (그림 3I),5 주에 정점에 정점 및 이후 상대적으로 일정 한 남아. 또한, 면역형광 데이터는 qRT-PCR 데이터와 일치했다. 10 주에 Foxg1의 강력한 표현이 있었다(그림 4A). Sox2 발현은 심실 영역(SVZ)을 닮은 영역에 더 국한되었다(도4B,C). 흥미롭게도, 외부 방사형 신경교 세포 마커인 HopX(도 4D)의일부 발현이 있었다.
그림 1: 오르가노이드 성장 조건 및 형태학의 개요. (A)미디어 변경의 회로도. (B-M) 그들은 성숙으로 오르가노이드의 대표적인 이미지. (B-M) H9 hESCs(B)는뇌 오르가노이드를 형성하기 위해 이용되었다. 오가노이드는(C)2일째에 20 ng/mL bFGF 매체에,(D)3일째 및(E)4일째10 ng/mL bFGF 매체에 있다. (F-M) 5일(F),8(G),10(H),17(I)35(J,K)및 70(L,M)에신경 유도 매체 (NIM)에서 오르가노이드. 화살표는 신경 장미를 가리킵니다. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 오가노이드는 인간의 뇌 조직과 조직학적 유사성을 공유했습니다. 5 개월(A)에서오르가노이드의 H&E 염색은 인간의 피질(B)을닮은 일부 층상. 더 높은 배율에서 많은 세포 형태는 신경교신경(파란색 화살표 헤드), 뉴런(빨간 화살표헤드), 신경필(주황색 화살표 헤드), 카잘-레치우스 형태(검정 화살표)를 가진 세포를 포함하는관찰되었다(B,C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시간이 지남에 따라 뇌 오르가노이드 내의 신경 발달 유전자의 발현. Vglut1(A),Foxg1(B),Tbr1(C),Satb2(D),En1(E),Hoxb4(F),Olig2(G),Sox2(H)및 GFAP(I)의발현을 평가하는 SYBR 녹색을 이용한 정량적 RT-PCR 데이터. 오류 막대 = 평균 ± 표준 편차(n ≥ 3). 이 그림은16에서수정되었습니다. 프라이머 정보는 표 1을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 10 주에 뇌 오르가노이드 내의 신경 발달 단백질의 발현. 면역형광은 Foxg1(A)의 강력한발현, Sox2(B,C)의 국소 발현 및 HopX(D)의 존재를 밝혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 시퀀스(5' ~ 3') | 앰플리곤 (주) | 엑손 | |
| 엔1 | F | 가카아트가트가아 CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT GG타가 |
2 | ||
| 폭스 1 | F | 아가가악카그탁 가가와 |
188 | 1 |
| R | TGTGtGG가가트 TGGC |
1 | ||
| 갭DH | F | 아카트카트GCCAT Cac |
449 | 8 |
| R | 카카CTGTTGCTGT AGCC |
9 | ||
| GFAP | F | 가가가트CCGCGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAACTTGGAGCG Gta |
4월 5일 | ||
| 혹스b4 | F | AAGCCTCTG 카가타 주 |
80 | 2 |
| R | 아그그카가아가가가 게가 (것)가가 |
2 | ||
| 올리그 2 | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA Gcg |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTT가가 GACGC |
2 | ||
| Satb2 | F | 타카아가아가트GCCCT Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCGGCACTTGG Ttg |
7 | ||
| 삭스2 | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCCCCATTTCTCTCGT Ttt |
1 | ||
| Tbr1 | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | 아카GCCGGT그타가트CG 안내 |
6 | ||
| 브글루트1 | F | 카가트트CGGCTG CTATTG |
183 | 4월 5일 |
| R | GCGACTCCGTTCTTTAAGG GTG |
6 |
표 1: 그림 3에서 정량적 RT-PCR에 사용되는 프라이머 서열.
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Discussion
다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, 이것은 몇 가지 주의 사항이 있는 인공 시스템입니다. 전반적인 발현 수준 면에서 배치 변형에 대한 배치는 거의 없었지만 개별 오르가노이드는 차이를 보였습니다. 예를 들어, Sox-2 양성 영역의 위치는 모든 오르가노이드에서 동일하지않았다(그림 3). qPCR은 세포의 배치에 있는 전반적인 변경을 찾아내기 적당하는 동안, 단세포 RNAseq와 같은 추가 기술은 세포에 기초에 더 많은 정보를 모으기 위하여 미래 연구 결과에서 이용될 것입니다. 이 시스템의 또 다른 한계는, 보다 최근의 연구들 중 일부에서 행해진 바와 같이 오르가노이드 내에 혈관구조가 통합되지 않는다는 것이다17,18,19. 그러나, 낮은 산소 환경에서 높은 산소 환경으로 hESCs를 전환하는 것은 더 밀접하게 개발 배아에서 호기성 전이에 혐기성 유사 할 수있다.
이 프로토콜 내의 중요한 단계는 신경구의 형성뿐 아니라 과밀없이 성장하는 오르가노이드에 건강한 세포와 적절한 영양소를 보장하기 위해 적절한 배양 배지와의 미디어 변화를 포함한 적절한 유지 보수입니다. . 부적절한 세포 증식 또는 분화를 해결하려면 저계ES및 보충제를 포함한 신선하게 준비된 매체의 신선한 배치로 시작하는 것이 좋습니다. 경우에 따라 시약 및 재료의 배치 변형이 있을 수 있습니다. 따라서 합리적인 시간 내에 활용할 수 있는 한 동일한 부지에서 온 N2 및 초저 부착 플라스크와 같은 여러 병의 시약을 구입하는 것이 좋습니다.
다른 많은 뇌 오르가노이드 프로토콜과는 달리,이 방법은 생물 반응기를 사용하지 않습니다. 대신 세포는 미디어 변경 을 제외하고 상대적으로 정체된 상태를 유지합니다. 이것은 결국 2D 신경 배양20을만들기 위하여 떨어져 나간 신경구를 가진 이전 일과 유사합니다. 이 모형에서 세포는 3D 형식으로 유지되고 배양에서 최대 6 달 동안 증가할 수 있었습니다. 단일 세포를 집약하는 대신 작은 클러스터를 활용할 때 오르가노이드가 더 밝게 보였으며, 이는 우리가 덜 괴사로 해석되었다는 것을 발견했습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 뇌 유기성 클러스터가 조직학 및 면역형광에 의해 5개월에 평가되었을 때, 괴사16의명백한 영역은 없었다. 세포의 작은 클러스터에서 시작 하더라도 형성 된 오르가노이드의 크기에 약간의 다양성을 소개, 오르가노이드의 대부분은 대략 비슷한 크기의.
이종 지하 멤브레인 매트릭스와 생물 반응기의 사용은 장점과 단점을 모두 갖는다. 특정 세포 유형, 또는 더 큰 뇌 오르가노이드는 한 조건 또는 다른 에서 성장을 선호 할 수 있습니다. 지하 멤브레인 매트릭스 또는 기타 하이드로겔은 특정 영역에 성장 계수를 선택적으로 추가하거나 특정 금형을 만드는 데 도움이 될 수 있습니다. 지하막 행렬은 3차원 조직 및분화(15)를지원하는 것으로 나타났지만, 이들 제품 중 일부는 성장인자(12)의양을 포함하는 불규칙하게 정의되고 가변적인 조성을 갖는다는 점을 강조할 필요가 있다. 뇌 오르가노이드를 배양하는 동안 워크플로우를 단순화하는 것 외에도 지하 막 매트릭스가 없으면 3차원 이미징 기술이 향상될 수 있습니다.
이 두뇌 오르가노이드 모형 시스템의 발달은 많은 잠재적인 신청을 위한 새로운 접근을 제안합니다. 예를 들어, 저 산소 증 같은 독성 모욕, 고 혈당, hypercapnia, 그리고 다른 사람의 사이에서 감염, 이 시스템으로 테스트 될 수 있습니다. 또한, 신경 발달 장애는 유전자 변형 줄기 세포 또는 환자 특이적 인간 유도 만능 줄기 세포 (hPSCs)로 시작하여이 시스템으로 연구 될 수있다. 오르가노이드 문화 도중 다른 세포 모형을 추가하는 기능은 또한 종양 두뇌 상호 작용을 공부하는 가능성을 제안합니다. 프로토콜의 단순성과 고가의 특수 재료의 부족을 감안할 때 우리는이 접근 법이 급속하게 발전하기 위해 자신의 독특한 이점을 가진 하나의 잠재적 인 방법으로 필드 안팎의 실험실에 의해 고려 될 수 있기를 바랍니다 진보하고 흥미 진진한 훈련.
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Disclosures
S.G.K.는 Dansar IT 및 Gene-in-Cell의 SAB 멤버입니다.
Acknowledgments
예일 줄기세포 코어(YSCC)와 예일암센터(YCC)에 도움을 주셔서 감사합니다. 그의 신경병리학 적 검토에 대한 김정박사에게 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 재생 의학 연구 기금에 의해 지원되었다, Dimes의 행진, NHLBI R01HL131793 (S.G.), 예일 암 센터와 예일 암 생물학 교육 프로그램 NCI CA193200 (E.B.) 조셉과 루실 매드리.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
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