تصف هذه المقالة طريقة زرع لتطعيم الخلايا الظهارية الثديية الفئران المانحة في وسادة الدهون البيضاء interscapular من الحيوانات المتلقية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لفحص آثار المضيف و/ أو المانحة على تطور ظهارة الثديية ويلغي الحاجة إلى المقاصة المسبقة ، وبالتالي توسيع نطاق فائدة هذه التقنية.
في وقت مبكر من 1970s، وقد نجح الباحثون في زرع الخلايا الظهارية الثديية في وسادة الدهون البيضاء الانتربوبي للفئران. تطعيم ظهارة الثديية باستخدام تقنيات زرع يستفيد من البيئة الهرمونية التي يوفرها المضيف القوارض المراهق. هذه الدراسات هي مناسبة بشكل مثالي لاستكشاف تأثير التلاعب البيولوجي المختلفة على تطور الغدة الثديية وتشريح العديد من جوانب بيولوجيا الغدة الثديية. ميزة شائعة ، ولكنها محدودة ، هي أن الخلايا الظهارية المزروعة تتأثر بشدة بستروما المحيطة وتفوقت عليها ظهارة ذاتية . للاستفادة من الأنسجة الثديية الأصلية ، يجب مسح وسادة الدهون البيضاء البطنية لإزالة ظهارة الثديية المضيفة قبل عملية الزرع. عقبة رئيسية عند استخدام نموذج الكائن الحي الفئران هو أن إزالة شجرة الثدييالنامية في الفئران بعد الفطم ليست فعالة. عند زرعها في منصات الدهون خالية من الغدة، يمكن للخلايا الظهارية المانحة إعادة ملء وسادة الدهون المضيف ة التي تم تطهيرها وتشكيل غدة ثديية وظيفية. لوحة الدهون الانفية هي موقع بديل لهذه الطعوم. ميزة رئيسية هي أنه يفتقر إلى هياكل القناة بعد يوفر ستروما العادية التي هي ضرورية لتعزيز النمو الظهاري ويمكن الوصول إليها بسهولة في الفئران. ميزة رئيسية أخرى لهذه التقنية هي أنها طفيفة التوغل ، لأنها تقضي على الحاجة إلى التكي وإزالة شجرة الثديية الذاتية المتنامية. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي وسادة الدهون الانفيسية على وعاء دموي وسطي يمكن استخدامه لفصل مواقع التطعيم. لأن الغدد الذاتية لا تزال سليمة، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للدراسات التي تقارن الغدة الثديية الذاتية إلى الغدة المزروعة. تصف هذه الورقة طريقة زرع الخلايا الظهارية الثديية في وسادة الدهون البيضاء الانجيلية للفئران.
تطور الغدة الثديية بعد الولادة ومورفوجينيسيس القناة هي عمليات تتأثر إلى حد كبير بالإشارات الهرمونية في بداية سن البلوغ. في الفئران والجرذان ، والكائنات الحية النموذجية الشائعة الاستخدام لبيولوجيا الغدة الثديية ، تبدأ هذه العملية حوالي 3 أسابيع من العمر ، حيث يؤدي الانتشار السريع والتمايز إلى تكوين parenchyma الناضجة. يمكن أن تخضع الغدة الثديية الناضجة لجولات عديدة من التوسع والتمدد ، وهي خاصية تخضع للتحقيق منذ أوائلالقرن العشرين. في سياق الانتشار المفرط وتطور السرطان ، تم تطوير تقنيات زرع الغدة الثديية في 1950s1، وعززتها المنهجية الكمية التي ساهم بها غولد وآخرون في عام 19772،3،4. وقد ساهم صقل تقنية زرع في القوارض في التقدم الكبير في فهم علم الأحياء الغدة الثديية العادية التي لا تزال تستخدم على نطاق واسع لدراسة تأثير العلاجات المختلفة والتلاعب الجيني على تطور الغدة الثديية الطبيعية وحالات المرض.
وقد تم إنشاء العديد من الفرضيات واختبارها في وقت لاحق باستخدام زرع الغدة الثديية ، التي وصفها لأول مرة DeOme وآخرون في عام 19591. وأظهرت التجارب عبر عدة عقود ميل الأنسجة القناةية التي تم استئصالها من الغدد الثديية المانحة لإعادة ملء كامل لوحة الدهون5،6،7 وأشار إلى أن عنصرا حاسما من نمو الغدة الثديية يكمن في هذه الهياكل الظهارية. أظهرت الدراسات اللاحقة في الفئران أن خلية جذعية مامية واحدة يمكن أن تعيد ملء وسادة الدهون التي تم تطهيرها وساهمت في اكتشاف ذرية واحدة مشتركة من الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والإنارة8،9،10. وتمشيا مع هذه الاستنتاجات، فقد اقترح أن زرع يزيد من مجموعة من الخلايا مع تعدد المجالات إعادة إسكان المحتملة نتيجة لللدونة، مما يسمح للخلايا المطعمة لتنمو الغدة الثديية وظيفية7،10،11،12،13. الأهم من ذلك ، فإن استخدام تقنيات زرع في القوارض يتغلب على قيود التشوهات الناجمة عن زراعة الخلايا14 وغالبا ما يوفر نتائج في غضون أسابيع فقط.
في حين أن الإجراء كان يوصف في الأصل في سياق آفات ما قبل النيوبلاستيك في الفئران ، سرعان ما تم توسيعه ليشمل الفئران واستخدمه بالتزامن مع علاج المواد المسرطنة لإنشاء التعدد كمقياس لقابلية السرطان15، ولكن شعبية تقنيات الزرع تابعت تطوير الأدوات الوراثية لكل نوع. على الرغم من أن دراسات الماوس التي تتضمن زرع ساهمت في العديد من النتائج الانتقالية، فإن parenchyma من الغدة الثديية الفئران يشبه الإنسان بشكل وثيق أكثر16،17 ويقدم مزايا متميزة لدراسة مستقبلات هرمون الاستروجين إيجابية (ER +) سرطان الثدي. الأورام الثديية غير قابلة للاختزال في كلا النوعين ، ولكنها تختلف من حيث حساسية الهرمونات وملامح التعبير الجيني. والفرق الأساسي هو أن الأورام الثديية الفئران التعبير عن وتعتمد على وظيفة مستقبلات هرمون المبيض والغدة النخامية، وهي، الإستروجين والبروجستيرون (PR)، على غرار النوع الفرعي من سرطان الثدي البشري. في الواقع ، تم استخدام زرع الخلايا الظهارية الثديية ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، لدراسة المتغيرات الجينية المشاركة في سرطان الثدي وتحديد الاستقلال ية الخلوية للآثار على الخلايا الظهارية الثديية18.
بالإضافة إلى بيولوجيا الورم ، يعرض ظهارة القناة في الغدة الثديية العادية للفئران مستوى أعلى من التفريع وتحيط به طبقة أكثر سمكًا من ستروما من الماوس. أهمية ستروما موثقة بشكل جيد في دراسات زرع الظهارية الثديية. يجب أن تتفاعل ظهارة مامماري مع ستروما الدهنية ، ومن الناحية المثالية mesenchyme الخاصة بها ، للخضوع لمورفوجينيسيس مميزة19،20. تطعيم الأنسجة في الغدة الثديية المتلقي يوفر بيئة مثالية; ومع ذلك ، فإن وجود ظهارة ذاتية يمكن أن تتداخل مع النتائج. يتم إجراء تطهير الغدة الثديية من ظهارة الذاتية عادة في عينات زرع الفئران ويتطلب الختان الجراحي للأنسجة الثديية الذاتية و / أو إزالة الحلمة1،21،22. على الرغم من أن ذلك ممكن، فإن التبذّر المُسبّل في الفئران بعد الفطم ليس على نطاق واسع، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم فعالية إزالة شجرة الثديية المتنامية في الفئران بعد الفطمة. منذ وقد ثبت أن مناطق الأنسجة الدهنية في مكان آخر من الجسم يمكن أن تدعم نمو ظهارة الثديية المزروعة21،23،24، يمكن تجنب عملية المقاصة بسهولة في الفئران عن طريق تطعيم الأنسجة في وسادة الدهون البيضاء interscapular.
تتضمن طريقة الزرع الموصوفة في هذه الورقة حقن عضويات الغدة الثديية المنفصلة بشكل أنزيمي (أجزاء من ظهارة القناة الثديية وأنواع الخلايا الأخرى القادرة على النشوء المورفولوجي) أو الخلايا أحادية التشتت في وسادة الدهون البينية في سلالات الفطرية أو الأيجينية أو الجينية للفئران المختبرية2. لأن وسادة الدهون الانفيسية عادة ما تخلو من الأنسجة الثديية، فإنه يوفر بيئة مناسبة لمواقع زرع متعددة دون الحاجة إلى مسح الظهارة الذاتية مسبقا. ونتيجة لذلك ، فإن الغدد الثديية الذاتية البطنية للالحيوان المضيف لا تخضع للتلاعب الجراحي ، وتتطور بشكل طبيعي ، ولا يمكن أن تتداخل مع تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الغدد الثديية السليمة للمقارنة لتقييم آثار المضيف مقابل المانحين على تطور ظهارة الثدي والورم18،25. على الرغم من أن إعادة انتشار الغدة الثديية من خلية جذعية واحدة متاحة للفئران ، إلا أنها لم يتم تطويرها بعد للفئران ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم توفر الأجسام المضادة لاختيار الخلايا الجذعية الثديية للفئران25،26،27. على الرغم من هذا ، يمكن إجراء زرع الخلايا الظهارية الثديية أحادية التشتت لتحديد إمكانات إعادة التهوم بنجاح ، وسوف تتطور هذه الخلايا بشكل طبيعي عند تطعيمها في الإطار المناسب2،3،4. في حين أن الأجهزة الاعضاء جيدة لأغراض عديدة ، فإن الخلايا أحادية التشتت مطلوبة للتطبيقات الكمية ، على سبيل المثال ، لتحديد عدد الخلايا الظهارية الثديية اللازمة لبدء السرطان بعد العلاج الإشعاعي المؤين28 أو لمقارنة خصائص التدفق المختار بالخلايا الثديية المختارة بالخلايا الظهارية29.
حتى الآن ، فإن الإجراء الموصوف هنا هو أقوى طريقة لإجراء زراعة الغدة الثديية في الفئران مع هدف عام هو دراسة تطور الغدة الثديية والآليات الكامنة وراء تطور سرطان الثدي. في كثير من الأحيان ، يتعرض المتبرع و / أو الحيوانات المتلقية لمتغيرات مختلفة قبل أو أثناء أو بعد زرع الظهارية. ومن الأمثلة على ذلك دراسات الجينات الواحدة التي تنطوي على التسرطن الكيميائي30، الإشعاع28،31،32، التلاعب الجيني للجينوم المضيف / المانح18، والتلاعب الهرموني12. ومن المزايا الرئيسية للانفصام الأنزيمي الموصوف في هذا البروتوكول هو فرصة لعزل الاعضاء الظهارية أو الخلايا أحادية التشتت للتجارب التكميلية التي تنطوي على تدفق الخلايا، والثقافة ثلاثية الأبعاد، وتحرير الجينات، وأكثر من ذلك. وستشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية التلاعب الإضافي بالأنسجة المانحة و/أو المضيفة بالهندسة الوراثية. على سبيل المثال، يمكن تغيير الخلايا المانحة وراثيًا في أي مكان جينومي مختار باستخدام نظام تحرير الجينات CRISPR-Cas9. وبالمثل، يمكن أيضا ً تغيير الفئران المتلقية وراثياً لدراسة التفاعل بين العوامل الوراثية المهندسة للمانحين والمتلقين.
يصف هذا البروتوكول تقنية زرع الخلايا الظهارية الثديية المحسنة للعمل مع الفئران. يتم تطعيم الأعضاء الظهارية الثديية المعزولة من الفئران المانحة (3-5 أسابيع من العمر) في وسادة الدهون البيضاء البينية للفئران المتلقية (3-5 أسابيع من العمر أيضًا). يمكن تفسير النتائج أقل من 4-6 أسابيع في وقت لاحق, ب?…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل مركز هولينغس للسرطان مركز دعم السرطان منحة P30 CA138313 البحوث التجريبية التمويل من المعاهد الوطنية للصحة(https://www.nih.gov/)،والأموال من قسم علم الأمراض والطب المختبري في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية. ونود أن نشكر ماريجين سميث على تسجيل هاوية المقابلة.
0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
Beta-dine or iodine | – | – | |
Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
Cell counting apparatus | – | – | |
Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
deionized water | – | – | for chemical solutions |
DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
EDTA | – | – | monodispersion mixture |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
Gauze | – | – | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
Ice buckets (x2) | – | – | |
Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
Shaver | – | – | electric clippers, or other |
Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |