Rotte mammary epitelcelletransplantasjon i Interscapular Hvit Fett Pad

Summary

Denne artikkelen beskriver en transplantasjonsmetode for å pode donor rottepattedyr epitelceller i interscapular hvit fett pute av mottakerdyr. Denne metoden kan brukes til å undersøke verts- og/eller donoreffekter på brystepitelutvikling og eliminerer behovet for forhåndsrensing, og dermed utvider nytten av denne teknikken.

Abstract

Så tidlig som på 1970-tallet har forskere vellykket transplantert brystepitelceller i interscapular hvit fett pute av rotter. Podebrystepitel ved hjelp av transplantasjonsteknikker utnytter det hormonelle miljøet som tilbys av den unge gnagerverten. Disse studiene er ideelt egnet til å utforske virkningen av ulike biologiske manipulasjoner på brystkjertelutvikling og dissekere mange aspekter av brystkjertelbiologi. En vanlig, men begrensende, funksjon er at transplanterte epitelceller er sterkt påvirket av den omkringliggende stroma og utkonkurrert av endogene epitel; for å utnytte innfødt brystvev, må abdominal-inguinal hvit fett pute fjernes for å fjerne vert brystepitel før transplantasjon. Et stort hinder når du bruker rottemodellorganismen er at å rydde det utviklende brysttreet i post-avvennede rotter ikke er effektivt. Når transplanteres inn i kjertelfrie fettpads, kan donorepitelceller fylle den ryddet vertsfettputen og danne en funksjonell brystkjertel. Interscapular fett pad er et alternativ sted for disse grafts. En stor fordel er at den mangler kanalstrukturer, men gir den normale stroma som er nødvendig for å fremme epitelutvekst og er lett tilgjengelig i rotten. En annen stor fordel med denne teknikken er at den er minimalt invasiv, fordi det eliminerer behovet for å cauterize og fjerne det voksende endogene pattedyrtreet. I tillegg inneholder interscapular fettputen et medial blodkar som kan brukes til å skille steder for pode. Fordi endogene kjertler forblir intakte, kan denne teknikken også brukes til studier som sammenligner endogene brystkjertel med den transplanterte kjertelen. Dette papiret beskriver metoden for pattedyr epitelcelletransplantasjon i interscapular hvit fett pute av rotter.

Introduction

Postnatal brystkjertelutvikling og ductal morfolever er prosesser som i stor grad påvirkes av hormonell signalering ved utbruddet av puberteten. Hos mus og rotter, ofte brukte modellorganismer av brystkjertelbiologi, begynner denne prosessen rundt 3 uker, hvor rask spredning og differensiering resulterer i dannelsen av det modne parenchymaet. Den modne brystkjertelen kan gjennomgå mange runder med ekspansjon og involution, en eiendom som har vært under etterforskning siden tidlig på 1900-tallet. Innenfor rammen av hyperproliferasjon og kreftutvikling ble brystkjerteltransplantasjonsteknikker utviklet på 1950-tallet^1,og forbedret av den kvantitative metodikken bidratt av Gould et al. i 1977^2,3,4. Raffinement av transplantasjonsteknikken hos gnagere har bidratt til store fremskritt i forståelsen av normal brystkjertelbiologi som fortsatt er mye brukt til å studere effekten av ulike behandlinger og genetisk manipulasjon på normal brystkjertelutvikling og sykdomstilstander.

Mange hypoteser har blitt generert og senere testet ved hjelp av brystkjerteltransplantasjon, først beskrevet av DeOme et al. i 1959¹. Eksperimenter over flere tiår viste tilbøyelighet en ductal vev utskåret fra donor brystkjertler å befolke hele fett pad^5,6,7 og indikerte at en kritisk komponent av brystkjertel utvikling ligger i disse epitelstrukturer. Senere studier på mus viste at en enkelt bryststamcelle kan befolke en ryddet fettpute og bidro til oppdagelsen av en enkelt, vanlig stamfar av basal og luminal brystepitelceller^8,9,10. I tråd med disse konklusjonene har det blitt foreslått at transplantasjon øker bassenget av celler med multilineage-repopulating potensial som følge av plastisitet, slik at de transplanterte cellene å vokse en funksjonell brystkjertel^{7,10,11,12,13}. Viktigere, bruk av transplantasjon teknikker i gnagere overvinner begrensningene av cellekultur-indusert abnormiteter¹⁴ og gir ofte resultater i løpet av bare noen uker.

Mens prosedyren opprinnelig ble beskrevet i sammenheng med preneoplastiske lesjoner hos mus, ble den snart utvidet til rotter og brukt sammen med kreftfremkallende behandling for å etablere mangfold som et mål på kreftmottakelighet¹⁵, men populariteten til transplantasjonsteknikker har fulgt utviklingen av genetiske verktøy for hver art. Selv om musestudier som omfatter transplantasjon har bidratt med mange translasjonelle funn, ligner parenchyma av rottebrystkjertelen mennesket tettere^16,17 og tilbyr forskjellige fordeler for å studere østrogen reseptor-positiv (ER+) brystkreft. Brystsvulster er ududige i begge artene, men de varierer i form av hormonfølsomhet og genuttrykksprofiler. En primær forskjell er at rottebrystsvulster uttrykker og avhenger av funksjonen til ovarie- og hypofysenhormonreseptorer, nemlig østrogen og progesteron (PR), som ligner på luminal-A-undertypen av human brystkreft. Faktisk har pattedyr epitelcelletransplantasjon, som beskrevet i denne protokollen, blitt brukt til å studere genetiske varianter involvert i brystkreft og bestemme cellulær autonomi av effekter på brystepitelceller¹⁸.

I tillegg til tumorbiologien viser det kanalepitelet til den normale rottebrystkjertelen et høyere nivå av forgrening og flankeres av et tykkere lag av stroma enn musen. Betydningen av stroma er godt dokumentert i mammary epiteltransplantasjon studier. Brystepitel må samhandle med fet stroma, og ideelt sett sin egen mesenchyme, for å gjennomgå sin karakteristiske morfose^19,20. Podevev i en mottakerbrystkjertel gir et optimalt miljø; Imidlertid kan tilstedeværelsen av endogene epitel forstyrre resultatene. Preclearing brystkjertelen av endogene epitel utføres vanligvis i musetransplantasjon analyser og krever kirurgisk eksisjon av endogene brystvev og / eller fjerning av brystvorten^1,21,22. Selv om det er mulig, preclearing brystepitelet i post-avvenning rotter er ikke så mye utført, hovedsakelig på grunn av ineffektivitet av å rydde det voksende pattedyrtreet i post-avvenning rotter. Siden det har vist seg at regioner av fettvev andre steder i kroppen kan støtte veksten av transplantert brystepitel^21,23,24, kan prosessen med preclearing lett unngås hos rotter ved podevev inn i interscapular hvit fett pute.

Transplantasjonsmetoden beskrevet i dette papiret innebærer injeksjon av enzymatically dissosiert brystkjertel organoider (fragmenter av brystkanalepitelepitel og andre celler typer i stand til morfose) eller monodispergerte celler i interscapular fett pad innavlet, isogene eller congene stammer av laboratorierotter². Fordi interscapular fett pad er normalt blottet for brystvev, det gir et passende miljø for flere transplantasjon nettsteder uten å måtte pre-klare endogene epitel. Som et resultat er vertsdyrets endogene, abdominal-inguinal brystkjertler ikke gjenstand for kirurgisk manipulasjon, utvikler seg normalt, og kan ikke forstyrre tolkningen av resultatene. I tillegg kan de intakte brystkjertlene brukes til sammenligning for å evaluere vertsversus donoreffekter på brystepitelutviklingen og tumorigenese^18,25. Selv om gjenpopulasjon av brystkjertelen fra en enkelt stamcelle er tilgjengelig for mus, er den ennå ikke utviklet for rotte, hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelighet av antistoffer for å velge for rottebryststamceller^25,26,27. Til tross for dette, transplantasjon av monodispersed bryst epitelceller for å kvantifisere repopulating potensialet kan utføres, og disse cellene vil utvikle seg normalt når podet inn i riktig rammeverk^2,3,4. Mens organoider er gode for mange formål, er monodispergerte celler nødvendig for kvantitative anvendelser, for eksempel for å bestemme antall pattedyr epitelceller som kreves for kreftinitiering etter ioniserende strålebehandling²⁸ eller for å sammenligne egenskapene til strømningcytometrisk valgt brystepitelcellepopulasjoner²⁹.

Til dags dato er prosedyren som er beskrevet her den mest robuste metoden for å utføre brystkjerteltransplantasjon i rotten med et overordnet mål om å studere brystkjertelutvikling og mekanismer underliggende brystkreftutvikling. Ofte blir donor- og/eller mottakerdyrene utsatt for forskjellige variabler før, under eller etter epiteltransplantasjonen. Eksempler inkluderer enkeltgenstudier som involverer kjemisk karsinogenese^30,stråling^28,31,32, genetisk manipulering av vert / donor genom^18,og hormonell manipulasjon¹². En stor fordel med enzymatisk dissosiasjon beskrevet i denne protokollen er muligheten til å isolere epitelorganoider eller monodiserte celler for komplementære eksperimenter som involverer flytcytometri, 3D-kultur, genredigering og mer. Fremtidige anvendelser av denne teknikken vil omfatte ytterligere manipulering av donor og / eller vertsvev med genteknologi. Donorceller kan for eksempel endres genetisk ex vivo ved en valgt genomisk locus ved hjelp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. På samme måte kan mottakerrotter også endres genetisk for å studere samspillet mellom donor- og mottakerkonstruerte genetiske faktorer.

Protocol

Alle dyr ble plassert og vedlikeholdt i et AAALAC-godkjent anlegg, og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble godkjent av MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dyr for bruk i gjensidig transplantasjon bør være en innavlet eller isogen belastning, med congenic status foretrukket eller backcrossed i minst 6 generasjoner. 1. Høsting donor rotte brystkjertel epitel Bestem antall donorrotter som trengs for transplantasjon.MERK: Vanligvis kan 1 donorrotte (…

Representative Results

Donor og mottaker brystkjertlerTrinnene for å isolere og forberede rottepattedyrepitelceller for transplantasjon er vist i figur 1A. Ved 4 ukers alder har den endogene brystkjertelen til donorrotten begynt modning og epitel kan visualiseres på hele monterte lysbilder farget med alumkarmin (Figur 1B). En donorrotte i denne alderen vil gi ca 1 x 1…

Discussion

Denne protokollen beskriver en epitelcelletransplantasjonsteknikk optimalisert for arbeid med rotter. Isolert pattedyr epitelial organoider fra donorrotter (3-5 uker) er podet inn i interscapular hvit fett pad av mottaker rotter (også 3-5 uker av alder). Resultatene kan tolkes så lite som 4-6 uker senere, ved hjelp av lysmikroskopi for å undersøke det transplanterte vevet; Men den optimale tiden mellom transplantasjon og offer må bestemmes før du implementerer et fullt eksperiment. Hvis det er for lite eller for my…

Materials

0.2 µM syringe filters	Fisher Scientific	09-715G	sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)	Fisher Scientific	05-408-129	containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers	Corning	431752	filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles	Hamilton	81001 & 90525	For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette	–	–	transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube	Falcon (Corning)	352196	brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers	Corning	431750	filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes	Fisher Scientific	05-539-6	for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes	Thermo Scientific	130181	for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate	Sigma-Aldrich	243361/237086	staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use	–	–	follow institutional protocol
Beta-dine or iodine	–	–
Borosilicate glass culture tube for homogenization	Fisher Scientific	14-961-26	for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine	Sigma-Aldrich	C6152/1022	staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus	–	–
Clean animal cages for recovery	–	–	follow institutional protocol
Collagenase Type 3	Worthington Biochemical Corp.	LS004183	enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water	–	–	for chemical solutions
DMEM/F12	GIBCO	11320033	for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA	–	–	monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2705/2701	mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	–	inactivation solution
Gauze	–	–
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS	GIBCO	–	monodispersion mixture
Heating pads	–	–	follow institutional protocol
Ice buckets (x2)	–	–
Incubator with orbital rotation	–	–	must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia	–	–	follow institutional protocol
Light microscope or digital camera	–	–	visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer	Fisher Scientific	–	TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure	Sigma-Aldrich/ ACROS Organics	8042-47-5	long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer	–	–	follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes	–	–
Positively-charged microscope slides	Thermo Scientific	P4981-001	mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic	–	–	Institutional protocol
Scale			body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver	–	–	electric clippers, or other
Staining jars	–	–	minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes	IMCO	4410-IMC	used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)	–	–	autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)	–	–	for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin	Worthington		monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)	–	–
Wound clip applier, clips, and removal tool	Fine Science Tools	12020-00	Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes	Fisher Scientific	X3S-4	clearing mammary gland whole mount slides after staining