Summary
Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.
Abstract
Ya en la década de 1970, los investigadores han trasplantado con éxito las células epiteliales mamarias a la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas. El injerto de epitelio mamario mediante técnicas de trasplante aprovecha el entorno hormonal proporcionado por el huésped adolescente. Estos estudios son ideales para explorar el impacto de varias manipulaciones biológicas en el desarrollo de la glándula mamaria y diseccionar muchos aspectos de la biología de la glándula mamaria. Una característica común, pero limitante, es que las células epiteliales trasplantadas están fuertemente influenciadas por el estroma circundante y son sube a la competencia por epitelio endógeno; para utilizar tejido mamario nativo, la almohadilla de grasa blanca abdominal-inguinal debe eliminarse para eliminar el epitelio mamario huésped antes del trasplante. Un obstáculo importante cuando se utiliza el organismo modelo de rata es que limpiar el árbol mamario en desarrollo en ratas post-dedianas no es eficiente. Cuando se trasplantan en almohadillas de grasa libres de glándulas, las células epiteliales del donante pueden repoblar la almohadilla de grasa del huésped limpiada y formar una glándula mamaria funcional. La almohadilla de grasa interescapular es un lugar alternativo para estos injertos. Una ventaja importante es que carece de estructuras ductales, pero proporciona el estroma normal que es necesario para promover el crecimiento epitelial y es fácilmente accesible en la rata. Otra ventaja importante de esta técnica es que es mínimamente invasiva, ya que elimina la necesidad de cauterizar y eliminar el creciente árbol mamario endógeno. Además, la almohadilla de grasa interescapular contiene un vaso sanguíneo medial que se puede utilizar para separar sitios para el injerto. Debido a que las glándulas endógenas permanecen intactas, esta técnica también se puede utilizar para estudios que comparan la glándula mamaria endógena con la glándula trasplantada. Este artículo describe el método de trasplante de células epiteliales mamarias en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas.
Introduction
El desarrollo de la glándula mamaria postnatal y la morfogénesis ductal son procesos influenciados en gran medida por la señalización hormonal al inicio de la pubertad. En ratones y ratas, comúnmente utilizados organismos modelo de la biología de la glándula mamaria, este proceso comienza alrededor de 3 semanas de edad, donde la rápida proliferación y diferenciación resultan en la formación del parénquima maduro. La glándula mamaria madura puede sufrir numerosas rondas de expansión e involución, una propiedad que ha estado siendo investigada desde principios delsiglo XX. En el contexto de la hiperproliferación y el desarrollo del cáncer, las técnicas de trasplante de glándulas mamarias se desarrollaron en la década de 19501,y se mejoraron con la metodología cuantitativa aportada por Gould et al. en 19772,3,4. El refinamiento de la técnica de trasplante en roedores ha contribuido a grandes avances en la comprensión de la biología normal de la glándula mamaria que todavía se utilizan ampliamente para estudiar el efecto de varios tratamientos y la manipulación genética en el desarrollo normal de la glándula mamaria y los estados de enfermedad.
Muchas hipótesis se han generado y probado posteriormente utilizando el trasplante de glándulas mamarias, descrito por primera vez por DeOme et al. en 19591. Los experimentos a lo largo de varias décadas mostraron la propensión del tejido ducal extirpado de las glándulas mamarias del donante a repoblar toda la almohadilla de grasa5,6,7 e indicaron que un componente crítico del desarrollo de la glándula mamaria reside en estas estructuras epiteliales. Estudios posteriores en ratones mostraron que una sola célula madre mamaria puede repoblar una almohadilla de grasa aclarada y contribuyó al descubrimiento de un progenitor único y común de células epiteliales mamarias basales y luminales8,9,10. En línea con estas conclusiones, se ha sugerido que el trasplante aumenta el conjunto de células con potencial de repoblación multilineaje como resultado de la plasticidad, permitiendo que las células injertadas crezcan una glándula mamaria funcional7,10,11,12,13. Es importante destacar que el uso de técnicas de trasplante en roedores supera las limitaciones de las anomalías inducidas por el cultivo celular14 y a menudo proporciona resultados en cuestión de semanas.
Mientras que el procedimiento fue descrito originalmente en el contexto de lesiones preneoplásicas en ratones, pronto se amplió a ratas y se utilizó junto con el tratamiento de carcinógenos para establecer la multiplicidad como una medida de la susceptibilidad al cáncer15,pero la popularidad de las técnicas de trasplante ha seguido el desarrollo de herramientas genéticas para cada especie. Aunque los estudios de ratón que incorporan trasplantes han contribuido con muchos hallazgos traslacionales, el parénquima de la glándula mamaria de la rata se asemeja más al humano más de16,17 y ofrece ventajas distintas para el estudio del cáncer de mama receptor-positivo de estrógeno (ER+). Los tumores mamarios son inducibles en ambas especies, pero difieren en términos de sensibilidad hormonal y perfiles de expresión génica. Una diferencia principal es que los tumores mamarios de ratas expresan y dependen de la función de los receptores de hormonas ováricas y pituitarias, a saber, estrógeno y progesterona (PR), similar al subtipo luminal-A del cáncer de mama humano. De hecho, el trasplante de células epiteliales mamarias, como se describe en este protocolo, se ha utilizado para estudiar las variantes genéticas implicadas en el cáncer de mama y determinar la autonomía celular de los efectos sobre las células epiteliales mamarias18.
Además de la biología tumoral, el epitelio ductal de la glándula mamaria de rata normal presenta un nivel más alto de ramificación y está flanqueado por una capa más gruesa de estroma que el ratón. La importancia del estroma está bien documentada en estudios de trasplante epitelial mamario. El epitelio mamario debe interactuar con el estroma graso, e idealmente su propio mesenquima, para someterse a su característica morfogénesis19,20. El injerto de tejido en una glándula mamaria receptora proporciona un ambiente óptimo; sin embargo, la presencia de epitelio endógeno puede interferir con los resultados. La prelimpieza de la glándula mamaria del epitelio endógeno se realiza comúnmente en ensayos de trasplante de ratón y requiere la escisión quirúrgica del tejido mamario endógeno y/o la extirpación del pezón1,21,22. Aunque es posible, prelimpiar el epitelio mamario en ratas post-destetaderas no es tan ampliamente realizado, principalmente debido a la ineficacia de limpiar el árbol mamario en crecimiento en ratas post-destete. Dado que se ha demostrado que las regiones de tejido adiposo en otras partes del cuerpo podrían apoyar el crecimiento del epitelio mamario trasplantado21,23,24, el proceso de prelimpieza se puede evitar fácilmente en ratas injertando tejido en la almohadilla de grasa blanca interescapular.
El método de trasplante descrito en este documento consiste en la inyección de organoides de la glándula mamaria disociadas enzimáticamente (fragmentos de epitelio ductal mamario y otros tipos de células capaces de morfogénesis) o células monodispersas en la almohadilla de grasa interescapular en cepas endogámicas, isogénicas o congénicas de ratas de laboratorio2. Debido a que la almohadilla de grasa interescapular normalmente está desprovista de tejido mamario, proporciona un entorno adecuado para múltiples sitios de trasplante sin la necesidad de pre-borrar epitelio endógeno. Como resultado, las glándulas mamarias endógenas, de la inguinal abdominal-inguinal del animal huésped no están sujetas a manipulación quirúrgica, se desarrollan normalmente y no pueden interferir con la interpretación de los resultados. Además, las glándulas mamarias intactas se pueden utilizar para la comparación para evaluar los efectos del huésped frente al donante en el desarrollo del epitelio mamario y la tumorigenesis18,25. Aunque la repoblación de la glándula mamaria a partir de una sola célula madre está disponible para ratones, todavía no se ha desarrollado para ratas, principalmente debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos para seleccionar para las células madre mamarias de rata25,26,27. A pesar de esto, el trasplante de células epiteliales mamarias monodispersas para cuantificar el potencial de repoblación se puede realizar con éxito, y esas células se desarrollarán normalmente cuando se injerten en el marco apropiado2,3,4. Si bien los organoides son buenos para muchos propósitos, se requieren células monodispersas para aplicaciones cuantitativas, por ejemplo, para determinar el número de células epiteliales mamarias necesarias para la iniciación del cáncer tras el tratamiento de radiación ionizante28 o para comparar las características de las poblaciones de células epiteliales mamarias seleccionadas citométricamente29.
Hasta la fecha, el procedimiento descrito aquí es el método más robusto para realizar el trasplante de glándula sómariaense en la rata con un objetivo general de estudiar el desarrollo de la glándula mamaria y los mecanismos subyacentes al desarrollo del cáncer de mama. A menudo, el donante y/o los animales receptores están expuestos a diferentes variables antes, durante o después del trasplante epitelial. Algunos ejemplos son los estudios de un solo gen que implican carcinogénesis química30,radiación28,31,32,manipulación genética del genoma del huésped/donante18y manipulación hormonal12. Una de las principales ventajas de la disociación enzimática descrita en este protocolo es la oportunidad de aislar organoides epiteliales o células monodispersas para experimentos complementarios que implican citometría de flujo, cultivo 3D, edición de genes y más. Las aplicaciones futuras de esta técnica incluirán la manipulación adicional del donante y/o tejido huésped con ingeniería genética. Por ejemplo, las células del donante pueden ser alteradas genéticamente ex vivo en cualquier locus genómico elegido utilizando el sistema de edición de genes CRISPR-Cas9. Del mismo modo, las ratas receptoras también pueden ser alteradas genéticamente para estudiar la interacción entre los factores genéticos diseñados por donantes y receptores.
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Protocol
Todos los animales fueron alojados y mantenidos en una instalación aprobada por la AAALAC, y los experimentos descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) MUSC. Los animales para su uso en trasplantes recíprocos deben ser una cepa endogámica o isogénica, con estado congénico preferido o cruzado durante al menos 6 generaciones.
1. Cosecha de epitelio de la glándula mamaria de la rata donante
- Determinar el número de ratas donantes necesarias para el trasplante.
NOTA: Generalmente, 1 rata donante (4 semanas de edad) puede proporcionar suficientes células para el trasplante en 4 animales receptores. Ciertas aplicaciones de este protocolo requerirán un número adicional de celdas, y puede haber diferencias específicas de tensión en el rendimiento total. - Etiquete todos los suministros y asegúrese de que el cirujano pueda acceder a un lugar accesible(Tabla 1).
- Registre el peso corporal de cada rata donante hembra. Siga las pautas institucionales para anestesiar o eutanasiar a la rata donante. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Mueva al animal al campo quirúrgico estéril. Coloque al animal en su espalda y rocíe toda la superficie ventral con 70% de etanol.
- Hacer una incisión sagital, en forma de X, permitiendo el acceso a las glándulas mamarias torácicas, abdominales e inguinales. Diseccionar todo el tejido de la glándula mamaria de la rata donante usando tijeras (Figura 1). Retire todos los ganglios linfáticos visibles.
- Extraiga el tejido mamario con fórceps y colóquelo en un plato etiquetado de 60 mm sobre hielo. Agregue 500 ml de medios DMEM/F12 sin suero a la placa de 60 mm. Ajuste la colocación del tejido de la glándula mamaria para que permanezca completamente húmedo.
- Picar finamente el tejido mamario usando tijeras. Para ello, cortar el tejido en trozos de 1-2 mm3 de tamaño(Figura 1C). Mantener la glándula sobre hielo hasta que se haya cosechado todo el tejido del donante (no exceda los 60 min).
NOTA: El personal adicional puede picar las glándulas mamarias y preparar adicionalmente la solución de colagenasa mientras el cirujano procede con las extracciones de tejido.
2. Extraer tejido cerebral de donantes eutanasiados
- Gire cuidadosamente el cuerpo del animal donante para colocarlo en una posición propensa. Asegure con alfileres. Rocíe la cabeza y la parte superior de la espalda con 70% de etanol.
- Localice la base del cráneo y haga una incisión debajo de los cóndilos occipitales. Inserte tijeras afiladas debajo de la piel y corte la piel lejos del cráneo, incluidos los lados de la cabeza.
- Utilice cortadores de huesos o tijeras fuertes para cortar el cráneo a lo largo de la línea media, desde el occipital hasta los huesos frontales. Mantenga la hoja lo más superficial posible y angulo hacia arriba para evitar la destrucción del tejido cerebral subyacente.
- Pelar el hueso usando rongeurs o fórceps fuertes. Inserte la herramienta lateral al cerebelo para romper el hueso a cada lado, exponiendo el canal auditivo óseo. Cortar las conexiones a las meninges.
- Levante suavemente el cerebro con fórceps curvos de punta fina. Coloque el cerebro en un pedazo de papel de aluminio y registre el peso, y luego transfiera inmediatamente a un tubo de 15 ml con una cantidad igual (w:v) de medios, almacenado en hielo.
- Opcionalmente, utilice fórceps de punta fina para extraer la glándula pituitaria (ubicada debajo del cerebro) para uso adicional en el procedimiento de trasplante, si es necesario.
- Utilice un homogeneizador mecánico para interrumpir el tejido. Homogeneizar el cerebro durante 10-15 s a baja velocidad. Dejar que la mezcla se sente en hielo durante al menos 1 min, y luego homogeneizar de nuevo. La homogeneización es suficiente cuando la mezcla final está libre de piezas grandes.
- Filtrar el homogeneato pasándolo a través de un filtro de 100 m. Mantenga el filtrado sobre hielo hasta su uso (menos de 4 h).
3. Digestión y procesamiento de extractos de glándula mamaria
- Descongelar o calentar los reactivos indicados(Tabla 1). Siga los pasos adecuados para recuperar organoides o células monodispersas.
- Preparar 10 ml de medios de digestión libres de suero (sin colagenasa) para cada animal donante(Archivo Suplementario 1).
NOTA: El volumen de los medios de digestión utilizados se puede ajustar (escalado hacia arriba o hacia abajo) para acomodar el tejido agrupado, si corresponde.- Para organoides, vaya a 3.3.
- Para células monodispersas, prepare una nueva mezcla de monodispersión y solución de inactivación(Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3),además de los medios de digestión de la colagenasa libres de suero. Continúe con el paso 3.3.
- Cuando todo el tejido mamario de los donantes se haya extraído y picado, agregue la enzima colagenasa al medio de digestión caliente (o temperatura ambiente)(Archivo Suplementario 1). Mezclar invirtiendo.
- Pasar los medios de digestión de la colagenasa a través de un filtro de 20 m. Dispensar 10 ml de medios filtrados en los tubos etiquetados de 50 ml para la digestión.
- Utilice una nueva punta de pipeta de 1.000 ml para cada muestra y transfiera el tejido del donante picado de cada plato de 60 mm al tubo de digestión de la colagenasa. Corte 1 cm del extremo de una punta de 1.000 l y colóquela manualmente en el dispositivo antes de su uso. Mezcle suavemente el tejido picado pipeteando hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces.
NOTA: Si el tejido es difícil de pipetear durante la transferencia, utilice una pequeña cantidad de los medios de digestión de la colagenasa del tubo de 50 ml y, a continuación, transfiera de nuevo. - Colocar las muestras en posición horizontal en una incubadora de agitación y permitir que las muestras digeryen 1,5-2 h a 37 oC, 200-220 rpm.
- Para organoides, vaya a 3.7.
- Para las células monodispersas añadir DNase I (0,2 g/ml) a la mezcla durante los últimos 10 minutos de la digestión. Incubar como antes, con agitación vigorosa. Continúe con el paso 3.7.
- Cuando el tejido esté completamente digerido, pelete la suspensión utilizando centrifugación en frío (4 oC) durante 10 min a 1.200 x g (Figura 1D).
NOTA: Mantenga los tubos en el hielo entre cada paso para aumentar la viabilidad de las células. - Asegúrese de que se ha formado un pellet, y luego verter cuidadosamente la capa de sobrenadante y grasa. Resuspenda suavemente el pellet en 10 ml de medios dMEM/F12 frescos.
- Gire brevemente a 68 x g durante aproximadamente 10 s. La longitud del giro (pero no la velocidad) puede aumentarse si no hay una separación clara de las células. Inspeccione visualmente el pellet antes de continuar(Figura 1D).
- Retire con cuidado el sobrenadante, dejando atrás un pequeño volumen. Continúe con el siguiente paso, en función de si se necesitan organoides o células monodispersas.
NOTA Es importante dejar un pequeño volumen de medios en el tubo porque el pellet estará muy suelto. El volumen residual de los medios se diluirá a través de pasos de lavado.- Para organoides, añada otro volumen de 10 ml de medios DMEM/F12 y repita el lavado/espín. Después del segundo lavado, resuspenda las células en un volumen más pequeño (1-2 ml) de medios DMEM/F12 para la filtración. Continúe con el paso 3.11.
- Para células monodispersas, disolver en 2 ml de HBSS precalentado con 0.025% (p/v) Trypsin y 6.8 mM EDTA. Digerir durante 3-5 min a 37oC. Inactivar inmediatamente.
- Agregue 4 mL de DMEM/F12 con 10% FBS para detener la inactivación de la trippsina.
- Gire las células a 270 x g durante 5 min y, a continuación, resuspenda en DMEM/F12 con 10% FBS de nuevo. Continúe con el paso 3.11 para filtrar las celdas.
- Filtrar las células usando un colador de células de 40 m colocado en un nuevo tubo de 50 ml. Humedezca previamente el colador pipeteando 1 ml del mismo medio base utilizado para suspender las células, y luego pase la suspensión celular a través del filtro utilizando una pipeta para recoger fragmentos ducales/organoides.
NOTA: El rendimiento aproximado del epitelio filtrado del tejido de la glándula mamaria de una sola rata donante de 4 semanas de edad es de 1 x 106 células.- En el caso de los organoides, deseche el filtrado. Los organoides mamarios permanecerán dentro de la cesta del colador celular y se eliminarán las células más pequeñas y no deseadas. Invierta el colador de células sobre un nuevo tubo de 50 ml y enjuague con cualquier volumen necesario para recoger las células. Continúe con el paso 3.12.
- Para las células monodispersas, deseche el colador de células y mantenga el filtrado porque las células epiteliales mamarias pasarán a través del filtro, junto con células estromales e inmunitarias más pequeñas. Enjuague el tubo que se utilizó para la digestión/centrifugación con otro volumen de DMEM/F12 con 10% FBS y pase a través del mismo colador celular. Pellet las células monodispersas por centrifugación a 1.200 x g durante 5 min. Proceder al paso 3.12.
NOTA: Las celdas resuspendidas están listas para aplicaciones posteriores.
- Pulse girar la solución y asegurar la formación de un pellet celular antes de proceder al siguiente paso. Pulse girar de nuevo, si es necesario.
- Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspenda el pellet en un volumen pequeño (1.000-2.000 l de DMEM/F12) para concentrar las células para el recuento.
- Cuente las células y diluya si es necesario. Resuspender el número deseado de células para el trasplante en 20 l de medios DMEM/F12 para cada animal. Mantenga siempre las células en el hielo.
NOTA: Se requerirán recuentos de células de donantes en el rango de 1 x 105 - 1 x 106 células para cada sitio de injerto basado en el punto final del estudio. Por ejemplo, los experimentos de carcinogénesis a menudo requieren un mayor número de células trasplantadas, en relación con otras aplicaciones. El número de células necesarias debe determinarse experimentalmente para cada cepa. El procedimiento descrito en este protocolo utilizó 250.000 células de donante en medios de 20 ml por sitio de injerto, antes de mezclarse con homogeneización cerebral, como se describe en el paso 3.16. - Preparar cualquier alícuota(s) de células necesarias para otros experimentos (por ejemplo, aislamiento FACS3,26,27,30,33).
- Para organoides, proceda al paso 3.16.
- Para las células monodispersas, cuantifique las células viables usando Tinción azul trypan o metileno, y luego proceda.
- Preparar lotes individuales de material de donante para todos los receptores del trasplante. Combinar volúmenes iguales de la suspensión celular (20 l) con un 50% de homogeneización cerebral (20 l) para cada sitio de trasplante.
NOTA: Se inyectará un total de 40 ml por sitio en cada sitio, pero se recomienda incluir un mínimo del 25% de volumen adicional para los residuos. - Proceder inmediatamente al trasplante o congelar células para el trasplante más tarde (punto de parada potencial).
NOTA: Las células congeladas no se han probado con este protocolo y requerirán optimización antes de generar una cohorte de animales para experimentos de trasplante. Se recomienda encarecidamente trasplantar células frescas.
4. Procedimiento de trasplante (ratas receptoras de 4-5 semanas de edad)
- Pesar cada rata receptora y calcular la dosis correcta de analgésico aprobado que se utilizará en el procedimiento.
NOTA: Los pesos corporales se pueden medir hasta 24 horas antes del procedimiento. Siga las pautas institucionales para restringir o anestesiar brevemente a cada animal mientras dure el afeitado. - Afime el área quirúrgica de cada animal con cortadoras eléctricas. Identifique la base del cráneo y el inicio de la columna vertebral. Aproximadamente un tercio del camino por la columna vertebral, afeitar un área de 3 cm x 2 cm en la parte torácica superior de la espalda.
NOTA: El afeitado también se puede realizar bajo anestesia el día del trasplante, pero debe realizarse fuera del campo estéril. Devuelva a la rata a su jaula hasta que sea necesaria. - Localice todos los suministros necesarios para el trasplante (Tabla 1).
- Evaluar el sistema de anestesia animal de laboratorio antes de su uso. Rematar los fluidos y reemplazar los tanques o piezas que se necesitan. Asegúrese de que la línea de gas a la cámara de anestesia esté abierta y todas las líneas periféricas estén cerradas, por lo que la anestesia isoflurano y el oxígeno pueden fluir libremente al animal una vez que se coloca en la cámara.
- Almohadillas de calentamiento calientes para apoyar la temperatura corporal de los animales receptores.
- Generar el campo estéril que se utilizará para la cirugía. Organice los suministros como se describe en la Tabla 1.
- Administrar analgésicos preoperatorios a ratas receptoras según lo indicado por el protocolo de cuidado animal aprobado institucionalmente.
- Enjuague las jeringas de Hamilton con medios estériles DMEM/F12 para evitar la pérdida de células. Asegúrese de que la aguja esté fijada al cuerpo de la jeringa, inserte la aguja en el líquido y extraiga el émbolo. Rellene al volumen máximo. Presione el émbolo hacia abajo y expulse el contenido en un tubo de recogida de residuos. Repita 3-5 veces.
- Cargue todo el volumen de material del donante (preparado en el paso 3.16) en una jeringa separada para cada condición (por ejemplo, control, tratamiento, wildtype, knockout, etc.). Inserte la punta de la aguja en el líquido, extraiga el émbolo y mantenga la aguja debajo de la superficie de la mezcla a medida que disminuye el volumen en el tubo.
NOTA: Incluya al menos un 10% de volumen adicional en cada jeringa. No deseche la mezcla restante, cierre el tubo y manténgalo en hielo en caso de que se necesite más. - Invierta la jeringa después de que esté completamente cargada y presione ligeramente el émbolo para eliminar las burbujas de aire en la punta de la aguja. Continúe con el siguiente paso cuando todo esté preparado.
NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja nunca toque ninguna otra superficie, incluso dentro del campo estéril. Es útil descansar el cuerpo de la jeringa sobre un pequeño recipiente de hielo para promover la viabilidad de las células. - Coloque el animal receptor en la cámara de anestesia y encienda la máquina.
- Cuando el animal esté completamente relajado (no reacciona al golpeteo o movimiento suave de la cámara), dirija la anestesia al cono nasal y transfiera al animal al campo estéril.
NOTA: La duración prolongada de la anestesia no es bien tolerada por las ratas. Complete el procedimiento para cada animal en 10 minutos o menos. - Coloque al animal en una posición propensa (en su estómago) para que la parte posterior de la cabeza y la columna vertebral superior sea accesible.
NOTA: Asegurar un soporte térmico adecuado para el animal todo el tiempo y evaluar regularmente la profundidad de la anestesia usando un pellizco firme en el dedo del pecho. - Opcionalmente, aplicar pomada de veta oftálmica para evitar el secado de los ojos.
- Limpie el área recién arasada para eliminar el exceso de cabello. Utilice un movimiento circular y aplique 70% de etanol (u otro reactivo, según las pautas institucionales) a la piel, seguido de un antiséptico (como yodo), y repita. Coloque una cortina de toalla sobre el animal para que solo se exponga la región de la zona atada.
- Asegúrese de que el animal no responde a los estímulos profundos con un pellizco firme en el dedo del pecho, y luego proceda al siguiente paso.
- Haga una pequeña incisión interescapular (2 cm) usando una cuchilla quirúrgica afilada.
NOTA: El corte debe ser superficial, ya que la almohadilla de grasa se encuentra justo debajo de la piel. - Localice el vaso sanguíneo medial para la orientación(Figura 2B).
- Levante la piel de un lado de la incisión con fórceps y sosténgala lejos de la almohadilla de grasa mientras se realiza el trasplante(Figura 2B). Inserte la aguja en el lugar del injerto.
- Opcionalmente, mueva la punta de la aguja dentro del tejido y cree un pequeño bolsillo para recoger las células. Utilice un movimiento pequeño y repetitivo. No retire la aguja.
NOTA: Este paso se recomienda para los usuarios primerizos del protocolo. Tenga mucho cuidado al crear un bolsillo, ya que el tejido de la almohadilla de grasa interescapular es muy delicado.
- Opcionalmente, mueva la punta de la aguja dentro del tejido y cree un pequeño bolsillo para recoger las células. Utilice un movimiento pequeño y repetitivo. No retire la aguja.
- Inyecte cuidadosamente 40 l de la mezcla celular en el tejido de la almohadilla de grasa interescapular. Retire la aguja lentamente.
- Sostenga el tejido en su lugar y permita que las células trasplantadas se asienten durante 3-5 s. Use un par adicional de fórceps, si es necesario.
- Retire la aguja. Repita el procedimiento de inyección (pasos 4.18-4.21) en el segundo lugar del trasplante.
NOTA: El epitelio de un grupo de donantes se puede inyectar en el mismo lado de la almohadilla de grasa en cada animal, o alternando lados para evitar efectos por lotes del dominio manual del cirujano. - Cierre la herida quirúrgica con clips de heridas o suturas y, a continuación, interrumpa la anestesia.
- Proporcionar analgésico postoperatorio como se indica en el protocolo aprobado institucionalmente.
- Mueva inmediatamente al animal a una jaula de recuperación con el soporte térmico. Monitoree los signos de angustia, como sangrado de la incisión o dificultad para respirar.
NOTA: El animal debe recuperarse completamente en un plazo de 5-10 minutos Consulte las pautas institucionales para el regreso de los animales a la colonia y la vigilancia postoperatoria después de los procedimientos de supervivencia. - Opcionalmente, realice estudios de carcinogénesis en el(los) lugar(s) del injerto administrando carcinógenos a las ratas receptoras 3-4 semanas después del trasplante.
NOTA: Por lo general, la carcinogénesis mamaria de ratas se realiza utilizando un tratamiento con carcinógeno químico a los 50-57 días de edad. Este tratamiento dicta la edad de la cirugía de trasplante (que debe hacerse entre 29-36 días de edad) para dar tiempo suficiente para que las células injertadas inicien el crecimiento de la glándula mamaria.
5. Evaluación del crecimiento epitelial
- Supervise el ciclo de estrus de las ratas a través del lavado vaginal diario y examine la citología en una diapositiva del microscopio. Comience 8-12 días antes del punto final del estudio. Sacrificar a todas las ratas en la misma etapa. Este es un paso opcional.
NOTA: El ciclo de estrus de rata es de 4-5 días. Permitir que el animal pase por 1-2 ciclos completos facilitará la interpretación, ya que los portaobjetos de lavado de ciclos anteriores se pueden utilizar para la comparación. - Sacrificar las ratas receptoras de trasplante de 6 a 8 semanas después del trasplante, según las pautas institucionales.
NOTA: El crecimiento es generalmente detectable 3-6 semanas después del trasplante, pero puede ser necesario tiempo adicional. - Coloque al animal en una posición propensa y limpie el cuerpo con 70% de etanol. Levante la piel con fórceps y haga una incisión a lo largo de la columna vertebral para exponer la almohadilla de grasa interescapular. Diseccionar la piel lejos del tejido para que la mayor parte de la almohadilla de grasa sea visible.
- Identifique el vaso sanguíneo medial que separa los sitios del injerto en la almohadilla de grasa interescapular. Exboce toda la almohadilla como una sola pieza de tejido o corte a lo largo del vaso sanguíneo y retire los lados individualmente.
- Coloque el tejido en una corredera de microscopio cargada positivamente para todo el montaje. Utilice 2 pares de fórceps contundentes y extienda suavemente el tejido para restaurar su conformación original en la diapositiva.
NOTA: El tejido mamario de rata es extremadamente delicado. Los bordes del tejido pueden enroscarse debajo de sí mismo. Siempre manipule con cuidado y sostenga en su lugar hasta que el tejido se adhiera a la diapositiva (unos segundos). - Montaje completo al menos una de las glándulas mamarias abdominales-inguinales endógenas (con ganglios linfáticos para la orientación) para la comparación.
- Coloque los portaobjetos en 70% etanol durante 7-10 días para desgrasar el tejido. Reponga el etanol tantas veces como sea necesario para asegurarse de que el tejido no se seque.
- Preparar la mancha de alumna-carmina y procesar las diapositivas cuando el tejido esté lo suficientemente opaco. Deje que la mancha se enfríe antes de su uso(Archivo Suplementario 4).
NOTA: La mancha se puede preparar hasta un día antes de los pasos de fijación y rehidratación. La solución se puede almacenar a 4 oC y tiene un potencial limitado de reutilización. - Fijar el tejido colocando los portaobjetos en 25% ácido acético glacial : 75% etanol durante 60 min.
- Rehidratar el tejido a través de una serie de 3 lavados en una serie de disminución de la concentración de etanol: 70% etanol para 15 min, 50% etanol durante 5 min y dH2O durante 5 min.
- Mancha con carmín de alumbre durante 4-8 días. Revise la parte posterior de las diapositivas cada día para determinar si la mancha ha penetrado completamente el tejido. Continúe con el siguiente paso cuando se complete la tinción.
NOTA: La tinción se completa cuando las partes más gruesas de la glándula tienen un tono púrpura y ya no aparecen blancas. - Destaína y deshidratar el tejido mediante la transferencia de los portaobjetos a través de una serie de creciente concentración de etanol: 70% etanol para 30 min, 95% etanol para 30 min y 100% etanol para 30 min.
- Colocar los portaobjetos deshidratados en xileno durante más de 3 días para limpiar el tejido. Transferencia a aceite mineral para almacenamiento a largo plazo.
- Después de que las diapositivas se hayan despejado, utilice microscopía de luz de baja potencia o fotografía digital de alta resolución para adquirir imágenes de las diapositivas para su análisis. Asegúrese de que los parámetros de adquisición de imágenes sean coherentes para todas las diapositivas.
NOTA: El crecimiento epitelial debe ser claramente distinguible. - Tratar la presencia de crecimiento como un resultado binario.
- Calcular el número medio de células epiteliales trasplantadas que produjeron un crecimiento mamario de 1 en el 50% de los sitios de injerto utilizando las imágenes adquiridas. Cuantificación de otras características físicas, según sea necesario.
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Representative Results
Glándulas mamarias de donantes y receptores
Los pasos para aislar y preparar las células epiteliales mamarias de ratas para el trasplante se muestran en la Figura 1A. A las 4 semanas de edad, la glándula mamaria endógena de la rata donante ha comenzado la maduración y el epitelio se puede visualizar en diapositivas montadas enteras teñidas con carmín de alumbre(Figura 1B). Una rata donante a esta edad proporcionará aproximadamente 1 x 106 células para el trasplante. Si la cantidad de tejido del donante recogido o posterior picado es insuficiente, el rendimiento de las células después de la digestión de la colagenasa puede ser bajo. Como tal, es importante recoger tanto tejido de la glándula mamaria como sea posible de los donantes. Tejido de la glándula mamaria totalmente digerido debe tener un aspecto aceitoso, sin trozos visibles de tejido en la suspensión(Figura 1C). La digestión completa del tejido de la glándula mamaria de un solo donante debe dar lugar a la formación de un pellet visible que contenga los organoides mamarios, como se muestra en (Figura 1D). Si un pellet no es visible, el ensayo puede requerir optimización. En la Figura 2,se muestran las ubicaciones de la glándula mamaria de la rata y de las almohadillas de grasa interescapulares. Los resultados no pueden interpretarse a menos que los puntos de referencia biológicos se identifiquen adecuadamente en el momento de la recolección de tejidos(Figura 2A)y el trasplante(Figura 2B). En este ensayo, el vaso sanguíneo medial de la almohadilla de grasa blanca interescapular se utiliza como punto de referencia biológico.
Evaluación cualitativa y cuantitativa del crecimiento epitelial
La presencia, ausencia o abundancia de epitelio se puede evaluar para determinar el éxito del experimento, así como la autonomía de los efectos relacionados con las variables experimentales. Para este último, ciertos estudios pueden requerir diapositivas montadas enteras con la glándula mamaria abdominal-inguinal endógena del huésped para la comparación. Como medida preliminar, la microscopía ligera se puede utilizar para documentar el crecimiento epitelial como un resultado binario. Estos datos se pueden analizar estadísticamente para probar la hipótesis de que el rechazo del injerto depende de las variables de donante o receptor. Un experimento de trasplante recíproco en el que cada uno de estos factores tiene 2 niveles, por ejemplo, el tipo salvaje (WT) frente al knockout (KO), creará 4 grupos de trasplantes para pruebas de hipótesis(Figura 3A). Los grupos de trasplantes, expresados como donantes: genotipo del receptor, son: WT:WT, WT:KO, KO:KO, KO:WT. Cuando se utilizan animales isogénicos o casi congénicos, el rechazo del injerto es menor y ocurre por igual en todos los grupos de trasplante. Una ventaja de múltiples sitios para el trasplante dentro de la almohadilla de grasa interescapular es una reducción de los animales receptores necesarios, ya que 2 tipos de células de donante se pueden evaluar en un solo huésped. Además, ambos sitios se pueden utilizar para probar un solo tipo de célula donante a una tasa de incidencia más alta, utilizando el mismo número de ratas. Utilizando el genotipo como ejemplo, esto se muestra en la Figura 3B.
El crecimiento epitelial también se puede analizar utilizando imágenes de las diapositivas que fueron adquiridas previamente. Un ejemplo de una almohadilla de grasa interescapular montada entera que contiene el crecimiento epitelial en ambos sitios del injerto (registrado como resultados positivos) se muestra para un experimento utilizando el protocolo de trasplante de células mamarias descrito aquí(Figura 3C). La falta de epitelio en la almohadilla de grasa interescapular a través de muchas muestras puede indicar un problema técnico con el procedimiento y se trata como un resultado negativo.
El resultado de los experimentos de trasplante recíproco se puede utilizar para distinguir los efectos que son autónomos o no autónomos de las células epiteliales mamarias. Para probar la hipótesis de que un efecto es impulsado por procesos en las células epiteliales mamarias (autónomas de células) o influenciados por el huésped/microambiente (no autónomo), la concordancia del fenotipo de céluladonante al del fenotipo huésped (endógeno) se trata como un resultado dicotómico. En un ejemplo como un ensayo de carcinogénesis, la incidencia del tumor se puede analizar como datos de respuesta binaria, y el análisis de regresión logística utilizado para determinar si la interacción donante, huésped o donante-host contribuye significativamente a la tasa de incidencia del tumor en el sitio del trasplante. Si el efecto es impulsado por las propiedades del epitelio del donante, se puede observar un resultado de trasplante similar en todos los grupos receptores, independientemente de la condición del huésped. Si el epitelio del donante se desarrolla como si fuera endógeno para el huésped, debido a una contribución del genotipo o tratamiento del huésped, el efecto puede ser no autónomo. En ambas situaciones, los grupos de trasplante en los que las células epiteliales del donante coinciden con el huésped (auto:self) deben interpretarse como controles, y las conclusiones respaldadas por análisis estadísticos.
Para demostrar los resultados de los efectos autónomos y no autónomos sobre el epitelio trasplantado, se ha proporcionado una ilustración(Figura 4A),junto con diapositivas de trasplante recíproco de tipo salvaje y experimentos de epitelio mamario de rata noqueada Cdkn1b. Los resultados de este estudio sugirieron efectos no autónomos celulares no mamarios18 (Figura 4B). En el caso de los resultados de trasplantes recíprocos clasificados como respuesta binaria, la probabilidad de que el resultado (por ejemplo, concordancia del fenotipo para albergar epitelio o crecimiento exitoso en ensayos cuantitativos) dependa de variables categóricas (por ejemplo, genotipo de donante o receptor) puede probarse mediante la construcción de un modelo de regresión logística para los principales efectos y términos de interacción.
Figura 1: Preparación de glándulas mamarias de donantes. (A) Visión general del procedimiento para extraer tejido de la glándula mamaria de animales donantes y recuperar organoides para trasplante. (B) Glándulas mamarias endógenas endógenas de una rata de 4 semanas de edad (edad típica de los donantes de trasplante), después de la tinción de carmina de alumbre. A las 4 semanas de edad, el epitelio mamario estaba en proceso de expansión, pero el árbol ductal no penetra completamente la almohadilla de grasa, como lo demuestra la proximidad a los ganglios linfáticos centrales. (C) La consistencia de la glándula mamaria picada se muestra después de cortar (rosa) en un plato de 60 mm sobre hielo, con una cantidad adecuada de medios DMEM/F12 para mantenerla húmeda. Las imágenes adyacentes proporcionan una comparación del epitelio picado después de transferir la suspensión a los medios de digestión de la colagenasa y cuando la digestión está completa, 90-120 minutos más tarde. (D) Los organoides epiteliales peletizaron y la separación de capas son visibles después de la centrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación de los límites para la recolección de tejidos y la inyección de células epiteliales mamarias. (A) Se muestran las ubicaciones de las glándulas mamarias de ratas para la recolección de tejido. Se describe la ubicación aproximada de las glándulas mamarias abdominales-inguinales endógenas cosechadas de donantes y receptores. ( B ) Despuésdeafeitarse y hacer una incisión superficial, se expone la almohadilla de grasa interescapular blanca de un receptor de trasplante. Imagen superior: el vaso sanguíneo medial (flecha amarilla) es visible en el centro de la incisión. Imagen inferior: la piel de un lado de la incisión se levanta para mostrar el ancho de la almohadilla de grasa IS debajo de la piel, en relación con el vaso sanguíneo medial (flecha amarilla). El epitelio del donante se inyecta debajo de esta solapa en la almohadilla de grasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de trasplante recíproco. (A) Se muestra el diseño experimental típico para el trasplante recíproco, utilizando como ejemplo los genotipos. La prueba de una sola variable experimental, como el knockout de genes (KO) en relación con el epitelio del donante de tipo salvaje (WT), crea 4 grupos de receptores de trasplantes. (B) Ejemplo de diseño para un solo animal receptor que recibe 2 inyecciones de material de donante. Múltiples sitios para el injerto son accesibles cuando se utiliza la almohadilla de grasa blanca interescapular debido a la presencia de un vaso sanguíneo a lo largo de la línea media. Se pueden inyectar preparaciones separadas de tipo salvaje y epitelio de donante knockout (u otras condiciones de prueba) a la izquierda y a la derecha del vaso sanguíneo. (C) El tejido de almohadilla de grasa IS montado en todo el lugar de un receptor de trasplante se muestra en la misma orientación que en el ejemplo presentado en (B). El crecimiento epitelial mamario es visible en dos lugares de trasplante en un portaobjetos montado en todo el mar con tejido teñido de alummina. La almohadilla de grasa interescapular fue extirpada como una sola pieza 6 semanas después del trasplante. Puede ser necesario un tiempo adicional para el desarrollo epitelial, pero también puede facilitar el crecimiento excesivo y la dificultad para distinguir los injertos de donantes individuales. Los artefactos biológicos comunes pueden ser visibles: MS - músculo, TP - epitelio trasplantado, BF - tejido graso adiposo marrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de resultados autónomos y no autónomos de células mamarias. (A) Simulación de resultados que pueden observarse cuando hay contribuciones significativas de efectos autónomos y no autónomos sobre el fenotipo del epitelio donante. En este ejemplo, las glándulas abdominales-inginales endógenas del huésped se utilizan como comparación. La concordancia del fenotipo del crecimiento epitelial del donante, en comparación con la glándula endógena, se puede utilizar como referencia, pero no debe utilizarse para determinar exclusivamente los efectos. (B) El crecimiento del epitelio mamario del donante se muestra en el lugar del trasplante, adyacente a imágenes de la glándula endógena para los 4 grupos en un experimento de trasplante recíproco. Efectos no autónomos sobre el epitelio mamario observados después del nocaut de un solo gen, Cdkn1b, lo que sugiere que el microambiente del huésped afecta a la glándula mamaria de la rata en desarrollo18. Las barras de escala representan 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso necesario | Artículos sobre hielo | Deshielo/Precalentado | Artículos cerca del cirujano |
| 1. Preparación del epitelio de la glándula mamaria | Plato de 60 mm | Herramientas quirúrgicas estériles | |
| Aliquot de DMEM/F12 | 70% Etanol | ||
| 2. Extracción cerebral del donante | Alícuota de medios en tubo de 15 o 50 ml (aprox. 1-2 ml/donante) | Equilibrio para el pesaje cerebral, dentro del campo estéril | |
| Tubo etiquetado de 15 ml para cada donante, apto para homogeneización | Hoja | ||
| Pipeta y puntas (1000 l, o electrónicas con pipetas serológicas de 5 ml) | |||
| Homogeneizador mecánico | |||
| 3. Digestión enzimática de las glándulas del donante | DMEM/F12 suficiente para lavados | Medios de digestión sin suero | Escala de laboratorio (g) |
| DNAse I | Mezcla de monodispersión | Incubadora/shaker | |
| Solución de inactivación | Tubo de 50 ml (etiquetado) para cada donante | ||
| Jeringa de 10 ml (o superior) para medios de digestión de colagenasa de filtrado estéril | |||
| Filtros de 20-40 M | |||
| Alícuota de medios a filtro(s) pre-húmedo(s) | |||
| Tubo(s) de 50 ml para la recolección de solución enzimática filtrada | |||
| Tijeras estériles para cortar puntas de pipeteo desechables | |||
| Vaso grande para recoger sobrenadante, o línea de vacío para aspirar | |||
| 4. Trasplante | Epitelio del donante + mezcla de homogeneado cerebral | Jeringas Hamilton – 1 por genotipo/condición del donante | |
| Aliquot de DMEM/F12 a jeringas de primera | Escala | ||
| Suministros quirúrgicos estériles (escalpelo/tijeras, múltiples fórceps) | |||
| Clips/suturas de heridas | |||
| Gasa | |||
| 70% etanol o isopropanol | |||
| Beta-dine o yodo | |||
| Analgésico | |||
| Soporte térmico para animales receptores | |||
| Toallas de papel o toallitas de tareas delicadas |
Tabla 1: Elementos que requieren consideración previa en cada paso. Esta lista está diseñada para ser utilizada como referencia al preparar un experimento y no debe considerarse exhaustiva. Los reactivos sólo pueden ser necesarios para aplicaciones específicas del protocolo, basándose en la inclusión/exclusión de pasos opcionales. En cualquier experimento, estos elementos deben ser accesibles sin demora una vez que se inicia el procedimiento.
Archivo Suplementario 1: Preparación de Medios de Digestión de La Colagenasa Sin Suero. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo Suplementario 2: Preparación de mezcla de monodispersión. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo Suplementario 3: Preparación de la Solución de Inactivación. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo Suplementario 4: Preparación de la mancha de alum-carmín. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Este protocolo describe una técnica de trasplante de células epiteliales mamarias optimizada para trabajar con ratas. Los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes (3-5 semanas de edad) se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas receptoras (también de 3 a 5 semanas de edad). Los resultados pueden ser interpretados tan poco como 4-6 semanas más tarde, utilizando microscopía de luz para examinar el tejido injertado; sin embargo, la cantidad óptima de tiempo entre el trasplante y el sacrificio debe determinarse antes de implementar un experimento completo. Si ha pasado demasiado o demasiado tiempo, los resultados no serán interpretables ni significativos. Para optimizar el protocolo, analice el crecimiento en un pequeño conjunto de animales 6-8 semanas después del trasplante. Si el epitelio trasplantado está presente, pero subdesarrollado, aumente el tiempo. Si los injertos están bien desarrollados, pero las características superpuestas del epitelio interfieren con los análisis, considere la posibilidad de reducir el número de semanas para el crecimiento epitelial. Si no se puede acortar la cantidad de tiempo (por ejemplo, en experimentos con carcinogénesis), se recomienda inyectar el mismo tipo de epitelio de donante en ambos sitios de trasplante (uno a cada lado del vaso sanguíneo medial), ya que los resultados no pueden interpretarse a partir de lados con 100% de certeza. Si se sospecha cualquier tipo de interacción (autocrina, paracrino), se recomienda encarecidamente incluir animales de control adicionales inyectados con el mismo tipo de epitelio de donante en ambos sitios de trasplante. Los pasos críticos en el procedimiento incluyen la cuantificación adecuada de las células del donante después de la digestión enzimática, y la mezcla uniforme con homogeneización cerebral. Se debe tener especial cuidado en estas medidas para garantizar que el número de células trasplantadas sea constante entre los animales receptores. Además, durante la inyección, asegúrese de que la mezcla de tejido injertado no se escape de la almohadilla de grasa interescapular. 3. Excising la almohadilla de grasa interescapular en el punto final del experimento. Toda la almohadilla se puede quitar como una sola pieza, pero se debe tener cuidado si se elige separar los 2 lados de la almohadilla de grasa interescapular, cortando sólo después de identificar el vaso sanguíneo medial. Puede ser difícil determinar el lado del que se originó el crecimiento, especialmente cuando un injerto se ha vuelto en el otro, haciendo la eliminación como una sola pieza más ideal.
Una modificación común del procedimiento es la adición de un tratamiento cancerígeno de la rata receptora25,29. El tejido injertado puede retener la susceptibilidad a la carcinogénesis que poseía la rata donante25,o, por el contrario, el tejido donante puede adoptar la susceptibilidad del huésped30. Estos efectos sólo se pueden determinar cuando se utiliza la almohadilla de grasa interescapular como el sitio del trasplante, porque las glándulas mamarias endógenas permanecen intactas y funcionan como un control interno positivo.
Cuando se utilizan organoides de la glándula mamaria para el trasplante, la ausencia de crecimiento epitelial puede deberse a problemas con la preparación de células del donante o el procedimiento de inyección. El rechazo del injerto también puede ocurrir cuando el receptor y la tensión del donante no son congénicos, causando una respuesta inmune en el huésped. En tales casos, el sistema inmunitario receptor reconoce el tejido del donante como no-yo, inicia una respuesta inmune, y el tejido injertado no crece. Para reducir el riesgo de fallo del injerto cuando el donante y el receptor están en diferentes orígenes genéticos, se recomienda un mínimo de 6, e, idealmente, se recomiendan más de 10 generaciones de backcrossing para prevenir desafíos que pueden afectar la interpretación de los resultados. A las 6 generaciones de backcross, la mayoría de los injertos crecerán, pero una minoría aún podría fallar. Al solucionar la solución de problemas de la preparación celular del donante como la causa de la falla del injerto, considere si la digestión enzimática fue demasiado dura, las células se mantuvieron a temperaturas demasiado altas o demasiado bajas, fuentes de contaminación, optimización de los números celulares de los donantes utilizados para el ensayo , u otras desviaciones de protocolo que afecten a la viabilidad y el crecimiento de las células.
Células madre mamarias individuales se han demostrado en el ratón para ser capaz de reconstituir una glándula mamaria funcional, lo que ilustra que la adición de soporte hormonal no es necesaria para el resultado primario. La adición de homogeneización cerebral mejora significativamente el resultado del trasplante sirviendo como matriz estructural para las células donantes y reduciendo el riesgo de rechazo del trasplante migratorio3,34,35,36. Cuando se combina con homogeneizado cerebral, el número mínimo de células epiteliales mamarias necesarias para el trasplante se reduce más de 10 veces, en comparación con las alternativas3. Es importante destacar que la mezcla de homogeneizado cerebral singéneo no ha demostrado afectar el fenotipo del epitelio trasplantado, y ha producido resultados consistentes en estudios de carcinogénesis y susceptibilidad mamaria durante más de 40 años.
Algunos pueden argumentar que la almohadilla de grasa interescapular no es representativa de la almohadilla de grasa mamaria endógena debido a las distinciones anatómicas: la proximidad de la almohadilla de grasa IS al tejido adiposo marrón, las posibles diferencias en la densidad de los vasos sanguíneos que resultan en diferencias en la exposición a las hormonas o la presencia de ganglios linfáticos prominentes en la almohadilla de grasa inguinal-abdominal, que puede exponer el epitelio a diferentes niveles de citoquinas. Aunque esto no ha sido probado específicamente en ratas, ambos depósitos son subcutáneos y se desarrollan antes de adiposo visceral37,38; en adiposo humano, existen mayores diferencias moleculares entre las regiones adiposas, y la heterogeneidad dentro de los grupos no se entiende completamente38,39. Un factor adicional a tener en cuenta es que las almohadillas de grasa interescapulares y mamarias blancas comparten Myf5+ linaje precursor mesenquimal, pero difieren en el número de células derivadas de esa población40. No obstante, hay suficiente evidencia para sugerir que la almohadilla de grasa interescapular blanca proporciona un microambiente similar al de la glándula mamaria inferior. El epitelio mamario recombinado con su propio mesenquima desarrolla un patrón mamario típico20,un efecto que está bien documentado en estudios de roedores y apoya las observaciones en el tejido adiposo humano19,20,24,41,42. Sobre todo, los principales determinantes del éxito del trasplante epitelial mamario tanto en ratas como en ratones son el tamaño y la integridad de la almohadilla de grasa43,44. En el uso de esta técnica, muchos estudios de susceptibilidad al cáncer de mama han demostrado que el tejido mamario funcional se puede generar de manera efectiva y rutinaria cuando se trasplanta en la almohadilla de grasa interescapular blanca18,30,45.
Debido a la alta compatibilidad, el crecimiento epitelial es susceptible a factores celulares mamarios autónomos y no autónomos y responderá a la manipulación hormonal de las ratas receptoras, por ejemplo, para promover la diferenciación o secreción funcional de leche. El trasplante de organoides se utiliza a menudo para estudiar factores que afectan el desarrollo de la glándula mamaria y/o carcinogénesis. Los organoides se pueden digerir aún más en suspensiones de una sola célula para facilitar la interpretación cuantitativa de los resultados. Si bien el método descrito en este artículo se puede adaptar al injerto secciones intactas del tejido de la glándula mamaria (como se realiza comúnmente en ratones), los pasos de disociación enzimática permiten llegar a conclusiones más detalladas. Dado que preborrar la almohadilla de grasa mamaria endógena en la rata no es factible, este es actualmente el único método que permite el injerto de epitelio mamario de rata.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Centro Oncológico de Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 fondos piloto de investigación de los Institutos Nacionales de Salud(https://www.nih.gov/),y fondos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Nos gustaría dar las gracias a Marijne Smiths por grabar las declaraciones de la entrevista.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | - | - | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | - | - | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | - | - | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | - | - | |
| Clean animal cages for recovery | - | - | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | - | - | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | - | - | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | - | inactivation solution |
| Gauze | - | - | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | - | monodispersion mixture |
| Heating pads | - | - | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | - | - | |
| Incubator with orbital rotation | - | - | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | - | - | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | - | - | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | - | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | - | - | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | - | - | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | - | - | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | - | - | electric clippers, or other |
| Staining jars | - | - | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | - | - | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | - | - | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | - | - | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
References
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