Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.
Al in de jaren 1970 hebben onderzoekers met succes getransplanteerde borstepitheelcellen in de interscapulaire witte vet pad van ratten. Enten van borstepitheel met behulp van transplantatietechnieken maakt gebruik van de hormonale omgeving die wordt geboden door de adolescente knaagdiergastheer. Deze studies zijn bij uitstek geschikt om de impact van verschillende biologische manipulaties op de ontwikkeling van de borstklier te onderzoeken en vele aspecten van de borstklierbiologie te ontleden. Een gemeenschappelijk, maar beperkend kenmerk is dat getransplanteerde epitheelcellen sterk worden beïnvloed door de omringende stroma en worden overconcurreerd door endogene epitheel; om inheemse borstweefsel te gebruiken, moet het buik-inguinale witte vetpad worden gewist om gastheer borstepitheel voorafgaand aan de transplantatie te verwijderen. Een belangrijk obstakel bij het gebruik van het rattenmodel organisme is dat het opruimen van de zich ontwikkelende borstboom in post-gesaneerde ratten niet efficiënt is. Wanneer getransplanteerd in kliervrije vetpads, donor epitheliale cellen kunnen herbevolken de gewiste gastheer vet pad en vormen een functionele borstklier. De interscapulaire vet pad is een alternatieve locatie voor deze grafts. Een groot voordeel is dat het geen ductalstructuren heeft, maar de normale stroma biedt die nodig is om epitheeluitgroei te bevorderen en gemakkelijk toegankelijk is in de rat. Een ander groot voordeel van deze techniek is dat het minimaal invasief is, omdat het de noodzaak elimineert om de groeiende endogene borstboom te cauteriseren en te verwijderen. Bovendien bevat de interscapulaire vetpad een mediale bloedvat dat kan worden gebruikt om plaatsen voor enting te scheiden. Omdat de endogene klieren intact blijven, kan deze techniek ook worden gebruikt voor studies die de endogene borstklier vergelijken met de getransplanteerde klier. Dit document beschrijft de methode van borstepitheelceltransplantatie in het interscapulaire witte vetstootkussen van ratten.
Postnatale borstklier ontwikkeling en ductalmorfogenese zijn processen grotendeels beïnvloed door hormonale signalering aan het begin van de puberteit. Bij muizen en ratten, veelgebruikte modelorganismen van de borstklierbiologie, begint dit proces rond 3 weken oud, waar snelle proliferatie en differentiatie resulteren in de vorming van de volwassen parenchyma. De rijpe borstklier kan ondergaan talrijke rondes van expansie en involutie, een eigenschap die is onderzocht sinds het begin van de20e eeuw. In het kader van hyperproliferatie en kankerontwikkeling werden in de jaren vijftig1transplantatietechnieken voor de borstklier ontwikkeld en versterkt door de kwantitatieve methodologie die Gould et al. in 19772,3,4heeft bijgedragen . Verfijning van de transplantatie techniek bij knaagdieren heeft bijgedragen aan grote vooruitgang in het begrijpen van de normale borstklier biologie die nog steeds op grote schaal worden gebruikt om het effect van verschillende behandelingen en genetische manipulatie op de normale borstklier ontwikkeling en ziekte staten te bestuderen.
Veel hypothesen zijn gegenereerd en vervolgens getest met behulp van borstkliertransplantatie, voor het eerst beschreven door DeOme et al. in 19591. Experimenten in verschillende decennia toonden de neiging van ductalweefsel uit donorborstklieren om het hele vetpad5,6,7 opnieuw te bevolken en gaven aan dat een kritieke component van de ontwikkeling van de borstklier in deze epitheelstructuren woont. Latere studies bij muizen toonden aan dat een enkele borststamcel een gewist vetpad kan herbevolken en heeft bijgedragen aan de ontdekking van een enkele, gemeenschappelijke voorloper van basale en luminaire borstepitheelcellen8,9,10. In overeenstemming met deze conclusies is gesuggereerd dat transplantatie de pool van cellen met multilineage-repopulating potentieel als gevolg van plasticiteit verhoogt, waardoor de geënte cellen een functionele borstklierkunnenlaten groeien 7,10,11,12,13. Belangrijk is dat het gebruik van transplantatietechnieken bij knaagdieren de beperkingen van celkweek-geïnduceerde afwijkingen overwint14 en vaak resultaten oplevert in slechts een kwestie van weken.
Terwijl de procedure oorspronkelijk werd beschreven in de context van preneoplastische laesies bij muizen, werd het al snel uitgebreid tot ratten en gebruikt in combinatie met de carcinogene behandeling om multipliciteit vast te stellen als een maatregel van de gevoeligheid van kanker15, maar de populariteit van transplantatie technieken heeft gevolgd de ontwikkeling van genetische instrumenten voor elke soort. Hoewel muisstudies waarin transplantatie is opgenomen, veel translationele bevindingen hebben bijgedragen, lijkt de haakse van de rattenborstklier op de mens dichterop 16,17 en biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van oestrogeenreceptor-positieve (ER+) borstkanker. Borsttumoren zijn in ducible in beide soorten, maar ze verschillen in termen van hormoongevoeligheid en genexpressie profielen. Een primair verschil is dat rat borsttumoren uitdrukken en afhankelijk zijn van de functie van eierstokkanker en hypofyse hormoonreceptoren, namelijk oestrogeen en progesteron (PR), vergelijkbaar met de luminal-A subtype van de menselijke borstkanker. Inderdaad, borstepitheel epitheel celtransplantatie, zoals beschreven in dit protocol, is gebruikt om genetische varianten die betrokken zijn bij borstkanker te bestuderen en de cellulaire autonomie van effecten op borstepitheelcellen te bepalen18.
Naast de tumorbiologie vertoont het ductale epitheel van de normale rattenborstklier een hoger niveau van vertakking en wordt geflankeerd door een dikkere laag stroma dan de muis. Het belang van de stroma is goed gedocumenteerd in borstepitheel epitheliale transplantatie studies. Borstepitheel moet interageren met vette stroma, en idealiter zijn eigen mesenchyme, om zijn karakteristieke morfogenese19,20ondergaan . Entweefsel in een ontvanger borstklier zorgt voor een optimale omgeving; de aanwezigheid van endogene epitheel kan echter de resultaten verstoren. Preclearing de borstklier van endogene epitheel wordt vaak uitgevoerd in muistransplantatie tests en vereist chirurgische excisie van endogene borstweefsel en / of verwijdering van de tepel1,21,22. Hoewel mogelijk, preclearing de borstepitheel in post-spenen ratten is niet zo breed uitgevoerd, vooral te wijten aan de ineffectiviteit van het opruimen van de groeiende borstboom in post-spenende ratten. Aangezien is aangetoond dat gebieden van vetweefsel elders in het lichaam de groei van getransplanteerde borstepitheel21,23,24kunnen ondersteunen, kan het proces van voorclearing gemakkelijk worden vermeden bij ratten door weefsel te enten in het interscapulaire witte vetpad.
De in dit document beschreven transplantatiemethode omvat de injectie van enzymatisch gescheiden borstklierorganoïden (fragmenten van borstkanaalepitheel en andere cellendie morfogenese kunnen) of mono-verspreide cellen in het interscapulaire vetpad in inteelt, isogenische of congene stammen van laboratoriumratten2. Omdat de interscapulaire vetpad normaal gesproken verstoken is van borstweefsel, biedt het een geschikte omgeving voor meerdere transplantatielocaties zonder dat het endogeen epitheel vooraf hoeft te zuiveren. Als gevolg hiervan zijn de endogene, abdominale borstklieren van het gastheerdier niet onderhevig aan chirurgische manipulatie, ontwikkelen zich normaal en kunnen ze de interpretatie van de resultaten niet verstoren. Bovendien kunnen de intacte borstklieren worden gebruikt voor vergelijking om gastheer versus donoreffecten op de borstepitheelontwikkeling en tumorigenese18,25te evalueren. Hoewel herpopulatie van de borstklier uit een enkele stamcel beschikbaar is voor muizen, is deze nog niet ontwikkeld voor ratten, voornamelijk vanwege het gebrek aan beschikbaarheid van antilichamen om te selecteren voor ratborststamcellen25,26,27. Desondanks kan transplantatie van monodispersed borstepitheelcellen om repopulating potentieel te kwantificeren met succes worden uitgevoerd, en die cellen zullen zich normaal ontwikkelen wanneer ze in het juiste kader2,3,4worden geënt. Hoewel organoïden voor vele doeleinden goed zijn, zijn monodispersed cellen nodig voor kwantitatieve toepassingen, bijvoorbeeld om het aantal borstepitheelcellen te bepalen dat nodig is voor de kankerinitiatie na ioniserende bestraling28 of voor het vergelijken van kenmerken van flow cytometrisch geselecteerde borstepitheelcelpopulaties29.
Tot op heden, de procedure hier beschreven is de meest robuuste methode van het uitvoeren van borstklier transplantatie in de rat met een algemeen doel van het bestuderen van borstklier ontwikkeling en mechanismen die ten grondslag liggen borstkanker ontwikkeling. Vaak worden de donor- en/of ontvangende dieren vóór, tijdens of na de epitheeltransplantatie blootgesteld aan verschillende variabelen. Voorbeelden hiervan zijn enkelgenstudies met chemische carcinogenese30, straling28,31,32, genetische manipulatie van gastheer/donorgenoom18en hormonale manipulatie12. Een groot voordeel van de enzymatische dissociatie beschreven in dit protocol is de mogelijkheid om epitheliale organoïden of monodispersed cellen te isoleren voor complementaire experimenten met flow cytometrie, 3-D cultuur, genbewerking, en nog veel meer. Toekomstige toepassingen van deze techniek zullen aanvullende manipulatie van donor- en/of gastheerweefsel met genetische manipulatie omvatten. Donorcellen kunnen bijvoorbeeld genetisch worden gewijzigd ex vivo op elke gekozen genomische locus met behulp van het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem. Op dezelfde manier kunnen ontvangers ratten ook genetisch worden gewijzigd om de interactie tussen donor en ontvanger gemanipuleerde genetische factoren te bestuderen.
Dit protocol beschrijft een borstepitheel celtransplantatie techniek geoptimaliseerd voor het werken met ratten. Geïsoleerde borstepitheele-organoïden van donorratten (3-5 weken oud) worden geënt in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende ratten (ook 3-5 weken oud). Resultaten kunnen worden geïnterpreteerd zo weinig als 4-6 weken later, met behulp van lichte microscopie om het geënte weefsel te onderzoeken; De optimale tijd tussen transplantatie en opoffering moet echter worden bepaald voordat een vol…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Hollings Cancer Center’s Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot onderzoeksfinanciering van de National Institutes of Health(https://www.nih.gov/),en fondsen van de afdeling Pathologie & Laboratoriumgeneeskunde aan de Medische Universiteit van South Carolina. We willen Marijne Smiths bedanken voor het opnemen van de interviewverklaringen.
0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
Beta-dine or iodine | – | – | |
Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
Cell counting apparatus | – | – | |
Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
deionized water | – | – | for chemical solutions |
DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
EDTA | – | – | monodispersion mixture |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
Gauze | – | – | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
Ice buckets (x2) | – | – | |
Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
Shaver | – | – | electric clippers, or other |
Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |