Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60401
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

Эта статья описывает метод трансплантации для того чтобы трансплантат аренить донора крысы эпителиальные клетки в interscapular белый тучная пусковая площадка животных реципиента. Этот метод может быть использован для изучения воздействия принимающей и/или донорской помощи на развитие эпителия молочной железы и устраняет необходимость предварительной очистки, тем самым расширяя полезность этого метода.

Abstract

Уже в 1970-х годах исследователи успешно пересадили эпителиальные клетки молочной железы в межскапулярную белую жировую подушечку крыс. Прививка эпителия с использованием методов трансплантации использует гормональную среду, предоставляемую хозяином грызунов-подростков. Эти исследования идеально подходят для изучения влияния различных биологических манипуляций на развитие молочной железы и вскрыть многие аспекты биологии молочной железы. Общей, но ограничивающей особенностью является то, что пересаженные эпителиальные клетки находятся под сильным влиянием окружающей стромы и перебора с эндогенным эпителием; для использования родной ткани молочной железы, брюшной-ингуинального белого жира площадку должны быть очищены, чтобы удалить хост эпителия молочной железы до трансплантации. Основным препятствием при использовании крысмодели организма является то, что очистка развивающихся молочных деревьев в пост-отлуженных крыс не является эффективным. При пересадке в железо-свободных жировых прокладок, донорэпилические клетки могут заселить очищенный хозяин жира площадку и образуют функциональную железу. Межлопатулярный жир площадку является альтернативным местом для этих трансплантатов. Основным преимуществом является то, что он не хватает протоковых структур еще обеспечивает нормальную стромы, что необходимо для содействия эпителиального роста и легко доступны в крысы. Еще одним важным преимуществом этого метода является то, что он является минимально инвазивным, потому что он устраняет необходимость приживать и удалить растущее эндогенное дерево молочной железы. Кроме того, межлопатулярный жир колодки содержит медиальный кровеносный сосуд, который может быть использован для отдельных сайтов для прививки. Поскольку эндогенные железы остаются нетронутыми, этот метод также может быть использован для исследований, сравнивая эндогенную маммарию железу с пересаженной железой. В этой статье описывается метод пересадки эпителиальной клетки молочной железы в межлопатулярную белую жировую подушечку крыс.

Introduction

Послеродовой развития молочной железы и трансконал морфогенеза процессы в значительной степени зависит от гормональной сигнализации в начале полового созревания. У мышей и крыс, широко используемых модельных организмов биологии молочной железы, этот процесс начинается около 3 недель возраста, где быстрое распространение и дифференциация приводят к образованию зрелой паренхимы. Зрелая железа может пройти многочисленные раунды расширения и инволюции, имущество, которое было под следствием с начала20-го века. В контексте гиперраспространения и развития рака, методы трансплантации молочной железы были разработаны в 1950-х годах1, и усиливается количественной методологии способствовали Гулд и др. в 1977году 2,3,4. Уточнение метода трансплантации у грызунов способствовало крупным достижениям в понимании нормальной биологии молочных желез, которые до сих пор широко используются для изучения влияния различных методов лечения и генетических манипуляций на нормальное развитие молочной железы и состояния болезней.

Многие гипотезы были созданы и впоследствии протестированы с помощью трансплантации молочной железы, впервые описанной DeOme et al. в 1959году 1. Эксперименты в течение нескольких десятилетий показали склонность протоковой ткани, вырезанной из донорских молочных желез, чтобы заселить весь жир площадку5,6,7 и указали, что важнейший компонент развития молочной железы находится в этих эпителиальных структур. Более поздние исследования на мышах показали, что одна клещевая клетка может заселить очищенную жировую подушечку и способствовала открытию одного, общего прародителя базальных и светящихся молочных эпителиальных клеток8,9,10. В соответствии с этими выводами, было высказано предположение, что трансплантация увеличивает пул клеток с многолинейным потенциалом перенаселения в результате пластичности, что позволяет привитых клеток расти функциональной молочной железы7,10,11,12,13. Важно отметить, что использование методов трансплантации у грызунов преодолевает ограничения клеточной культуры индуцированных аномалий14 и часто дает результаты всего за несколько недель.

Хотя процедура была первоначально описана в контексте предопластических поражений у мышей, вскоре она была расширена до крыс и используется в сочетании с канцерогеном лечения установить множественность как мера восприимчивости к раку15, но популярность методов трансплантации последовала развитие генетических инструментов для каждого вида. Хотя исследования мыши, включающие трансплантацию, способствовали многим трансляционным выводам, паренхима крысиной молочной железы напоминает человека более близко16,17 и предлагает четкие преимущества для изучения эстрогена рецептор-положительный (ЭРЗ) рак молочной железы. Опухоли молочной железы являются индуцируемыми у обоих видов, но они отличаются с точки зрения чувствительности гормонов и профилей экспрессии генов. Основное отличие заключается в том, что крысиные опухоли молочной железы выражают и зависят от функции рецепторов гормона яичника и гипофиза, а именно эстрогена и прогестерона (PR), подобно подтипу светящегося а рака молочной железы человека. Действительно, трансплантация эпителиальной клетки молочной железы, как описано в этом протоколе, была использована для изучения генетических вариантов, участвующих в раке молочной железы и определить клеточную автономию воздействия на эпителиальные клетки молочной железы18.

В дополнение к биологии опухоли, протоковой эпителий нормальной крысиной молочной железы экспонатов более высокий уровень ветвления и в окружении толще слой стромы, чем мышь. Важность стромы хорошо документирована в исследованиях эпителиальной трансплантации молочной железы. Маммарийский эпителий должен взаимодействовать с жировой стромы, а в идеале и собственным мезенхимом, чтобы пройти свой характерный морфогенез19,20. Прививка ткани в реципиентную маммарийскую железу обеспечивает оптимальную среду; однако наличие эндогенного эпителия может повлиять на результаты. Предварительная очистка молочной железы эндогенного эпителия обычно выполняется в анализе трансплантации мыши и требует хирургического иссечения эндогенной ткани молочной железы и/или удаления соска1,21,22. Хотя это возможно, preclearing эпителия молочной железы в после отлохоты крыс не так широко выполняется, в основном из-за неэффективности очистки растущего молочного дерева в после отлохоты крыс. Так как было показано, что регионы жировой ткани в других частях тела может поддерживать рост пересаженного эпителия молочной железы21,23,24, процесс предварительного очищения можно легко избежать у крыс путем прививки ткани в interscapular белый жир площадку.

Метод трансплантации, описанный в настоящей работе, включает в себя инъекцию ферментативно диссоциированных органоидов молочных желез (фрагменты молочного протокового эпителия и других типов клеток, способных к морфогенезу) или монодисперсированных клеток в межпросветительную жировую площадку в инбредных, изогенных или конгенических штаммах лабораторных крыс2. Поскольку межсезонная жировая подушечка, как правило, лишена молочной ткани, она обеспечивает подходящую среду для нескольких мест трансплантации без необходимости предварительного очищенного эндогенного эпителия. В результате эндогенные, брюшно-ингиналовые молочные железы животного не подвергаются хирургическим манипуляциям, развиваются нормально и не могут вмешиваться в интерпретацию результатов. Кроме того, нетронутые молочные железы могут быть использованы для сравнения для оценки принимающей против донорского воздействия на развитие эпителия молочной железы и опухоли18,25. Хотя перенаселение молочной железы из одной стволовой клетки доступна для мышей, она еще не была разработана для крыс, в основном из-за отсутствия антител, чтобы выбрать для крыс ы молочных стволовых клеток25,26,27. Несмотря на это, трансплантация монодисперсных эпителиальных клеток молочной железы для количественной оценки потенциала перенаселенности может быть успешно выполнена, и эти клетки будут развиваться нормально, когда привиты в соответствующие рамки2,3,4. В то время как органоиды хороши для многих целей, монодисперсные клетки необходимы для количественного применения, например, для определения количества эпителиальных клеток молочной железы, необходимых для инициирования рака после ионизирующей лучевой терапии28 или для сравнения характеристик потока цитометрически выбранных популяций эпителиальных клеток29.

На сегодняшний день описанная здесь процедура является наиболее надежным методом проведения трансплантации молочной железы у крысы с общей целью изучения развития молочной железы и механизмов, лежащих в основе развития рака молочной железы. Часто доноры и/или животные-реципиенты подвергаются воздействию различных переменных до, во время или после эпителиальной трансплантации. Примеры включают в себя один ген исследования с участием химического канцерогенеза30, излучение28,31,32, генетические манипуляции хозяина / донора генома18, и гормональные манипуляции12. Основным преимуществом ферментативной диссоциации, описанной в этом протоколе, является возможность изолировать эпителиальные органоиды или монодисперсные клетки для дополнительных экспериментов с участием цитометрии потока, трехмерной культуры, редактирования генов и многое другое. Будущие применения этого метода будут включать дополнительные манипуляции донорской и/или принимающей ткани с помощью генной инженерии. Например, донорские клетки могут быть генетически изменены ex vivo в любом выбранном геномном локусе с помощью системы редактирования генов CRISPR-Cas9. Аналогичным образом, крысы-реципиенты также могут быть генетически изменены для изучения взаимодействия между донором и реципиентом инженерных генетических факторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные были размещены и содержаться в AAALAC утвержденных объекта, и эксперименты, описанные в этом протоколе были одобрены MUSC институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Для использования в взаимной трансплантации животных должен быть инбредный или изогенный штамм, с конгенгенным статусом предпочтительным или перекрещенным в течение по крайней мере 6 поколений.

1. Сбор донора крысы молочной железы эпителия

  1. Определить количество крыс-доноров, необходимых для трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 1 крыса-донор (4 недели) может обеспечить достаточное количество клеток для трансплантации в 4 животных-реципиентов. Некоторые приложения этого протокола потребуют дополнительного количества ячеек, и могут быть различия в общей урожайности.
  2. Этикетка все материалы и обеспечить доступное размещение для хирурга (Таблица 1).
  3. Запись массы тела каждой женщины-донора крысы. Следуйте институциональным руководящим принципам, чтобы полностью обезощивать или усыпствовать крысы-донора. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
  4. Переместите животное в стерильное хирургическое поле. Поместите животное на спину и распылите всю брюшную поверхность с 70% этанола.
  5. Сделайте сагитальный, Х-образный разрез, позволяющий получить доступ к грудной, брюшной и пытковые молочные железы. Вскрыть все ткани молочной железы от донорской крысы с помощью ножниц(Рисунок 1). Удалите все видимые лимфатические узлы.
  6. Извлеките ткань молочной железы с помощью щипков и поместите в маркированное 60-мм блюдо на льду. Добавьте в тарелку с 60 мм 500 л без сыворотки DMEM/F12. Отрегулируйте размещение ткани молочной железы, чтобы она оставалась полностью мокрой.
  7. Мелко фарш молочной ткани с помощью ножниц. Для этого разрежьте ткань на кусочки размером 1-2мм (рисунок 1С). Держите железу на льду до тех пор, пока не будет собрана вся донорская ткань (не превысит 60 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный персонал может фарш молочных желез и дополнительно подготовить коллагеназный раствор в то время как хирург продолжает ткани извлечения.

2. Извлекайте ткани мозга из эвтаназии доноров

  1. Тщательно переверните тело донора, чтобы поместить его в положение склонного. Безопасный с булавками. Спрей головы и верхней части спины с 70% этанола.
  2. Найдите основание черепа и сделайте разрез под затылочными кондиалами. Вставьте острые ножницы под кожу и отрежьте кожу от черепа, включая стороны головы.
  3. Используйте костные резцы или сильные ножницы, чтобы сократить череп вдоль средней линии, от затылочной до лобной кости. Держите лезвие как можно более поверхностным и угол вверх, чтобы предотвратить разрушение основной ткани мозга.
  4. Очистите кость с помощью rongeurs или сильные щипцы. Вставьте инструмент боковой к мозжечке, чтобы сломать кость с обеих сторон, подвергая костной слуховой канал. Разорвать связи с обезвражеражает.
  5. Аккуратно поднимите мозг изогнутыми, тонкими щипками. Поместите мозг на кусок фольги и запишите вес, а затем сразу же перенесите на трубку 15 мл с равным количеством (w:v) носителей, хранящихся на льду.
    1. Дополнительно, используйте тонкой кончик щипцы для удаления гипофиза (расположен под мозгом) для дополнительного использования в процедуре трансплантации, если это необходимо.
  6. Используйте механический гомогенизатор, чтобы нарушить ткани. Гомогенизировать мозг в течение 10-15 с на низкой скорости. Пусть смесь сидеть на льду, по крайней мере 1 мин, а затем гомогенизации снова. Гомогенизации достаточно, когда конечная смесь не состоит из больших частей.
  7. Фильтр гомената, проходя его через фильтр 100 мкм. Держите фильтрат на льду до использования (менее 4 ч).

3. Пищеварение и обработка экстрактов молочной железы

  1. Оттепель или теплые реагенты, как указано(таблица 1). Следуйте соответствующим шагам для восстановления органоидов или монодисперсных клеток.
  2. Приготовьте 10 мл безсыворотки пищеварения (без коллагеназа) для каждого донорского животного(Дополнительный файл 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем используемых носителей пищеварения может быть скорректирован (масштабируется вверх или вниз) для размещения сгруппированной ткани, если это применимо.
    1. Для органоидов пропустить до 3,3.
    2. Для монодисперсированных клеток, подготовить свежие Монодисперсионные Mixture и инактивации решение (Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3) в дополнение к сыворотке свободной коллагеназа пищеварения средств. Приступай к шагу 3.3.
  3. Когда все ткани молочной железы от доноров был извлечен и фарш, добавить фермент коллагеназа к теплой (или комнатной температуры) пищеварения средств(Дополнительный файл 1). Смешайте путем инвертирования.
  4. Передайте коллагенеза пищеварения через фильтр 20 мкм. Распределите 10 мл фильтрованных носителей в маркированных трубках 50 мл для пищеварения.
  5. Используйте новый наконечник пипетки мощностью 1000 л для каждого образца и перенесите измельченные донорскую ткани из каждой 60-мм тарелки в трубку пищеварения коллагеназа. Отрежьте 1 см от конца наконечника 1000 л и вручную поместите его на устройство перед использованием. Аккуратно перемешайте измельченные ткани, повысив вверх и вниз 1-2 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань трудно пипетка во время передачи, используйте небольшое количество коллагеназа пищеварения средств пищеварения из 50 мл трубки, а затем передать его обратно.
  6. Поместите образцы в горизонтальное положение в встряхиваемом инкубаторе и дайте образцам переварить 1,5-2 ч при 37 градусах По цельсии, 200-220 об/мин.
    1. Для органоидов пропустить до 3,7.
    2. Для монодисперсированных клеток добавить DNase I (0,2 мкг/мл) в смесь в течение последних 10 минут пищеварения. Инкубировать, как и прежде, с энергичной тряски. Приступай к шагу 3.7.
  7. Когда ткань полностью усваивается, гранулы подвески с помощью холодной центрифугации (4 кВ) в течение 10 мин при 1200 х г (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки на льду между каждым шагом, чтобы увеличить жизнеспособность клеток.
  8. Убедитесь, что гранулы образовались, а затем осторожно слить супернатант и жировой слой. Аккуратно приостановите гранулы в 10 мл свежих носителей DMEM/F12.
  9. Кратко спина на 68 х г примерно 10 с. Длина спина (но не скорость) может быть увеличена, если нет четкого разделения клеток. Визуально осмотреть гранулы перед началом(Рисунок 1D).
  10. Аккуратно удалите супернатант, оставив после себя небольшой объем. Переходке к следующему шагу, основанному на том, нужны ли органоиды или монодисперсные клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ Важно оставить небольшой объем носителей в трубке, потому что гранулы будут очень свободно. Остаточный объем носителей будет разбавлен через шаги мытья.
    1. Для органоидов добавьте еще 10 мл объема DMEM/F12 media и повторите стирки/спин. После второй стирки, resuspend клетки в меньшем объеме (1-2 мл) DMEM / F12 средств для фильтрации. Приступай к шагу 3.11.
    2. Для монодисперсированных клеток растворите в 2 мл предварительно разогретого HBSS с 0,025% (w/v) трипсином и 6,8 мм EDTA. Дайджест в течение 3-5 мин при 37 градусах Цельсия. Немедленно инактивируйтесь.
      1. Добавьте 4 мл DMEM/F12 с 10% FBS, чтобы остановить инактивировать трипсин.
      2. Спин клетки на 270 х г в течение 5 минут, а затем повторно в DMEM / F12 с 10% FBS снова. Приступить к шагу 3.11 для фильтрации ячеек.
  11. Фильтр клетки с помощью 40 мкм ячейки ситечко помещается в новой трубке 50 мл. Предварительно промокните ситечко путем pipetting 1 мл той же базовой среды, используемой для приостановки клеток, а затем передать подвески клетки через фильтр с помощью пипетки для сбора протоковых фрагментов / органоидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительный выход фильтрованного эпителия из ткани молочной железы одной, 4-недельной донорской крысы составляет 1 х 106 клеток.
    1. Для органоидов отбросьте фильтррат. Маммарийские органоиды останутся внутри корзины клеточного ситечко и меньше, нежелательные клетки будут устранены. Переворачивайте клеточный ситечко над новой трубкой 50 мл и промыть любым объемом, необходимым для сбора клеток. Приступай к шагу 3.12.
    2. Для монодисперсированных клеток, отбросить ситечко клетки и сохранить фильтр, потому что молочные эпителиальные клетки будут проходить через фильтр, наряду с меньшими стромальных и иммунных клеток. Промыть трубку, которая была использована для пищеварения / центрифугирования с другим объемом DMEM / F12 с 10% FBS и пройти через тот же ситечко клетки. Пеллети монодисперсированные клетки центрифугированием при 1200 х г в течение 5 мин. Приступить к шагу 3.12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переосляные ячейки готовы к последующему применению.
  12. Импульс спина раствора и обеспечить образование клеточной гранулы, прежде чем перейти к следующему шагу. Импульс спина снова, если это необходимо.
  13. Аккуратно удалите супернатант. Приостановите пеллетку в небольшом объеме (1000-2000 л DMEM/F12), чтобы сконцентрировать клетки для подсчета.
  14. Подсчитайте клетки и разбавьте при необходимости. Повторное увеличение желаемого количества клеток для трансплантации в 20 ЗЛ средств DMEM/F12 для каждого животного. Всегда держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Донорская клетка рассчитывает в диапазоне 1 х 105 - 1 х 106 клеток будет необходимо для каждого места трансплантата на основе конечной точки исследования. Например, эксперименты по канцерогенезу часто требуют большего количества пересаженных клеток, по сравнению с другими приложениями. Количество клеток, необходимых должны быть экспериментально определены для каждого штамма. Процедура, описанная в этом протоколе, использовала 250 000 донорских клеток в 20 медиа-на сайте пересадки, до смешивания с гоменатом мозга, как описано в шаге 3.16.
  15. Подготовьте любой aliquot (ы) клеток, необходимых для других экспериментов (например, изоляция FACS3,26,27,30,33).
    1. Для органоидов, перейти к шагу 3.16.
    2. Для монодисперсированных клеток, количественно жизнеспособных клеток с помощью трипан или метилен синий окрашивания, а затем продолжить.
  16. Подготовьте единичные партии донорского материала для всех реципиентов трансплантации. Объедините равные объемы клеточной суспензии (20 кЛ) с 50% гоменатом мозга (20 л) для каждого участка трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 40 л л на участок будет вводиться на каждом сайте, но рекомендуется включить не менее 25% дополнительный объем для отходов.
  17. Немедленно приступаем к трансплантации или замораживание клеток для трансплантации позже (потенциальная остановка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные клетки не были протестированы с этим протоколом и потребует оптимизации до создания когорты животных для трансплантации экспериментов. Настоятельно рекомендуется пересадить свежие клетки.

4. Процедура трансплантации (крысы-реципиенты 4-5 недель)

  1. Взвесьте каждого реципиента крысы и рассчитать правильную дозу утвержденного анальгетика, который будет использоваться в процедуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вес тела может быть измерен до 24 ч до процедуры. Следуйте институциональным руководящим принципам, чтобы сдержать или кратко обезобезожнести каждое животное в течение всего срока бритья.
  2. Бритье хирургической области на каждом животном с помощью электрических клиперов. Определите основание черепа и начало позвоночную колонку. Приблизительно одна треть пути вниз по позвоночнику, брить 3 см х 2 см области на верхней грудной части спины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье также может быть выполнено под наркозом в день трансплантации, но должно быть выполнено за пределами стерильного поля. Верните крысу в родную клетку, пока это не понадобится.
  3. Найдите все материалы, необходимые для трансплантации(Таблица 1).
  4. Оцените систему анестезии животных перед использованием. Доверчивую любые жидкости и замените любые баки или части, которые необходимы. Убедитесь, что газовая линия в анестезиоционную камеру открыта и все периферийные линии закрыты, чтобы изофруранная анестезия и кислород могли свободно поступать к животному, как только оно помещается в камеру.
  5. Теплые грелки для поддержки температуры тела животных-получателей.
  6. Создайте стерильное поле, которое будет использоваться для хирургии. Организуйте поставки, как описано в таблице 1.
  7. Администрирование предоперационного анальгетика крыс-реципиентов, как указано в одобренном организацией протоколе по уходу за животными.
  8. Промыть шприцы Гамильтона со стерильными DMEM/F12 носителей, чтобы предотвратить потерю клеток. Убедитесь, что игла крепится к телу шприца, вставьте иглу в жидкость и отодвинете поршень. Заполните максимальный объем. Нажмите поршень вниз и изгнать содержимое в трубку для сбора отходов. Повторите 3-5 раз.
  9. Загрузите весь объем донорского материала (подготовленного в шаге 3.16) в отдельный шприц для каждого состояния (например, контроль, лечение, дикий тип, нокаут и т.д.). Вставьте кончик иглы в жидкость, отодвините поршень и держите иглу под поверхностью смеси, так как объем в трубке уменьшается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите не менее 10% дополнительного объема в каждый шприц. Не распоряжайтесь оставшейся смесью, закрывайте трубку и держите ее на льду в случае необходимости большего.
  10. Перевернуть шприц после того, как он полностью загружен и нажмите поршень немного, чтобы удалить пузырьки воздуха на кончике иглы. Переходке к следующему шагу, когда все будет подготовлено.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик иглы никогда не касается любой другой поверхности, даже в стерильной области. Полезно отдохнуть тело шприца над небольшой контейнер льда для содействия жизнеспособности клеток.
  11. Поместите животное-получатель в наркоз нуючку и включите машину.
  12. Когда животное полностью расслабляется (не реагирует на постукивание или нежное движение камеры), направьте анестезию на носовой конус и перенеси животное в стерильное поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расширенная продолжительность анестезии не очень хорошо переносится крысами. Завершите процедуру для каждого животного за 10 минут или меньше.
  13. Поместите животное в лежачем положении (на животе), чтобы затылок и верхний позвоночник были доступны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте адекватную тепловую поддержку животного все время и регулярно оценивайте глубину анестезии с помощью твердой щепотки ног.
  14. Дополнительно, применять офтальмологические ветеринарной мази для предотвращения высыхания глаз.
  15. Очистите свежевыбритую область, чтобы удалить лишние волосы. Используйте круговое движение и применять 70% этанола (или другой реагент, в институциональных руководящих принципов) на кожу, а затем антисептик (например, йод), и повторить. Поместите полотенце драпировка над животным, так что только область для бритой области подвергается.
  16. Убедитесь, что животное остается нереагирующим на глубокие раздражители с твердой щепоткой, а затем перейти к следующему шагу.
  17. Сделайте небольшой (2 см) межкапулярный разрез с помощью резкого хирургического лезвия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен быть поверхностным, так как жирная подушечка расположена прямо под кожей.
  18. Найдите медиальное кровеносное сосуд для ориентации(рисунок 2B).
  19. Поднимите кожу на одной стороне разреза с помощью щипков и удерживайте ее от жирной площадки во время трансплантации(рисунок 2B). Вставьте иглу в место пересадки.
    1. Дополнительно, переместить кончик иглы внутри ткани и создать небольшой карман для сбора клеток. Используйте небольшое повторяющееся движение. Не удаляйте иглу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг рекомендуется для начинающих пользователей протокола. Используйте крайнюю осторожность при создании кармана, так как межлопатулярная жировая ткань прокладки очень деликатна.
  20. Тщательно введите 40 л клеточной смеси в межлопатулярную жировую ткань. Удалите иглу медленно.
  21. Держите ткани на месте и позволить пересаженные клетки, чтобы согласиться на 3-5 s. Используйте дополнительную пару щипцы, если это необходимо.
  22. Снимите иглу. Повторите процедуру инъекции (шаги 4.18-4.21) на втором месте трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий из одной группы доноров могут быть введены в ту же сторону жира колодки в каждом животном, или чередующихся сторон для предотвращения пакетных эффектов от рук доминирования хирурга.
  23. Закройте хирургическую рану с помощью рановых зажимов или швов, а затем прекратите анестезию.
  24. Обеспечить послеоперационный анальгетик, как указано в утвержденных организацией протоколе.
  25. Немедленно перемещайте животное в клетку восстановления с тепловой поддержкой. Монитор для признаков бедствия, таких как кровотечение из разреза или проблемы с дыханием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно полностью восстановиться в течение 5-10 мин. Обратитесь к институциональным руководящим принципам для возвращения животных в колонию и послеоперационного мониторинга после процедур выживания.
  26. Дополнительно, выполнять исследования канцерогенеза на месте трансплантата (ы) путем введения канцерогенов для крыс-реципиента 3-4 недель после трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, крысиный карцерогенез проводится с использованием химической канцерогенной обработки в возрасте 50-57 дней. Это лечение диктует возраст операции по пересадке (которая должна быть сделана между 29-36 дней), чтобы дать достаточно времени для привитых клеток, чтобы инициировать рост молочной железы.

5. Оценка эпителиального роста

  1. Мониторинг эструс цикла крыс через ежедневный вагинальный лаваж и изучить цитологии на слайде микроскопа. Начало за 8-12 дней до конечной точки исследования. Пожертвовать всех крыс в одной стадии. Это необязательный шаг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл крысэструса составляет 4-5 дней. Разрешение животному пройти через 1-2 полных циклов облегчит интерпретацию, так как слайды из предыдущих циклов могут быть использованы для сравнения.
  2. Пожертвование трансплантации крыс 6-8 недель после трансплантации, в институциональных руководящих принципов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост обычно обнаруживается через 3-6 недель после трансплантации, но может потребоваться дополнительное время.
  3. Поместите животное в лежачее положение и очистить тело с 70% этанола. Поднимите кожу с щипками и сделать разрез вдоль позвоночного столба, чтобы разоблачить interscapular жира площадку. Вскрыть кожу от ткани, так что большинство жира колодки видно.
  4. Определите медиальный кровеносный сосуд, отделяет места трансплантата в межкапулярной жировой площадке. Акциз всей площадки в качестве одного куска ткани или вырезать вдоль кровеносных сосудов и удалить стороны индивидуально.
  5. Поместите ткань на положительно заряженный микроскоп слайд для всего крепления. Используйте 2 пары тупых щипц и аккуратно распределите ткань, чтобы восстановить ее оригинальную конформацию на слайде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса молочные ткани является чрезвычайно деликатным. Края ткани могут скручиваться под собой. Всегда ручка с осторожностью и удерживайте на месте, пока ткань не прилипает к слайду (несколько секунд).
  6. Цельное крепление по крайней мере одного из эндогенных брюшно-ингинальных молочных желез (с лимфатическими узлами для ориентации) для сравнения.
  7. Поместите слайды в 70% этанола в течение 7-10 дней, чтобы обезвредить ткани. Пополнить этанол так часто, как это необходимо для обеспечения ткани не высыхает.
  8. Подготовка квасцов-кармин пятно и обработки слайдов, когда ткань достаточно непрозрачной. Разрешить пятно, чтобы остыть перед использованием (Дополнительный файл 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пятно может быть подготовлено до одного дня до фиксации и регидратации шаги. Раствор может храниться при 4 градусах Цельсия и имеет ограниченный потенциал для повторного использования.
  9. Исправить ткани, поместив слайды в 25% ледниковой уксусной кислоты : 75% этанола в течение 60 мин.
    1. Увлажнять ткани через серию из 3 стирок в серии снижения концентрации этанола: 70% этанола в течение 15 мин, 50% этанола в течение 5 мин и dH2O в течение 5 мин.
  10. Пятно с квасцов кармина в течение 4-8 дней. Проверьте задней части слайдов каждый день, чтобы определить, если пятно полностью проникли ткани. Переходке к следующему шагу, когда окрашивание завершено.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание завершено, когда толстые части железы имеют фиолетовый оттенок и больше не появляются белые.
  11. Дестазировать и обезвоживать ткани путем передачи слайдов через серию увеличения концентрации этанола: 70% этанола в течение 30 мин, 95% этанола в течение 30 мин и 100% этанола в течение 30 мин.
  12. Поместите обезвоженые горки в ксилен в течение 3 дней, чтобы очистить ткани. Передача на минеральное масло для длительного хранения.
  13. После того, как слайды очищаются, используйте маломощную световую микроскопию или цифровую фотографию высокого разрешения для получения изображений слайдов для анализа. Убедитесь, что параметры приобретения изображения согласованы для всех слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальный рост должен быть четко различимы.
  14. Относитесь к присутствию нароста как к двоичному результату.
  15. Рассчитайте среднее количество пересаженных эпителиальных клеток, которые произвели рост молочной железы No1 в 50% мест трансплантации с использованием приобретенных изображений. Количественная оценка других физических особенностей, по мере необходимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Донор и реципиент молочных желез
Шаги по изоляции и подготовке эпителиальных клеток крысы для трансплантации показаны на рисунке 1A. В 4 недель, эндогенной молочной железы донорской крысы начал созревание и эпителий может быть визуализирована на целом установленные слайды окрашенных квасцов кармин(Рисунок 1B). Одна донорская крыса в этом возрасте обеспечит примерно 1 х 106 клеток для трансплантации. Если количество собранной донорской ткани или последующего измельчения недостаточно, урожайность клеток после коллагенеза пищеварения может быть низкой. Таким образом, важно собрать как можно больше ткани молочной железы, как это возможно от доноров. Полностью переваренные ткани молочной железы должны иметь жирный вид, без видимых частей ткани в подвеске(Рисунок 1C). Полное переваривание ткани молочной железы от одного донора должно привести к образованию видимой гранулы, которая содержит молочные органоиды, как показано на рисунке (Рисунок 1D). Если гранулы не видны, асссеможет потребовать оптимизации. На рисунке 2показаны крысиные молочные железы и межлопатулярные места расположения жировых площадок. Результаты не могут быть интерпретированы, если биологические ориентиры должным образом определены во время сбора тканей(рисунок 2)и трансплантации(рисунок 2B). В этом анализе, медиальный кровеносный сосуд межлопатулярной белой жировой прокладки используется в качестве биологической точки отсчета.

Квалификационная и количественная оценка эпителиального роста
Наличие, отсутствие или обилие эпителия могут быть оценены для определения успеха эксперимента, а также автономность эффектов, связанных с экспериментальными переменными. Для последнего, некоторые исследования могут потребовать целые установленные слайды с эндогенной брюшной-ингинальной молочной железы хозяина для сравнения. В качестве предварительной меры, световая микроскопия может быть использована для документирования эпителиального нароста как двоичный результат. Эти данные могут быть статистически проанализированы, чтобы проверить гипотезу о том, что отказ от трансплантата зависит от переменных доноров или реципиентов. Взаимный эксперимент трансплантации, где каждый из этих факторов имеет 2 уровня, например, дикий тип (WT) против нокаута (KO), создаст 4 группы трансплантации для тестирования гипотезы(рисунок 3A). Группы трансплантации, выраженные в качестве донора: генотип реципиента, являются: WT:WT, WT:KO, KO: KO: WT. При использовании изогенных или почти конгенгенных животных отторжение трансплантата незначительно и происходит в равной степени в группах трансплантации. Одним из преимуществ нескольких участков для трансплантации в межлопатулярной жировой площадке является сокращение животных-реципиентов, необходимых, так как 2 типа донорских клеток могут быть оценены в одном хосте. Кроме того, оба участка могут быть использованы для тестирования одного типа донорских клеток с более высокой частотой заболеваемости, используя одинаковое количество крыс. Используя генотип в качестве примера, это показано на рисунке 3B.

Эпителиальный рост также может быть проанализирован с помощью изображений слайдов, которые были ранее приобретены. Пример целого установленного межчелюстного жира площадку, содержащего эпителиальный рост на обоих участках трансплантата (записано как положительные результаты) показан для эксперимента с использованием протокола трансплантации клеток молочной железы, описанного здесь (Рисунок 3C). Отсутствие эпителия в межлопатулярной жировой площадке во многих образцах может указывать на техническую проблему с процедурой и рассматривается как отрицательный результат.

Результаты взаимных экспериментов по трансплантации могут быть дополнительно использованы для различения эффектов, которые являются автономными или неавтономными для молочных эпителиальных клеток. Чтобы проверить гипотезу о том, что эффект определяется процессами в клеточных клетках молочной железы (клеток-автономных) или под влиянием хозяина / микроокружения (неавтономный), соответствие фенотипа донорских клеток к фенотипу хозяина (эндогенного) рассматривается как дихотомный результат. В таком примере, как анализ канцерогенеза, заболеваемость опухолями может быть проанализирована как двоичные данные ответа, и логистический регрессионный анализ, используемый для определения того, способствует ли взаимодействие донора, хозяина или донора-хозяина значительно еле-уровня заболеваемости в месте трансплантации. Если эффект обусловлен свойствами донорского эпителия, аналогичный результат трансплантации может наблюдаться в группах реципиентов, независимо от состояния хозяина. Если донорский эпителий развивается так, как если бы он был эндогенным для хозяина, благодаря вкладу генотипа или лечения хозяина, эффект может быть неавтономным. В обеих ситуациях группы трансплантации, в которых донорские эпителиальные клетки совпадают с принимающей стороной (самостоятельной), следует интерпретировать как контроль, а выводы подкрепляются статистическим анализом.

Чтобы продемонстрировать результаты автономного и неавтономного воздействия на пересаженный эпителий, иллюстрация была предоставлена(Рисунок 4A), наряду со слайдами от взаимной трансплантации дикого типа и Cdkn1b нокаут крысы mammary эпителия экспериментов. Результаты этого исследования показали, не-маммарий ской клетки автономных эффектов18 (Рисунок 4B). Для взаимных результатов трансплантации, классифицируемых как двоичная реакция, вероятность результата (например, соответствие фенотипа для размещения эпителия, или успешный рост в количественных анализах), зависящих от категориальных переменных (например, донора или генотипа реципиента), может быть проверена путем построения логистической модели регрессии для основных эффектов и условий взаимодействия.

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка донорских молочных желез. (A) Обзор процедуры извлечения ткани молочной железы от доноров животных и восстановить органоиды для трансплантации. (B) Цельно-установленные эндогенные брюшно-ингинированные молочные железы 4-недельной крысы (типичный возраст доноров трансплантации), после окрашивания квасцов кармин. В возрасте 4 недель, эпителий молочной железы находился в процессе расширения, но протоковое дерево не полностью проникает в жировую площадку, о чем свидетельствует близость к центральным лимфатическим узлам. (C) Консистенция фарша молочной железы показано после измельчения (розовый) в 60 мм блюдо на льду, с соответствующим количеством DMEM / F12 средств массовой информации держать его влажным. Соседние изображения обеспечивают сравнение фарша эпителия после передачи суспензии на Collagenase Digestion Media и когда пищеварение завершено, 90-120 минут спустя. (D) Гранулированные эпителиальные органоиды и разделение слоя видны после центрифугации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Определение границ для сбора тканей и инъекции эпителиальной клетки молочной железы. (A) Показаны места крысиных молочных желез для сбора тканей. Указывается приблизительное расположение эндогенных брюшно-ингинированных молочных желез, собранных у доноров и реципиентов. (B) После бритья и сделать поверхностный разрез, белый interscapular жира площадку получателя трансплантации подвергается. Верхнее изображение: в центре разреза виден медиальный кровеносный сосуд (желтая стрелка). Нижнее изображение: кожа с одной стороны разреза поднимается, чтобы показать ширину жирной прокладки под кожей, по отношению к медиальному кровеносным сосуду (желтая стрелка). Донор эпителий вводится под этим лоскут в жир площадку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Схема взаимной трансплантации. (A) Типичная экспериментальная конструкция для взаимной трансплантации показана, используя генотипы в качестве примера. Тестирование одной экспериментальной переменной, такой как геннокаут (KO) по отношению к эпителию донора дикого типа (WT), создает 4 группы реципиентов трансплантации. (B) Пример дизайна для одного животного-реципиента, получающего 2 инъекции донорского материала. Несколько сайтов для прививки доступны при использовании межлопатулярных белый жир площадку из-за присутствия кровеносных сосудов вдоль средней линии. Отдельные препараты дикого типа и нокаут донорского эпителия (или других условий тестирования) могут быть введены в левую и правую часть кровеносных сосудов. (C) Представитель целом установлен IS жировой ткани колодки от получателя трансплантации отображается в той же ориентации, как в примере, представленном в (B). Эпидемия молочной железы видна на двух участках трансплантации на цельноустановленной горке с окрашенными тканями квасцов-кармина. Межлопатулярная жировая подушечка была вырезана как один кусок через 6 недель после трансплантации. Может потребоваться дополнительное время для развития эпителии, но может также способствовать разрастанию и затруднению разграничения отдельных донорских трансплантатов. Общие биологические артефакты могут быть видны: MS и мышцы, TP и пересаженных эпителия, BF и коричневого жировой жировой ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ автономных и неавтономных результатов mammary cell. ()Моделирование результатов, которые могут наблюдаться при наличии значительных вкладов автономного и неавтономного воздействия на фенотип донорского эпителия. В этом примере в качестве сравнения используются эндогенные брюшно-ингуинальные железы хозяина. Согласие фенотипа донорской эпителиальной нарастания, по сравнению с эндогенной железой, может быть использовано в качестве эталона, но не должно использоваться для исключительного определения эффектов. (B) Донор молочной эпителия нарастания показано на месте трансплантации, рядом с изображениями эндогенной железы для всех 4 групп в взаимной трансплантации эксперимента. Неавтономное воздействие на эпителий молочной железы наблюдается после нокаута одного гена, Cdkn1b, предполагая, микроокружение хозяина влияет на развитие крысы молочной железы18. Шкала баров представляют 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Необходимый шаг Предметы на льду Оттаивано/предварительно подогревается Предметы рядом с хирургом
1. Приготовление эпителия молочной железы 60 мм блюдо Стерильные хирургические инструменты
Аликвот DMEM/F12 70% Этанол
2. Извлечение мозга донора Аликот носителей в трубке 15 или 50 мл (приблизительно 1-2 мл/донор) Баланс для взвешивания мозга, в стерильном поле
Приклеенная к этикетке трубка 15 мл для каждого донора, подходит для гомогенизации Фольги
Пипетка и чаевые (1000 л, или электронные с серологическими пипетками 5 мл)
Механический гомогенизатор
3. Ферментативное пищеварение донорских желез Достаточно DMEM/F12 для омывается Безсыворотка пищеварения сми Лабораторная шкала (g)
DNAse I Монодисперсионная смесь Инкубатор/шейкер
Решение для инактивации 50 мл трубки (помечены) для каждого донора
10 мл (или больше) шприц для стерильной фильтрации коллагеназа пищеварения
20-40 мкм фильтров
Aliquot средств к pre-wet фильтру (s)
50 мл трубки (ы) для сбора фильтрованного ферментного раствора
Стерильные ножницы для резки одноразовые кончики трубача
Большой стакан для сбора супернатанта, или вакуумной линии для аспирации
4. Трансплантация Донор эпителий и мозг гомегената смеси Шприцы Гамильтона - 1 на генотип/условие донора
Aliquot DMEM/F12 для премьер шприцев Масштаб
Стерильные хирургические принадлежности (скальпель/ножницы, несколько щипц)
Зажимы/зажимы раны
Марлей
70% этанола или изопропанола
Бета-динейд или йод
Обезболивающее
Тепловая поддержка животных-получателей
Бумажные полотенца или тонкие салфетки задачи

Таблица 1: Элементы, требующие предварительного рассмотрения на каждом этапе. Этот список предназначен для использования в качестве эталона при подготовке эксперимента и не должен считаться исчерпывающим. Реагенты могут быть необходимы только для конкретного применения протокола, на основе включения/исключения факультативных шагов. В любом эксперименте, эти элементы должны быть доступны без промедления после начала процедуры.

Дополнительный файл 1: Безсыворотка Коллагеназа пищеварения СМИ Подготовка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительный файл 2: Подготовка монодисперсии смеси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительный файл 3: Подготовка инактивационного решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительный файл 4: Квасняя карминподготовка пятен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает метод трансплантации эпителиальной клетки молочной железы, оптимизированный для работы с крысами. Изолированные эпителиевые органоиды молочной железы от крыс-доноров (3-5 недель) прививаются в межлопатулярный белый жир площадку крыс-реципиента (также 3-5 недель возраста). Результаты могут быть интерпретированы всего лишь 4-6 недель спустя, используя светлую микроскопию для изучения привитых тканей; однако оптимальное количество времени между трансплантацией и жертвоприношением должно быть определено до проведения полного эксперимента. Если прошло слишком мало или слишком много времени, результаты не будут ни интерпретироваться, ни значимыми. Для оптимизации протокола проанализируйте рост в небольшом наборе животных через 6-8 недель после трансплантации. Если пересаженный эпителий присутствует, но слабо развит, увеличиваем время. Если трансплантаты хорошо развиты, но перекрывающиеся особенности эпителия мешают анализу, подумайте о сокращении количества недель эпителиального нарастания. Если количество времени не может быть сокращено (например, в экспериментах по канцерогенезу), рекомендуется вводить один и тот же тип донорского эпителия в оба места трансплантации (по одному по обе стороны медиального кровного сосуда), так как исходы не могут быть истолкованы от отдельных сторонсо 100% уверенностью. Если какой-либо тип взаимодействия (автокрина, паракрина) подозревается, настоятельно рекомендуется включить дополнительные контрольные животные вводят с тем же типом донорского эпителия в обоих местах трансплантации. Критические шаги в процедуре включают надлежащую количественную оценку донорских клеток после ферментативного пищеварения и равномерное смешивание с гоменатом мозга. Дополнительный уход должен быть сделан на этих шагах, чтобы обеспечить количество пересаженных клеток является последовательным между реципиентов животных. Кроме того, во время инъекции, убедитесь, что привитые ткани смесь не вытекает из межлопатулярной жировой площадки. 3. Иссецидирование межлопатульной жировой площадки в конечной точке эксперимента. Вся колодка может быть удалена в виде одного куска, но необходимо проявлять осторожность при выборе отдельного 2 стороны межлопатульной жировой площадки, резки только после выявления медиального кровеносных сосудов. Это может быть трудно определить сторону, с которой рост возник, особенно когда один трансплантат зарос в другой, что делает удаление как один кусок более идеальным.

Общей модификацией процедуры является добавление канцерогенного лечения крысы-реципиента25,29. Привитые ткани могут сохранить восприимчивость к канцерогенезу, который был одержим донорской крысы25, или, наоборот, донорская ткань может принять восприимчивость хозяина30. Эти эффекты могут быть определены только при использовании межлопатулярной жировой площадки в качестве места трансплантации, потому что эндогенные молочные железы остаются нетронутыми и функционируют как положительный, внутренний контроль.

При использовании органов молочной железы для трансплантации отсутствие эпителиального нароста может быть вызвано проблемами с подготовкой донорских клеток или процедурой инъекций. Отторжение трансплантата может также произойти, когда реципиент и донорский штамм не являются конгенгенными, вызывая иммунный ответ в хозяине. В таких случаях иммунная система реципиента распознает донорскую ткань как неясовую, инициирует иммунный ответ, а привитная ткань не растет. Для снижения риска отказа от трансплантата, когда донор и реципиент находятся на различных генетических фонов, как минимум 6, и, в идеале, более 10 поколений backcrossing рекомендуется для предотвращения проблем, которые могут повлиять на результат интерпретации. На 6 backcross поколений, большинство трансплантатов будет расти, но меньшинство все еще может потерпеть неудачу. При устранении неполадок в донорской клетке в качестве причины отказа трансплантата, рассмотреть вопрос о том, ферментативное пищеварение было слишком суровым, клетки были сохранены при слишком высоких или слишком низких температурах, источники загрязнения, оптимизация номера донорских клеток, используемых для исследования , или другие отклонения протокола, влияющие на жизнеспособность клеток и рост.

Одноместные стволовые клетки молочной железы были показаны в мыши, чтобы быть в состоянии восстановить функциональную маммарину, иллюстрируя, что добавление гормональной поддержки не является необходимым для первичного результата. Добавление гомената мозга значительно улучшает результат трансплантации, служа в качестве структурной матрицы длядонорских клеток и снижение риска отторжения пересадки 3,34,35,36. В сочетании с гоменатом мозга, минимальное количество эпителиальных клеток молочной железы, необходимых для трансплантации уменьшается более чем в 10 раз, по сравнению с альтернативами3. Важно отметить, что примесь сингенного гомената мозга не было показано, влияют на фенотип пересаженного эпителия, и произвел последовательные результаты в канцерогенезе молочной железы и восприимчивости исследований на протяжении более 40 лет.

Некоторые могут утверждать, что межчелюстной жировой площадки не является репрезентативным эндогенных молочных жировой площадки из-за анатомических различий: близость жира прокладки IS к коричневой жировой ткани, потенциальные различия в плотности кровеносных сосудов в результате различий в воздействии гормонов или наличие видных лимфатических узлов в ротовой брюшной жира пад, которые могут подвергать эпителия к различным уровням цитокина. Хотя это не было специально протестировано на крысах, оба этих склада являются подкожными и развиваться до висцерального жирового37,38; в человеческом жировом, большие молекулярные различия существуют в разных участках, и неоднородность в группах не полностьюпонята 38,39. Дополнительным фактором, чтобы рассмотреть, что белые межлопатулярные и молочные жиры прокладки доля Myf5и мезенхимальной линии прекурсоров, но отличаются по количеству клеток, полученных из этой популяции40. Несмотря на это, есть достаточно доказательств, чтобы предположить, что белый межлопатулярный жир площадку обеспечивает микросреду похож на нижней молочной железы. Молочный эпителий рековется с собственным мезенхима развивается типичный шаблон молочнойжелезы 20, эффект, который хорошо документируетв в исследованиях грызунов и поддерживает наблюдения в жировой ткани человека19,20,24,41,42. Прежде всего, основными детерминантами эпителиальной трансплантации молочной железы успеха у крыс и мышей являются размер и целостность жира площадку43,44. При использовании этого метода, многие исследования восприимчивости рака молочной железы доказали, что функциональные ткани молочной железы могут быть эффективно и регулярно генерируется при пересадке в белый межпрокладка жира площадку18,30,45.

Из-за высокой совместимости, эпителиальный рост поддается молочной клетки автономных и неавтономных факторов и будет реагировать на гормональные манипуляции крыс-реципиента, например, для содействия дифференциации или функциональной секреции молока. Трансплантация органоидов часто используется для изучения факторов, влияющих на развитие молочной железы и/или канцерогенеза. Органоиды могут быть дополнительно переварены до одноклеточных суспензий для облегчения количественного толкования результатов. В то время как метод, описанный в настоящей работе, может быть адаптирован для прививки нетронутых участков ткани молочной железы (как это обычно выполняется на мышах), ферментативные меры диссоциации позволяют делать более подробные выводы. Так как preclearing эндогенных молочных жиров ойпл площадку у крысы не представляется возможным, это в настоящее время единственный метод, позволяющий для прививки крысы молочной эпителии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была профинансирована Холлингс онкологический центр онкологический центр поддержки Грант P30 CA138313 экспериментального финансирования исследований от Национальных институтов здравоохранения(https://www.nih.gov/), и средства от Департамента патологии и лабораторной медицины в Медицинском университете южной Каролины. Мы хотели бы поблагодарить Марийн Смитс за запись интервью заявления.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µM syringe filters Fisher Scientific 09-715G sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 05-408-129 containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers Corning 431752 filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles Hamilton 81001 & 90525 For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette - - transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube Falcon (Corning) 352196 brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers Corning 431750 filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes Fisher Scientific 05-539-6 for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes Thermo Scientific 130181 for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate Sigma-Aldrich 243361/237086 staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use - - follow institutional protocol
Beta-dine or iodine - -
Borosilicate glass culture tube for homogenization Fisher Scientific 14-961-26 for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine Sigma-Aldrich C6152/1022 staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus - -
Clean animal cages for recovery - - follow institutional protocol
Collagenase Type 3 Worthington Biochemical Corp. LS004183 enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water - - for chemical solutions
DMEM/F12 GIBCO 11320033 for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA - - monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2705/2701 mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone - inactivation solution
Gauze - -
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-212 use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS GIBCO - monodispersion mixture
Heating pads - - follow institutional protocol
Ice buckets (x2) - -
Incubator with orbital rotation - - must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia - - follow institutional protocol
Light microscope or digital camera - - visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer Fisher Scientific - TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure Sigma-Aldrich/ ACROS Organics 8042-47-5 long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer - - follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes - -
Positively-charged microscope slides Thermo Scientific P4981-001 mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic - - Institutional protocol
Scale body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver - - electric clippers, or other
Staining jars - - minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes IMCO 4410-IMC used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) - - autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater) - - for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin Worthington monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) - -
Wound clip applier, clips, and removal tool Fine Science Tools 12020-00 Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 clearing mammary gland whole mount slides after staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).

Tags

Исследования рака выпуск 157 крысиная мимбрия железа эпителиальная трансплантация монодисперсные клетки количественная оценка развитие молочной железы рак молочной железы карцинома трансплантат
Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D.,… More

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D., Gould, M. N., Smits, B. M. G. Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad. J. Vis. Exp. (157), e60401, doi:10.3791/60401 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter