Rotte Mammary Epithelial Celletransplantation i Interscapular White Fat Pad

Summary

Denne artikel beskriver en transplantationmetode til graft donor rotte mælkeceller epitelceller i den interscapular hvide fedt pude af recipient dyr. Denne metode kan anvendes til at undersøge vært og/eller donorvirkninger på mælkeepiteludvikling og eliminerer behovet for forclearing og udvider dermed nytten af denne teknik.

Abstract

Så tidligt som i 1970’erne, forskere har med succes transplanteret mælkeceller epitelceller i den interscapular hvide fedt pad af rotter. Podning mammary epitel ved hjælp af transplantation teknikker udnytter det hormonelle miljø, som den unge gnaver vært. Disse undersøgelser er velegnet til at udforske virkningen af forskellige biologiske manipulationer på mælkekirtlen udvikling og dissekere mange aspekter af mælkekirtlen biologi. En fælles, men begrænsende, træk er, at transplanterede epitelceller er stærkt påvirket af den omgivende stroma og udkonkurreret af endogene epitel; for at udnytte indfødte mælkevæv, abdominal-inguinale hvide fedt pad skal ryddes for at fjerne vært mælkeepitel før transplantation. En stor hindring, når du bruger rotte model organismen er, at rydde udviklingslandene mælketræ i post-fravænnet rotter er ikke effektiv. Når transplanteret i kirtel-fri fedt puder, donor epitelceller kan genbefolke den ryddede vært fedt pad og danne en funktionel mælkekirtlen. Den interscapular fedt pad er et alternativt sted for disse grafts. En stor fordel er, at det mangler kanalstruktur endnu giver den normale stroma, der er nødvendig for at fremme epitel udvækst og er let tilgængelig i rotten. En anden stor fordel ved denne teknik er, at det er minimalt invasive, fordi det eliminerer behovet for at ætse og fjerne den voksende endogene mammary træ. Derudover indeholder den interscapulære fedtpude et mediale blodkar, der kan bruges til at adskille steder til podning. Fordi endogene kirtler forbliver intakt, denne teknik kan også bruges til undersøgelser sammenligne endogene mælkekirtlen til den transplanterede kirtel. Dette papir beskriver metoden til mælkeepitelcelletransplantation i den interscapular hvide fedt pude af rotter.

Introduction

Postnatal mammøkirtel udvikling og ductal morfogenese er processer i vid udstrækning påvirket af hormonelle signalering i begyndelsen af puberteten. Hos mus og rotter, almindeligt anvendte model organismer af mælkekirtlen biologi, denne proces begynder omkring 3 uger af alder, hvor hurtig spredning og differentiering resultere i dannelsen af den modne parenkym. Den modne mælkekirtlen kan gennemgå mange runder af ekspansion og involution, en ejendom, der har været under efterforskning siden begyndelsen af det^20. Inden for rammerne af hyperproliferation og udvikling af kræft blev der i1950’erne udviklet mælkekirteltransplantationsteknikker , som blev forstærket af den kvantitative metode , som Gould et al. bidrog med i 1977^2,3,4. Raffinement af transplantation teknik i gnavere har bidraget til store fremskridt i forståelsen af normal mælkekirtlen biologi, der stadig er meget udbredt til at studere effekten af forskellige behandlinger og genetisk manipulation på normal mælkekirtlen udvikling og sygdom stater.

Mange hypoteser er blevet genereret og efterfølgende testet ved hjælp af mælkekirtlen transplantation, først beskrevet af DeOme et al. i 1959¹. Eksperimenter på tværs af flere årtier viste tilbøjeligheden af ductal væv punktafgifter fra donor mælkekirtler til at genbefolke hele fedt pad^5,6,7 og viste, at en kritisk komponent af mælkekirtlen udvikling ligger i disse epitelstrukturer. Senere undersøgelser i mus viste, at en enkelt mælkestamceller kan genbefolke en renset fedtpude og bidrog til opdagelsen af en enkelt, almindelig stamforemand af basale og luminale mælkeceller^8,9,10. I overensstemmelse med disse konklusioner, Er det blevet foreslået, at transplantation øger puljen af celler med multilineage-repopulating potentiale som følge af plasticitet, så podede celler til at vokse en funktionel mælkekirtlen^{7,10,11,12,13}. Det er vigtigt, at brugen af transplantationsteknikker i gnavere overvinder begrænsningerne af cellekultur-inducerede abnormiteter¹⁴ og giver ofte resultater på bare et spørgsmål om uger.

Mens proceduren oprindeligt blev beskrevet i forbindelse med præoplastiske læsioner i mus, blev den hurtigt udvidet til rotter og anvendt i forbindelse med behandlingen med kræftfremkaldende stoffer for at etablere mangfoldighed som et mål for kræftfølsomhed¹⁵, men populariteten af transplantationsteknikker har fulgt udviklingen af genetiske værktøjer for hver art. Selv om mus undersøgelser indarbejde transplantation har bidraget mange translationelle resultater, parenkym af rotte mælkekirtlen ligner det menneskelige tættere^16,17 og tilbyder klare fordele for at studere østrogen receptor-positiv (ER +) brystkræft. Mammary tumorer er utilgængelige i begge arter, men de adskiller sig med hensyn til hormon følsomhed og genekspression profiler. En primær forskel er, at rotte mælketumorer udtrykke og afhænge af funktionen af æggestokkene og hypofyse hormon receptorer, nemlig østrogen og progesteron (PR), svarende til luminal-A subtype af human brystkræft. Faktisk, mammary epitelcelletransplantation, som beskrevet i denne protokol, er blevet brugt til at studere genetiske varianter involveret i brystkræft og bestemme cellulære autonomi virkninger på mælkeepitelceller¹⁸.

Ud over tumorbiologi, kanalen epitel af den normale rotte mælkekirtlen udviser et højere niveau af forgrening og er flankeret af et tykkere lag af stroma end musen. Betydningen af stroma er veldokumenteret i mælkeepiteltransplantationsundersøgelser. Mammary epitel skal interagere med fede stroma, og ideelt set sin egen mesenchyme, at gennemgå sin karakteristiske morfogenese^19,20. Podning væv i en modtager mælkekirtlen giver et optimalt miljø; tilstedeværelsen af endogenepitel kan dog forstyrre resultaterne. Preclearing mælkekirtlen af endogene epitel er almindeligt udført i mus transplantation assays og kræver kirurgisk excision af endogene mælkevæv og / eller fjernelse af brystvorten^1,21,22. Selv om det er muligt, preclearing mælkeepitel i post-fravænning rotter er ikke så almindeligt udført, hovedsagelig på grund af ineffektivitet clearing den voksende mælketræ i post-fravænning rotter. Da det har vist sig, at regioner med fedtvæv andre steder i kroppen kunne støtte væksten af transplanteret mælkeepitel^21,23,24, processen med preclearing kan let undgås i rotter ved podning væv i interscapular hvid fedt pad.

Den transplantationsmetode, der er beskrevet i dette papir, indebærer injektion af enzymatisk adskilte mælkekirtelorider (fragmenter af mælkeductal epitel og andre celler, der kan mororegenese) eller monopergers celler i den interscapular fedtpude, der er indavlet, isogene eller kongene stammer af laboratorierotter². Fordi interscapular fedt pad er normalt blottet for mælkevæv, det giver et passende miljø for flere transplantationssteder uden at det er nødvendigt at præ-klar endogene epitel. Som følge heraf er værtsdyrets endogene, abdominale mønelle mælkekirtler ikke underlagt kirurgisk manipulation, udvikler sig normalt og kan ikke forstyrre fortolkningen af resultaterne. Derudover, den intakte mælkekirtler kan bruges til sammenligning for at evaluere vært versus donor effekter på mælkeepitel udvikling og tumorigenese^18,25. Selv om genindsættelse af mælkekirtlen fra en enkelt stamcelle er tilgængelig for mus, det er endnu ikke blevet udviklet til rotte, hovedsagelig på grund af den manglende tilgængelighed af antistoffer til at vælge for rotte mælkestamceller^25,26,27. På trods af dette kan transplantation af monodispersed mælkeepitelceller til kvantificering af genbefolkende potentiale udføres med succes, og disse celler vil udvikle sig normalt, når de podes ind i den relevante ramme^2,3,4. Mens organoider er gode til mange formål, monodispersed celler er nødvendige for kvantitative anvendelser, for eksempel, at bestemme antallet af mælkeepitelceller, der kræves for kræft indledningen efter ioniserende strålebehandling²⁸ eller for at sammenligne karakteristika flow cytometrisk udvalgte mælkeceller epitelcellepopulationer²⁹.

Til dato, den procedure, der er beskrevet her er den mest robuste metode til at udføre mælkekirtlen transplantation i rotten med et overordnet mål om at studere mælkekirtlen udvikling og mekanismer, der ligger til grund for brystkræft udvikling. Donor- og/eller recipientdyrene udsættes ofte for forskellige variabler før, under eller efter den epiteltransplantation. Som eksempler kan nævnes enkeltgensundersøgelser , der involverer kemisk carcinogenese³⁰, stråling^28,31,32, genetisk manipulation af værts-/donorgenom¹⁸og hormonmanipulation¹². En stor fordel ved den enzymatiske dissociation, der er beskrevet i denne protokol, er muligheden for at isolere epitelorier eller monodispersed celler til komplementære eksperimenter, der involverer flowcytometri, 3D-kultur, genredigering og meget mere. Fremtidige anvendelser af denne teknik vil omfatte yderligere manipulation af donor og / eller vært væv med genteknologi. For eksempel kan donorceller genetisk ændres ex vivo på enhver valgt genomisk locus ved hjælp af CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. Tilsvarende kan recipient rotter også genetisk ændres for at studere samspillet mellem donor og modtager manipuleret genetiske faktorer.

Protocol

Alle dyr blev anbragt og vedligeholdt i et AAALAC-godkendt anlæg, og forsøg, der er beskrevet i denne protokol, blev godkendt af MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dyr til gensidig transplantation bør være en indavlet eller isogen stamme med genkogen status foretrukket eller tilbagekrydset i mindst 6 generationer. 1. Høst donor rotte mælkekirtlen epitel Bestemme antallet af donor rotter er nødvendige for transplantation.BEMÆRK: Generelt kan 1 donorrot…

Representative Results

Donor og modtager mælkekirtlerTrinene til at isolere og forberede rottemælkeepitelceller til transplantation er vist i figur 1A. Ved 4 ugers alderen er donorrottens endeogene mælkekirtlen begyndt modning, og epitel kan visualiseres på hele monterede dias, der er plettet med alumcarmin (figur 1B). En donor rotte i denne alder vil give ca 1 x 10…

Discussion

Denne protokol beskriver en mælkeepitelcelletransplantationsteknik, der er optimeret til at arbejde med rotter. Isolerede mælkeepitelorier fra donorrotter (3-5 uger) podes ind i den interscapular hvide fedtpude af recipientrotter (også 3-5 uger). Resultaterne kan fortolkes så lidt som 4-6 uger senere, ved hjælp af lys mikroskopi til at undersøge podet væv; den optimale tid mellem transplantation og ofring skal dog fastsættes, inden der gennemføres et fuldstændigt eksperiment. Hvis der er gået for lidt eller fo…

Materials

0.2 µM syringe filters	Fisher Scientific	09-715G	sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)	Fisher Scientific	05-408-129	containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers	Corning	431752	filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles	Hamilton	81001 & 90525	For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette	–	–	transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube	Falcon (Corning)	352196	brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers	Corning	431750	filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes	Fisher Scientific	05-539-6	for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes	Thermo Scientific	130181	for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate	Sigma-Aldrich	243361/237086	staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use	–	–	follow institutional protocol
Beta-dine or iodine	–	–
Borosilicate glass culture tube for homogenization	Fisher Scientific	14-961-26	for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine	Sigma-Aldrich	C6152/1022	staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus	–	–
Clean animal cages for recovery	–	–	follow institutional protocol
Collagenase Type 3	Worthington Biochemical Corp.	LS004183	enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water	–	–	for chemical solutions
DMEM/F12	GIBCO	11320033	for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA	–	–	monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2705/2701	mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	–	inactivation solution
Gauze	–	–
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS	GIBCO	–	monodispersion mixture
Heating pads	–	–	follow institutional protocol
Ice buckets (x2)	–	–
Incubator with orbital rotation	–	–	must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia	–	–	follow institutional protocol
Light microscope or digital camera	–	–	visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer	Fisher Scientific	–	TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure	Sigma-Aldrich/ ACROS Organics	8042-47-5	long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer	–	–	follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes	–	–
Positively-charged microscope slides	Thermo Scientific	P4981-001	mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic	–	–	Institutional protocol
Scale			body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver	–	–	electric clippers, or other
Staining jars	–	–	minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes	IMCO	4410-IMC	used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)	–	–	autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)	–	–	for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin	Worthington		monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)	–	–
Wound clip applier, clips, and removal tool	Fine Science Tools	12020-00	Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes	Fisher Scientific	X3S-4	clearing mammary gland whole mount slides after staining