Summary

Rotte mammary epitelcelletransplantasjon i Interscapular Hvit Fett Pad

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Denne artikkelen beskriver en transplantasjonsmetode for å pode donor rottepattedyr epitelceller i interscapular hvit fett pute av mottakerdyr. Denne metoden kan brukes til å undersøke verts- og/eller donoreffekter på brystepitelutvikling og eliminerer behovet for forhåndsrensing, og dermed utvider nytten av denne teknikken.

Abstract

Så tidlig som på 1970-tallet har forskere vellykket transplantert brystepitelceller i interscapular hvit fett pute av rotter. Podebrystepitel ved hjelp av transplantasjonsteknikker utnytter det hormonelle miljøet som tilbys av den unge gnagerverten. Disse studiene er ideelt egnet til å utforske virkningen av ulike biologiske manipulasjoner på brystkjertelutvikling og dissekere mange aspekter av brystkjertelbiologi. En vanlig, men begrensende, funksjon er at transplanterte epitelceller er sterkt påvirket av den omkringliggende stroma og utkonkurrert av endogene epitel; for å utnytte innfødt brystvev, må abdominal-inguinal hvit fett pute fjernes for å fjerne vert brystepitel før transplantasjon. Et stort hinder når du bruker rottemodellorganismen er at å rydde det utviklende brysttreet i post-avvennede rotter ikke er effektivt. Når transplanteres inn i kjertelfrie fettpads, kan donorepitelceller fylle den ryddet vertsfettputen og danne en funksjonell brystkjertel. Interscapular fett pad er et alternativ sted for disse grafts. En stor fordel er at den mangler kanalstrukturer, men gir den normale stroma som er nødvendig for å fremme epitelutvekst og er lett tilgjengelig i rotten. En annen stor fordel med denne teknikken er at den er minimalt invasiv, fordi det eliminerer behovet for å cauterize og fjerne det voksende endogene pattedyrtreet. I tillegg inneholder interscapular fettputen et medial blodkar som kan brukes til å skille steder for pode. Fordi endogene kjertler forblir intakte, kan denne teknikken også brukes til studier som sammenligner endogene brystkjertel med den transplanterte kjertelen. Dette papiret beskriver metoden for pattedyr epitelcelletransplantasjon i interscapular hvit fett pute av rotter.

Introduction

Postnatal brystkjertelutvikling og ductal morfolever er prosesser som i stor grad påvirkes av hormonell signalering ved utbruddet av puberteten. Hos mus og rotter, ofte brukte modellorganismer av brystkjertelbiologi, begynner denne prosessen rundt 3 uker, hvor rask spredning og differensiering resulterer i dannelsen av det modne parenchymaet. Den modne brystkjertelen kan gjennomgå mange runder med ekspansjon og involution, en eiendom som har vært under etterforskning siden tidlig på 1900-tallet. Innenfor rammen av hyperproliferasjon og kreftutvikling ble brystkjerteltransplantasjonsteknikker utviklet på 1950-tallet1,og forbedret av den kvantitative metodikken bidratt av Gould et al. i 19772,3,4. Raffinement av transplantasjonsteknikken hos gnagere har bidratt til store fremskritt i forståelsen av normal brystkjertelbiologi som fortsatt er mye brukt til å studere effekten av ulike behandlinger og genetisk manipulasjon på normal brystkjertelutvikling og sykdomstilstander.

Mange hypoteser har blitt generert og senere testet ved hjelp av brystkjerteltransplantasjon, først beskrevet av DeOme et al. i 19591. Eksperimenter over flere tiår viste tilbøyelighet en ductal vev utskåret fra donor brystkjertler å befolke hele fett pad5,6,7 og indikerte at en kritisk komponent av brystkjertel utvikling ligger i disse epitelstrukturer. Senere studier på mus viste at en enkelt bryststamcelle kan befolke en ryddet fettpute og bidro til oppdagelsen av en enkelt, vanlig stamfar av basal og luminal brystepitelceller8,9,10. I tråd med disse konklusjonene har det blitt foreslått at transplantasjon øker bassenget av celler med multilineage-repopulating potensial som følge av plastisitet, slik at de transplanterte cellene å vokse en funksjonell brystkjertel7,10,11,12,13. Viktigere, bruk av transplantasjon teknikker i gnagere overvinner begrensningene av cellekultur-indusert abnormiteter14 og gir ofte resultater i løpet av bare noen uker.

Mens prosedyren opprinnelig ble beskrevet i sammenheng med preneoplastiske lesjoner hos mus, ble den snart utvidet til rotter og brukt sammen med kreftfremkallende behandling for å etablere mangfold som et mål på kreftmottakelighet15, men populariteten til transplantasjonsteknikker har fulgt utviklingen av genetiske verktøy for hver art. Selv om musestudier som omfatter transplantasjon har bidratt med mange translasjonelle funn, ligner parenchyma av rottebrystkjertelen mennesket tettere16,17 og tilbyr forskjellige fordeler for å studere østrogen reseptor-positiv (ER+) brystkreft. Brystsvulster er ududige i begge artene, men de varierer i form av hormonfølsomhet og genuttrykksprofiler. En primær forskjell er at rottebrystsvulster uttrykker og avhenger av funksjonen til ovarie- og hypofysenhormonreseptorer, nemlig østrogen og progesteron (PR), som ligner på luminal-A-undertypen av human brystkreft. Faktisk har pattedyr epitelcelletransplantasjon, som beskrevet i denne protokollen, blitt brukt til å studere genetiske varianter involvert i brystkreft og bestemme cellulær autonomi av effekter på brystepitelceller18.

I tillegg til tumorbiologien viser det kanalepitelet til den normale rottebrystkjertelen et høyere nivå av forgrening og flankeres av et tykkere lag av stroma enn musen. Betydningen av stroma er godt dokumentert i mammary epiteltransplantasjon studier. Brystepitel må samhandle med fet stroma, og ideelt sett sin egen mesenchyme, for å gjennomgå sin karakteristiske morfose19,20. Podevev i en mottakerbrystkjertel gir et optimalt miljø; Imidlertid kan tilstedeværelsen av endogene epitel forstyrre resultatene. Preclearing brystkjertelen av endogene epitel utføres vanligvis i musetransplantasjon analyser og krever kirurgisk eksisjon av endogene brystvev og / eller fjerning av brystvorten1,21,22. Selv om det er mulig, preclearing brystepitelet i post-avvenning rotter er ikke så mye utført, hovedsakelig på grunn av ineffektivitet av å rydde det voksende pattedyrtreet i post-avvenning rotter. Siden det har vist seg at regioner av fettvev andre steder i kroppen kan støtte veksten av transplantert brystepitel21,23,24, kan prosessen med preclearing lett unngås hos rotter ved podevev inn i interscapular hvit fett pute.

Transplantasjonsmetoden beskrevet i dette papiret innebærer injeksjon av enzymatically dissosiert brystkjertel organoider (fragmenter av brystkanalepitelepitel og andre celler typer i stand til morfose) eller monodispergerte celler i interscapular fett pad innavlet, isogene eller congene stammer av laboratorierotter2. Fordi interscapular fett pad er normalt blottet for brystvev, det gir et passende miljø for flere transplantasjon nettsteder uten å måtte pre-klare endogene epitel. Som et resultat er vertsdyrets endogene, abdominal-inguinal brystkjertler ikke gjenstand for kirurgisk manipulasjon, utvikler seg normalt, og kan ikke forstyrre tolkningen av resultatene. I tillegg kan de intakte brystkjertlene brukes til sammenligning for å evaluere vertsversus donoreffekter på brystepitelutviklingen og tumorigenese18,25. Selv om gjenpopulasjon av brystkjertelen fra en enkelt stamcelle er tilgjengelig for mus, er den ennå ikke utviklet for rotte, hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelighet av antistoffer for å velge for rottebryststamceller25,26,27. Til tross for dette, transplantasjon av monodispersed bryst epitelceller for å kvantifisere repopulating potensialet kan utføres, og disse cellene vil utvikle seg normalt når podet inn i riktig rammeverk2,3,4. Mens organoider er gode for mange formål, er monodispergerte celler nødvendig for kvantitative anvendelser, for eksempel for å bestemme antall pattedyr epitelceller som kreves for kreftinitiering etter ioniserende strålebehandling28 eller for å sammenligne egenskapene til strømningcytometrisk valgt brystepitelcellepopulasjoner29.

Til dags dato er prosedyren som er beskrevet her den mest robuste metoden for å utføre brystkjerteltransplantasjon i rotten med et overordnet mål om å studere brystkjertelutvikling og mekanismer underliggende brystkreftutvikling. Ofte blir donor- og/eller mottakerdyrene utsatt for forskjellige variabler før, under eller etter epiteltransplantasjonen. Eksempler inkluderer enkeltgenstudier som involverer kjemisk karsinogenese30,stråling28,31,32, genetisk manipulering av vert / donor genom18,og hormonell manipulasjon12. En stor fordel med enzymatisk dissosiasjon beskrevet i denne protokollen er muligheten til å isolere epitelorganoider eller monodiserte celler for komplementære eksperimenter som involverer flytcytometri, 3D-kultur, genredigering og mer. Fremtidige anvendelser av denne teknikken vil omfatte ytterligere manipulering av donor og / eller vertsvev med genteknologi. Donorceller kan for eksempel endres genetisk ex vivo ved en valgt genomisk locus ved hjelp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. På samme måte kan mottakerrotter også endres genetisk for å studere samspillet mellom donor- og mottakerkonstruerte genetiske faktorer.

Protocol

Alle dyr ble plassert og vedlikeholdt i et AAALAC-godkjent anlegg, og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble godkjent av MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dyr for bruk i gjensidig transplantasjon bør være en innavlet eller isogen belastning, med congenic status foretrukket eller backcrossed i minst 6 generasjoner. 1. Høsting donor rotte brystkjertel epitel Bestem antall donorrotter som trengs for transplantasjon.MERK: Vanligvis kan 1 donorrotte (…

Representative Results

Donor og mottaker brystkjertlerTrinnene for å isolere og forberede rottepattedyrepitelceller for transplantasjon er vist i figur 1A. Ved 4 ukers alder har den endogene brystkjertelen til donorrotten begynt modning og epitel kan visualiseres på hele monterte lysbilder farget med alumkarmin (Figur 1B). En donorrotte i denne alderen vil gi ca 1 x 1…

Discussion

Denne protokollen beskriver en epitelcelletransplantasjonsteknikk optimalisert for arbeid med rotter. Isolert pattedyr epitelial organoider fra donorrotter (3-5 uker) er podet inn i interscapular hvit fett pad av mottaker rotter (også 3-5 uker av alder). Resultatene kan tolkes så lite som 4-6 uker senere, ved hjelp av lysmikroskopi for å undersøke det transplanterte vevet; Men den optimale tiden mellom transplantasjon og offer må bestemmes før du implementerer et fullt eksperiment. Hvis det er for lite eller for my…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av Hollings Cancer Center’s Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilotforskningsfinansiering fra National Institutes of Health (https://www.nih.gov/),og midler fra Department of Pathology & Laboratory Medicine ved Medical University of South Carolina. Vi vil takke Marijne Smiths for å ha spilt inn intervjuuttalelsene.

Materials

0.2 µM syringe filters Fisher Scientific 09-715G sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 05-408-129 containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers Corning 431752 filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles Hamilton 81001 & 90525 For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube Falcon (Corning) 352196 brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers Corning 431750 filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes Fisher Scientific 05-539-6 for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes Thermo Scientific 130181 for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate Sigma-Aldrich 243361/237086 staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use follow institutional protocol
Beta-dine or iodine
Borosilicate glass culture tube for homogenization Fisher Scientific 14-961-26 for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine Sigma-Aldrich C6152/1022 staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus
Clean animal cages for recovery follow institutional protocol
Collagenase Type 3 Worthington Biochemical Corp. LS004183 enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water for chemical solutions
DMEM/F12 GIBCO 11320033 for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2705/2701 mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone inactivation solution
Gauze
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-212 use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS GIBCO monodispersion mixture
Heating pads follow institutional protocol
Ice buckets (x2)
Incubator with orbital rotation must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia follow institutional protocol
Light microscope or digital camera visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer Fisher Scientific TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure Sigma-Aldrich/ ACROS Organics 8042-47-5 long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes
Positively-charged microscope slides Thermo Scientific P4981-001 mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic Institutional protocol
Scale body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver electric clippers, or other
Staining jars minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes IMCO 4410-IMC used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater) for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin Worthington monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)
Wound clip applier, clips, and removal tool Fine Science Tools 12020-00 Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 clearing mammary gland whole mount slides after staining

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J., DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., Rubin, E., Damjanov, I., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. , 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J., Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).

Play Video

Cite This Article
Shunkwiler, L. B., Haag, J. D., Gould, M. N., Smits, B. M. G. Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad. J. Vis. Exp. (157), e60401, doi:10.3791/60401 (2020).

View Video