Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.
Abstract
Bereits in den 1970er Jahren haben Forscher erfolgreich Epithelzellen der Brust in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten transplantiert. Das Grafting-Mammaepithel mit Transplantationstechniken nutzt die hormonelle Umgebung des jugendlichen Nagetierwirts. Diese Studien sind ideal geeignet, um die Auswirkungen verschiedener biologischer Manipulationen auf die Entwicklung der Brustdrüse zu untersuchen und viele Aspekte der Brustdrüsenbiologie zu sezieren. Ein häufiges, aber einschränkendes Merkmal ist, dass transplantierte Epithelzellen stark von der umgebenden Stroma beeinflusst und durch endogenes Epithel übertroffen werden; Um natives Brustgewebe zu nutzen, muss das abdominale weiße Fettpolster vor der Transplantation gelöscht werden, um das Brustepithel zu entfernen. Ein großes Hindernis bei der Verwendung des Rattenmodellorganismus ist, dass die Beseitigung des sich entwickelnden Brustbaums bei nachentwöhnten Ratten nicht effizient ist. Bei der Transplantation in drüsenfreie Fettpolster können Spenderepithelzellen das gelöschte Wirtsfettpad wieder bevölkern und eine funktionelle Brustdrüse bilden. Das interskapulierliche Fettpolster ist ein alternativer Ort für diese Transplantate. Ein großer Vorteil ist, dass es an duktalen Strukturen fehlt, aber die normale Stroma liefert, die notwendig ist, um epitheliale Auswüchse zu fördern und in der Ratte leicht zugänglich ist. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie minimal invasiv ist, weil sie die Notwendigkeit eliminiert, den wachsenden endogene Brustbaum zu kauterisieren und zu entfernen. Darüber hinaus enthält das interskapulierliche Fettpad ein mediales Blutgefäß, das verwendet werden kann, um Standorte für die Transplantation zu trennen. Da die endogenen Drüsen intakt bleiben, kann diese Technik auch für Studien verwendet werden, die die endogene Brustdrüse mit der transplantierten Drüse vergleichen. Dieses Papier beschreibt die Methode der Brustepithelzelltransplantation in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten.
Introduction
Postnatale Brustdrüsenentwicklung und duktale Morphogenese sind Prozesse, die weitgehend durch hormonelle Signalisierung zu Beginn der Pubertät beeinflusst werden. Bei Mäusen und Ratten, häufig verwendeten Modellorganismen der Brustdrüsenbiologie, beginnt dieser Prozess etwa 3 Wochen im Alter, wo eine schnelle Proliferation und Differenzierung zur Bildung des reifen Parenchyms führen. Die reife Brustdrüse kann zahlreiche Expansions- und Involutionrunden durchlaufen, eine Eigenschaft, die seit dem frühen20. Jahrhundert untersucht wird. Im Rahmen der Hyperproliferation und der Krebsentwicklung wurden in den 1950er Jahren1Brustdrüsentransplantationstechniken entwickelt und durch die quantitative Methodik verbessert, die Gould et al. 1977 2,3,4beigesteuert haben. Die Verfeinerung der Transplantationstechnik bei Nagetieren hat zu großen Fortschritten beim Verständnis der normalen Brustdrüsenbiologie beigetragen, die immer noch weit verbreitet sind, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und genetischer Manipulationen auf normale Brustdrüsenentwicklung und Krankheitszustände zu untersuchen.
Viele Hypothesen wurden erstellt und anschließend mit Brustdrüsentransplantation getestet, zuerst beschrieben von DeOme et al. 19591. Experimente über mehrere Jahrzehnte zeigten die Neigung des duktalen Gewebes, das aus den Spender-Brustdrüsen entnommen wird, um das gesamte Fettpolster5,6,7 wieder zu bevölkern, und zeigten, dass eine kritische Komponente der Entwicklung der Brustdrüse in diesen epithelialer Strukturen liegt. Spätere Studien an Mäusen zeigten, dass eine einzelne Bruststammzelle ein gelöschtes Fettpolster wieder bevölkern kann und zur Entdeckung eines einzigen, gemeinsamen Vorläufers von Basal- und Luminal-Mammaepithelzellen8,9,10beigetragen hat. Im Einklang mit diesen Schlussfolgerungen, Es wurde vorgeschlagen, dass Transplantation erhöht den Pool von Zellen mit Multilineage-Wiederbevölkerung Potenzial als Folge der Plastizität, so dass die transplantierten Zellen eine funktionelle Brustdrüsewachsen 7,10,11,12,13. Wichtig ist, dass der Einsatz von Transplantationstechniken bei Nagetieren die Grenzen von zellkulturinduzierten Anomalien14 überwindet und oft in nur wenigen Wochen Ergebnisse liefert.
Während das Verfahren ursprünglich im Zusammenhang mit präneoplastischen Läsionen bei Mäusen beschrieben wurde, wurde es bald auf Ratten ausgeweitet und in Verbindung mit der karzinogenen Behandlung verwendet, um die Multiplizität als Maß für die Krebsanfälligkeit zu etablieren15, aber die Popularität von Transplantationstechniken hat die Entwicklung genetischer Werkzeuge für jede Art verfolgt. Obwohl Mausstudien mit Transplantation viele translationale Befunde beigesteuert haben, ähnelt das Parenchym der Rattenbrustdrüse dem Menschen näher16,17 und bietet deutliche Vorteile für die Untersuchung von Östrogenrezeptor-positivem (ER+) Brustkrebs. Brusttumoren sind in beiden Arten induzierbar, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf Hormonempfindlichkeit und Genexpressionsprofile. Ein primärer Unterschied ist, dass Rattenbrusttumoren ausdrücken und von der Funktion der Eierstock- und Hypophysenhormonrezeptoren abhängen, nämlich Östrogen und Progesteron (PR), ähnlich dem Luminal-A-Subtyp des menschlichen Brustkrebses. Tatsächlich wurde die Transplantation von Epithelzellen, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwendet, um genetische Varianten zu untersuchen, die an Brustkrebs beteiligt sind, und die zelluläre Autonomie der Wirkungen auf Dieepithelzellen18zu bestimmen.
Neben der Tumorbiologie weist das duktale Epithel der normalen Rattenbrustdrüse eine höhere Verzweigung auf und wird von einer dickeren Stromaschicht flankiert als die Maus. Die Bedeutung der Stroma ist in Brustepitheltransplantationsstudien gut dokumentiert. Das Brustepithel muss mit fettem Stroma und idealerweise seinem eigenen Mesenchym interagieren, um seine charakteristische Morphogenese19,20zu durchlaufen. Das Verpflanzen von Gewebe in eine Empfänger-Brustdrüse bietet eine optimale Umgebung; das Vorhandensein von endogenem Epithel kann jedoch die Ergebnisse beeinträchtigen. Die Vorreinigung der Brustdrüse von endogenem Epithel wird häufig in Maustransplantationstests durchgeführt und erfordert eine chirurgische Exzision des endogenen Brustgewebes und/oder die Entfernung der Brustwarze1,21,22. Obwohl möglich, ist die Vorreinigung des Brustepithels bei nach entwöhnenden Ratten nicht so weit verbreitet, vor allem aufgrund der Unwirksamkeit der Räumung des wachsenden Brustbaums bei nach entwöhnenden Ratten. Da gezeigt wurde, dass Regionen von Fettgewebe an anderer Stelle im Körper das Wachstum des transplantierten Brustepithels21,23,24unterstützen könnten, kann der Prozess der Vorräumung bei Ratten leicht vermieden werden, indem Gewebe in das interscapuläre weiße Fettpolster transplantiert wird.
Die in diesem Papier beschriebene Transplantationsmethode beinhaltet die Injektion von enzymatisch dissoziierten Brustdrüsenorganoiden (Fragmente von Brustduktalepithel und anderen Zelltypen, die morphogenestisch geeignet sind) oder monodispergierten Zellen in das interscapuläre Fettpolster in inzucht, isogenen oder kongenen Stämmen von Laborratten2. Da das interskapuläre Fettpolster normalerweise frei von Brustgewebe ist, bietet es eine geeignete Umgebung für mehrere Transplantationsstellen, ohne dass endogenes Epithel vorgeklärt werden muss. Infolgedessen sind die endogenen, abdominalen Bauch-Leisten-Brustdrüsen des Wirtstiers keiner chirurgischen Manipulation ausgesetzt, entwickeln sich normal und können die Interpretation der Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Zusätzlich können die intakten Brustdrüsen zum Vergleich verwendet werden, um Wirts- und Spendereffekte auf die Entwicklung des Brustepithels und die Tumorgenese18,25zu bewerten. Obwohl die Repopulation der Brustdrüse aus einer einzigen Stammzelle für Mäuse verfügbar ist, wurde sie noch nicht für Ratten entwickelt, hauptsächlich aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit von Antikörpern zur Auswahl für Bruststammzellen der Ratte25,26,27. Trotzdem kann die Transplantation von monodispersen Epithelzellen der Brust zur Quantifizierung des Wiedervolksungspotenzials erfolgreich durchgeführt werden, und diese Zellen entwickeln sich normal, wenn sie in das entsprechende Gerüst eingepfropft werden2,3,4. Während Organoide für viele Zwecke gut sind, sind monodisperse Zellen für quantitative Anwendungen erforderlich, um beispielsweise die Anzahl der Brustepithelzellen zu bestimmen, die für die Krebsinitiierung nach ionisierender Strahlenbehandlung28 oder zum Vergleich der Merkmale der zytometrischen Zytometrie-Epithelzellpopulationen benötigt werden29.
Bis heute ist das hier beschriebene Verfahren die robusteste Methode zur Durchführung von Brustdrüsentransplantationen bei ratten mit dem übergeordneten Ziel, die Entwicklung der Brustdrüse und die Mechanismen, die der Entwicklung von Brustkrebs zugrunde liegen, zu untersuchen. Häufig sind spender- und/oder Empfängertiere vor, während oder nach der Epitheltransplantation unterschiedlichen Variablen ausgesetzt. Beispiele sind einzelne Genstudien mit chemischer Karzinogenese30, Strahlung28,31,32, genetische Manipulation des Wirts-/Spendergenoms18und hormonelle Manipulation12. Ein großer Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen enzymatischen Dissoziation ist die Möglichkeit, epitheliale Organoide oder monodisperse Zellen für komplementäre Experimente mit Durchflusszytometrie, 3D-Kultur, Genbearbeitung und mehr zu isolieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden zusätzliche Manipulationen von Spender- und/oder Wirtsgewebe mit Gentechnik umfassen. Beispielsweise können Spenderzellen ex vivo an jedem ausgewählten genomischen Ort mit dem CRISPR-Cas9-Genbearbeitungssystem genetisch verändert werden. In ähnlicher Weise können Empfängerratten auch genetisch verändert werden, um die Wechselwirkung zwischen spender- und empfängertechnischen genetischen Faktoren zu untersuchen.
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Protocol
Alle Tiere wurden in einer von AAALAC zugelassenen Einrichtung untergebracht und gepflegt, und die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden vom MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) genehmigt. Tiere, die bei der gegenseitigen Transplantation verwendet werden, sollten ein inzuchtierter oder iserogener Stamm sein, dessen kongene Stellung für mindestens 6 Generationen bevorzugt oder nach hinten gekreuzt wird.
1. Ernte Spender Ratte Brustdrüsenepithel
- Bestimmen Sie die Anzahl der Spenderratten, die für die Transplantation benötigt werden.
HINWEIS: Im Allgemeinen kann 1 Spenderratte (4 Wochen alt) genügend Zellen für die Transplantation in 4 Empfängertiere bereitstellen. Bestimmte Anwendungen dieses Protokolls erfordern zusätzliche Anzahl von Zellen, und es kann dehnungsspezifische Unterschiede in der Gesamtausbeute geben. - Beschriften Sie alle Vorräte und sorgen Sie für eine zugängliche Platzierung für den Chirurgen (Tabelle 1).
- Zeichnen Sie das Körpergewicht jeder Spenderin auf. Befolgen Sie die institutionellen Leitlinien, um die Spenderratte vollständig zu beäschen oder einzuschläfern. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf die Zehenprise.
- Bewegen Sie das Tier in den sterilen Operationsbereich. Legen Sie das Tier auf den Rücken und sprühen Sie die gesamte ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.
- Machen Sie einen sagittalen, X-förmigen Schnitt, der den Zugang zu Brustdrüsen, Bauch- und Leistendrüsen ermöglicht. Sezieren Sie das gesamte Brustdrüsengewebe der Spenderratte mit einer Schere (Abbildung 1). Entfernen Sie alle sichtbaren Lymphknoten.
- Extrahieren Sie das Brustgewebe mit Zangen und legen Sie es in eine beschriftete 60 mm Schale auf Eis. Fügen Sie der 60-mm-Schale 500 L serumfreies DMEM/F12-Medium hinzu. Passen Sie die Platzierung des Brustdrüsengewebes so an, dass es vollständig nass bleibt.
- Das Brustgewebe mit einer Schere fein zerkleinern. Schneiden Sie dazu das Gewebe in Stücke von 1-2 mm3 in der Größe(Abbildung 1C). Halten Sie die Drüse auf Eis, bis das gesamte Spendergewebe geerntet wurde (nicht mehr als 60 min).
HINWEIS: Zusätzliches Personal kann Brustdrüsen zerkleinern und zusätzlich Kollagenaselösung vorbereiten, während der Chirurg mit Gewebeextraktionen fortfährt.
2. Extrahieren Sie Hirngewebe von eingeschläferten Spendern
- Drehen Sie den Körper des Spendertiers vorsichtig um, um ihn in eine anfällige Position zu bringen. Sichern Sie sich mit Stiften. Den Kopf und den oberen Rücken mit 70% Ethanol besprühen.
- Suchen Sie die Basis des Schädels und machen Sie einen Schnitt unter den okzipitalen Kondylen. Legen Sie eine scharfe Schere unter die Haut und schneiden Sie die Haut vom Schädel weg, einschließlich der Seiten des Kopfes.
- Verwenden Sie Knochenschneider oder starke Scheren, um den Schädel entlang der Mittellinie zu schneiden, von der okzipitalen bis zur frontalen Knochen. Halten Sie die Klinge so oberflächlich wie möglich und Winkel nach oben, um die Zerstörung des darunter liegenden Gehirngewebes zu verhindern.
- Schälen Sie den Knochen mit Rongeurs oder starken Zangen. Setzen Sie das Werkzeug seitlich in das Kleinhirn ein, um den Knochen auf beiden Seiten zu brechen und den knöchernen Gehörgang freizulegen. Trennen Sie die Verbindungen zu den Meningen.
- Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit gekrümmten, feinen Zangen an. Legen Sie das Gehirn auf ein Stück Folie und erfassen Sie das Gewicht, und übertragen Sie dann sofort auf ein 15 ml Rohr mit einer gleichen Menge (w:v) von Medien, auf Eis gespeichert.
- Optional verwenden Sie Feinspitzenzange, um die Hypophyse (unter dem Gehirn) für den zusätzlichen Einsatz im Transplantationsverfahren zu entfernen, falls erforderlich.
- Verwenden Sie einen mechanischen Homogenisator, um das Gewebe zu stören. Homogenisieren Sie das Gehirn für 10-15 s bei niedriger Geschwindigkeit. Die Mischung mindestens 1 min auf dem Eis sitzen lassen und dann wieder homogenisieren. Die Homogenisierung ist ausreichend, wenn die endgültige Mischung frei von großen Stücken ist.
- Filtern Sie das Homogenat, indem Sie es durch einen 100-mm-Filter passieren. Bewahren Sie das Filtrat bis zum Gebrauch (weniger als 4 h) auf Eis auf.
3. Verdauung und Verarbeitung von Brustdrüsenextrakten
- Tauoder oder warme Reagenzien wie angegeben (Tabelle 1). Befolgen Sie die entsprechenden Schritte zur Wiederherstellung von Organoiden oder monodispersen Zellen.
- Bereiten Sie 10 ml serumfreie Verdauungsmedien (ohne Kollagenase) für jedes Spendertier vor (Ergänzungsdatei 1).
HINWEIS: Das Volumen der verwendeten Verdauungsmedien kann angepasst (nach oben oder unten skaliert) werden, um gegebenenfalls das gruppierte Gewebe aufzunehmen.- Für Organoide springen Sie auf 3.3.
- Für monodisperse Zellen, bereiten frische Monodispersion Mischung und Inactivation Lösung (Ergänzungsdatei 2, Ergänzungsdatei 3) zusätzlich zu den serumfreien Kollagenase Verdauungsmedien. Fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.
- Wenn das gesamte Brustgewebe von Spendern extrahiert und gehackt wurde, fügen Sie das Kollagenase-Enzym zu den warmen (oder Raumtemperatur) Verdauungsmedien hinzu (Supplemental File 1). Mix durch Invertieren.
- Übergeben Sie das Kollagenase-Verdauungsmedium durch einen 20-mm-Filter. 10 ml gefilterte Medien in die beschrifteten 50 ml-Rohre für die Verdauung geben.
- Verwenden Sie für jede Probe eine neue Pipette-Spitze von 1.000 l und übertragen Sie das gehackte Spendergewebe von jeder 60-mm-Schale in das Kollagenase-Verdauungsrohr. Schneiden Sie 1 cm vom Ende einer 1.000-L-Spitze ab und legen Sie sie vor Gebrauch manuell auf das Gerät. Mischen Sie das gehackte Gewebe vorsichtig, indem Sie 1-2 Mal nach oben und unten pfeifen.
HINWEIS: Wenn das Gewebe während der Übertragung schwierig zu pipette ist, verwenden Sie eine kleine Menge des Kollagenase-Verdauungsmediums aus dem 50-ml-Rohr, und übertragen Sie es dann zurück. - Legen Sie die Proben in der horizontalen Position in einen Schüttelinkubator und lassen Sie die Proben 1,5-2 h bei 37 °C, 200-220 Rpm verdauen.
- Für Organoide springen Sie auf 3.7.
- Für monodisperte Zellen fügen Sie DNase I (0,2 g/ml) in die Mischung für die letzten 10 min der Verdauung. Inkubieren wie zuvor, mit kräftigem Schütteln. Fahren Sie mit Schritt 3.7 fort.
- Wenn das Gewebe vollständig verdaut ist, pellet die Suspension mit kalter Zentrifugation (4 °C) für 10 min bei 1.200 x g (Abbildung 1D).
HINWEIS: Halten Sie Rohre zwischen jedem Schritt auf Eis, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. - Stellen Sie sicher, dass sich ein Pellet gebildet hat, und gießen Sie dann vorsichtig die Überstand- und Fettschicht ab. Das Pellet in 10 ml frischen DMEM/F12-Medien vorsichtig wieder aufhängen.
- Kurz drehen bei 68 x g für ca. 10 s. Die Länge der Drehung (aber nicht die Geschwindigkeit) kann erhöht werden, wenn es keine klare Trennung der Zellen gibt. Überprüfen Sie das Pellet visuell, bevor Sie fortfahren (Abbildung 1D).
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und hinterlassen Sie ein kleines Volumen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, je nach Benötigtwerden von Organoiden oder monodispergierten Zellen.
HINWEIS Es ist wichtig, ein kleines Medienvolumen im Rohr zu lassen, da das Pellet sehr locker ist. Das Restvolumen der Medien wird durch Waschschritte verdünnt.- Für Organoide, fügen Sie ein weiteres 10 ml Volumen von DMEM / F12 Medien und wiederholen Sie die Wäsche / Spin. Nach der zweiten Wäsche die Zellen in einem kleineren Volumen (1-2 ml) DMEM/F12-Medien zur Filtration wieder aussetzen. Fahren Sie mit Schritt 3.11 fort.
- Für monodisperse Zellen in 2 ml vorgewärmter HBSS mit 0,025% (w/v) Trypsin und 6,8 mM EDTA auflösen. 3-5 min bei 37 °C verdauen. Sofort inaktivieren.
- Fügen Sie 4 ml DMEM/F12 mit 10% FBS hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren.
- Drehen Sie die Zellen bei 270 x g für 5 min, und setzen Sie dann in DMEM/F12 mit 10% FBS wieder ab. Fahren Sie mit Schritt 3.11 fort, um die Zellen zu filtern.
- Filtern Sie die Zellen mit einem 40 m Zellsieb, das in einem neuen 50 ml-Rohr platziert ist. Das Sieb vorbefeuchten, indem man 1 ml des gleichen Basismediums, das zum Aufhängen der Zellen verwendet wird, vorbefeuchten und dann die Zellsuspension mit einer Pipette durch den Filter leiten, um duktale Fragmente/Organoide zu sammeln.
HINWEIS: Die ungefähre Ausbeute des gefilterten Epithels aus dem Brustdrüsengewebe einer einzelnen, 4 Wochen alten Spenderratte beträgt 1 x 106 Zellen.- Bei Organoiden das Filtrat entsorgen. Mamma-Organoide bleiben im Korb des Zellsiebes und kleinere, unerwünschte Zellen werden eliminiert. Invertieren Sie das Zellsieb über ein neues 50 ml-Rohr, und spülen Sie mit jedem Volumen, das notwendig ist, um die Zellen zu sammeln. Fahren Sie mit Schritt 3.12 fort.
- Bei monodispersen Zellen entsorgen Sie das Zellsieb und behalten sie das Filtrat, da die Epithelzellen der Brust den Filter durchlaufen, zusammen mit kleineren Stromal- und Immunzellen. Spülen Sie das Rohr, das für die Verdauung/Zentrifugation verwendet wurde, mit einem anderen Volumen von DMEM/F12 mit 10% FBS und durchlaufen Sie dasselbe Zellsieb. Pellet die monodispersen Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 x g für 5 min. Fahren Sie mit Schritt 3.12 fort.
HINWEIS: Die resuspendierten Zellen sind für nachfolgende Anwendungen bereit.
- Pulsdrehen Sie die Lösung und stellen Sie die Bildung eines Zellpellets sicher, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Pulsdrehung, falls erforderlich, wieder.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Setzen Sie das Pellet in einem kleinen Volumen (1.000-2.000 l DMEM/F12) wieder auf, um die Zellen zum Zählen zu konzentrieren.
- Zählen Sie Zellen und verdünnen Sie bei Bedarf. Setzen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen für die Transplantation in 20 L DMEM/F12-Medien für jedes Tier aus. Halten Sie die Zellen immer auf Eis.
HINWEIS: Spenderzellzahlen im Bereich von 1 x 105 - 1 x 106 Zellen werden für jede Transplantatstelle auf der Grundlage des Endpunkts der Studie benötigt. Beispielsweise erfordern Carcinogenese-Experimente im Vergleich zu anderen Anwendungen oft eine größere Anzahl transplantierter Zellen. Die Anzahl der benötigten Zellen muss für jeden Stamm experimentell bestimmt werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren nutzte 250.000 Spenderzellen in 20 L-Medien pro Transplantatstelle vor dem Mischen mit Hirnhomogenat, wie in Schritt 3.16 beschrieben. - Bereiten Sie alle Aliquot(s) von Zellen vor, die für andere Experimente benötigt werden (z. B. FACS-Isolation3,26,27,30,33).
- Für Organoide fahren Sie mit Schritt 3.16 fort.
- Für monodisperse Zellen, quantifizieren Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypan oder Methylen blau Färbung, und dann fortfahren.
- Bereiten Sie einzelne Chargen von Spendermaterial für alle Transplantationsempfänger vor. Kombinieren Sie gleiche Volumina der Zellsuspension (20 l) mit 50% Gehirnhomogenat (20 l) für jeden Ort der Transplantation.
HINWEIS: An jedem Standort werden insgesamt 40 L pro Standort injiziert, es wird jedoch empfohlen, mindestens 25 % zusätzliches Volumen für Abfälle aufzunehmen. - Gehen Sie sofort zur Transplantation oder einfrieren Sie Zellen für die Transplantation später (potenzieller Haltepunkt).
HINWEIS: Gefrorene Zellen wurden nicht mit diesem Protokoll getestet und müssen im Vorfeld einer Tierkohorte für Transplantationsexperimente optimiert werden. Es wird dringend empfohlen, frische Zellen zu transplantieren.
4. Transplantationsverfahren (Empfängerratten im Alter von 4-5 Wochen)
- Wiegen Sie jede Empfängerratte und berechnen Sie die richtige Dosis des zugelassenen Analgetikums, das im Verfahren verwendet wird.
HINWEIS: Körpergewichte können bis zu 24 h vor dem Eingriff gemessen werden. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien, um jedes Tier für die Dauer der Rasur zu befolgen oder kurz zu beanstanden. - Rasieren Sie den Operationsbereich auf jedem Tier mit elektrischen Clippern. Identifizieren Sie die Basis des Schädels und den Beginn der Wirbelsäule. Etwa ein Drittel des Weges nach unten die Wirbelsäule, rasieren Sie eine 3 cm x 2 cm Fläche auf dem oberen brustförmigen Teil des Rückens.
HINWEIS: Das Rasieren kann auch unter Anästhesie am Tag der Transplantation durchgeführt werden, muss aber außerhalb des sterilen Feldes durchgeführt werden. Bringen Sie die Ratte in ihren Heimischen Käfig zurück, bis sie benötigt wird. - Suchen Sie alle für die Transplantation benötigten Vorräte (Tabelle 1).
- Bewerten Sie das Labortieranästhesiesystem vor der Anwendung. Top off alle Flüssigkeiten und ersetzen Sie alle Tanks oder Teile, die benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Gasleitung zur Anästhesiekammer geöffnet ist und alle peripheren Leitungen geschlossen sind, so dass Isoflurananästhesie und Sauerstoff frei zum Tier fließen können, sobald es in die Kammer gelegt wird.
- Warme Heizkissen zur Unterstützung der Körpertemperatur der Empfängertiere.
- Generieren Sie das sterile Feld, das für die Operation verwendet wird. Ordnen Sie die Lieferungen wie in Tabelle 1beschrieben an.
- Verabreichen Sie präoperatives Schmerzmittel an Empfängerratten, wie durch das institutionell zugelassene Tierpflegeprotokoll angegeben.
- Spülen Sie die Hamilton-Spritzen mit sterilen DMEM/F12-Medien, um Zellverlust zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Nadel am Körper der Spritze befestigt ist, legen Sie die Nadel in die Flüssigkeit ein und ziehen Sie den Kolben zurück. Füllen Sie auf das maximale Volumen. Drücken Sie den Kolben nach unten und vertreiben Sie den Inhalt in ein Abfallsammelrohr. Wiederholen Sie dies 3-5 Mal.
- Laden Sie das gesamte Volumen des Spendermaterials (in Schritt 3.16) in eine separate Spritze für jede Bedingung (z. B. Kontrolle, behandelt, Wildtyp, Knockout usw.). Setzen Sie die Spitze der Nadel in die Flüssigkeit ein, ziehen Sie den Kolben zurück und halten Sie die Nadel unter der Oberfläche des Gemischs, wenn das Volumen im Rohr abnimmt.
HINWEIS: Fügen Sie mindestens 10 % zusätzliches Volumen in jede Spritze ein. Entsorgen Sie das restliche Gemisch nicht, schließen Sie das Rohr und halten Sie es auf Eis, falls mehr benötigt wird. - Invertieren Sie die Spritze, nachdem sie vollständig geladen ist, und drücken Sie den Kolben leicht, um Luftblasen an der Spitze der Nadel zu entfernen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn alles vorbereitet ist.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Nadel niemals eine andere Oberfläche berührt, auch nicht innerhalb des sterilen Feldes. Es ist hilfreich, den Körper der Spritze über einen kleinen Behälter mit Eis zu ruhen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu fördern. - Legen Sie das Empfängertier in die Anästhesiekammer und schalten Sie die Maschine ein.
- Wenn das Tier vollständig entspannt ist (reagiert nicht auf Klopfen oder sanfte Bewegung der Kammer), richten Sie die Anästhesie auf den Nasenkegel und übertragen Sie das Tier auf das sterile Feld.
HINWEIS: Die verlängerte Dauer der Anästhesie wird von Ratten nicht gut vertragen. Führen Sie das Verfahren für jedes Tier in 10 min oder weniger aus. - Legen Sie das Tier in eine anfällige Position (auf dem Bauch), so dass der Hinterkopf und die obere Wirbelsäule zugänglich ist.
HINWEIS: Sorgen Sie für eine ausreichende Wärmeunterstützung für das Tier und bewerten Sie regelmäßig die Tiefe der Anästhesie mit einer festen Zehenprise. - Optional, ophthalmologische TierarztSalbe anwenden, um das Trocknen der Augen zu verhindern.
- Reinigen Sie den frisch rasierten Bereich, um überschüssiges Haar zu entfernen. Verwenden Sie eine kreisförmige Bewegung und wenden Sie 70% Ethanol (oder ein anderes Reagenz, nach institutionellen Richtlinien) auf die Haut, gefolgt von einem Antiseptikum (wie Jod), und wiederholen. Legen Sie ein Handtuch über das Tier, so dass nur die Region für den rasierten Bereich ausgesetzt ist.
- Stellen Sie sicher, dass das Tier mit einer festen Zehenzange nicht auf tiefe Reize reagiert, und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
- Machen Sie einen kleinen (2 cm) Zwischenschnitt mit einer scharfen chirurgischen Klinge.
HINWEIS: Der Schnitt muss oberflächlich sein, da sich das Fettpolster direkt unter der Haut befindet. - Suchen Sie das mediale Blutgefäß zur Orientierung (Abbildung 2B).
- Heben Sie die Haut auf einer Seite des Schnittes mit Zangen und halten Sie sie vom Fettpolster weg, während die Transplantation durchgeführt wird (Abbildung 2B). Setzen Sie die Nadel in die Transplantatstelle ein.
- Optional bewegen Sie die Spitze der Nadel innerhalb des Gewebes und erstellen Sie eine kleine Tasche, um die Zellen zu sammeln. Verwenden Sie eine kleine, sich wiederholende Bewegung. Entfernen Sie die Nadel nicht.
HINWEIS: Dieser Schritt wird für Erstbenutzer des Protokolls empfohlen. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie eine Tasche erstellen, da das interscapuläre Fettpolstergewebe sehr empfindlich ist.
- Optional bewegen Sie die Spitze der Nadel innerhalb des Gewebes und erstellen Sie eine kleine Tasche, um die Zellen zu sammeln. Verwenden Sie eine kleine, sich wiederholende Bewegung. Entfernen Sie die Nadel nicht.
- Injizieren Sie vorsichtig 40 l des Zellgemisches in das interscapuläre Fettpolstergewebe. Entfernen Sie die Nadel langsam.
- Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle und lassen Sie die transplantierten Zellen für 3-5 s zu begleichen. Verwenden Sie ein zusätzliches Paar Zangen, wenn nötig.
- Entfernen Sie die Nadel. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang (Schritte 4.18-4.21) am zweiten Ort der Transplantation.
HINWEIS: Das Epithel einer Spendergruppe kann in die gleiche Seite des Fettpolsters bei jedem Tier oder abwechselnde Seiten injiziert werden, um Chargeneffekte durch die Handdominanz des Chirurgen zu verhindern. - Schließen Sie die chirurgische Wunde mit Wundclips oder Nähten, und brechen Sie dann die Anästhesie ab.
- Bereitstellung postoperativer Analgetika gemäß institutionellen Protokollen angegeben.
- Das Tier sofort mit der Wärmeunterstützung in einen Bergungskäfig bringen. Überwachen Sie Anzeichen von Not wie Blutungen durch den Schnitt oder Atembeschwerden.
HINWEIS: Das Tier sollte sich innerhalb von 5-10 min vollständig erholen. Siehe institutionelle Richtlinien für die Rückführung von Tieren in die Kolonie und die postoperative Überwachung nach Überlebensprozeduren. - Optional führen Sie Carcinogenese-Studien an der/den Transplantationsstelle(n) durch, indem Sie den Empfängerratten 3-4 Wochen nach der Transplantation Karzinogenese-Studien verabreicht.
HINWEIS: In der Regel wird die Karzinogenese der Ratten mit einer chemischen karzinogenen Behandlung im Alter von 50-57 Tagen durchgeführt. Diese Behandlung diktiert das Alter der Transplantationsoperation (die zwischen 29-36 Tagen durchgeführt werden muss), um genügend Zeit für die transplantierten Zellen zu lassen, um das Wachstum der Brustdrüse zu initiieren.
5. Bewertung des epitheliaalen Auswuchses
- Überwachen Sie den Estrus-Zyklus von Ratten durch die tägliche vaginale Spülung und untersuchen Sie die Zytologie auf einem Mikroskop-Dia. Beginnen Sie 8-12 Tage vor dem Ende der Studie. Opfern Sie alle Ratten in der gleichen Stufe. Dies ist ein optionaler Schritt.
HINWEIS: Der Ratten-Estrus-Zyklus beträgt 4-5 Tage. Wenn das Tier durch 1-2 volle Zyklen gehen kann, wird die Interpretation erleichtert, da Lavage-Dias aus früheren Zyklen zum Vergleich verwendet werden können. - Opfern Sie Transplantationsempfängerratten 6-8 Wochen nach der Transplantation, gemäß den institutionellen Richtlinien.
HINWEIS: Das Auswachsen ist in der Regel 3-6 Wochen nach der Transplantation nachweisbar, aber es kann zusätzliche Zeit erforderlich sein. - Setzen Sie das Tier in eine anfällige Position und reinigen Sie den Körper mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit Dereins und machen Sie einen Schnitt entlang der Wirbelsäule, um das mittelskapulierkuläre Fettpolster freizulegen. Sezieren Sie die Haut weg vom Gewebe, so dass der Großteil des Fettpolsters sichtbar ist.
- Identifizieren Sie das mediale Blutgefäß, das die Transplantatstellen im interscapularen Fettpolster trennt. Schneiden Sie das gesamte Pad als ein einzelnes Stück Gewebe oder schneiden Sie entlang des Blutgefäßes und entfernen Sie die Seiten einzeln.
- Legen Sie das Gewebe auf ein positiv geladenes Mikroskopschlitten für die gesamte Halterung. Verwenden Sie 2 Paare von stumpfen Zangen und sanft das Gewebe zu verteilen, um seine ursprüngliche Konformation auf dem Dia wiederherzustellen.
HINWEIS: Rattenbrustgewebe ist extrem empfindlich. Die Ränder des Gewebes können sich unter sich selbst krümmen. Behandeln Sie immer mit Sorgfalt und halten Sie an Ort und Stelle, bis das Gewebe an der Rutsche haftet (ein paar Sekunden). - Ganzberg mindestens eine der endogenen Abdominal-Leisten-Brustdrüsen (mit Lymphknoten zur Orientierung) zum Vergleich.
- Legen Sie die Dias in 70% Ethanol für 7-10 Tage, um das Gewebe zu entschärfen. Ethanol so oft wie nötig auffüllen, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet.
- Bereiten Sie Alum-Caramin-Färbung vor und verarbeiten Sie die Dias, wenn das Gewebe ausreichend undurchsichtig ist. Lassen Sie den Fleck vor der Verwendung abkühlen (Zusatzdatei 4).
HINWEIS: Der Fleck kann bis zu einem Tag vor den Fixations- und Rehydrierungsschritten vorbereitet werden. Die Lösung kann bei 4 °C gelagert werden und hat ein begrenztes Wiederverwendungspotenzial. - Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie die Dias in 25% Eisessigsäure platzieren: 75% Ethanol für 60 min.
- Rehydrieren Sie das Gewebe durch eine Reihe von 3 Wässen in einer Reihe von abnehmenden Konzentration von Ethanol: 70% Ethanol für 15 min, 50% Ethanol für 5 min und dH2O für 5 min.
- Mit Alum-Carmine für 4-8 Tage färben. Überprüfen Sie jeden Tag die Rückseite der Dias, um festzustellen, ob der Fleck vollständig in das Gewebe eingedrungen ist. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Färbung abgeschlossen ist.
HINWEIS: Die Färbung ist abgeschlossen, wenn die dicksten Teile der Drüse einen violetten Farbton haben und nicht mehr weiß erscheinen. - Das Gewebe zu entwässern und zu dehydrieren, indem die Dias durch eine Reihe von zunehmenden Ethanolkonzentrationen übertragen werden: 70% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min und 100% Ethanol für 30 min.
- Legen Sie dehydrierte Dias in Xylol für 3+ Tage, um das Gewebe zu löschen. Transfer zu Mineralöl zur Langzeitlagerung.
- Nachdem die Dias gelöscht wurden, verwenden Sie Low-Power-Lichtmikroskopie oder hochauflösende digitale Fotografie, um Bilder der Dias für die Analyse zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass die Bildaufnahmeparameter für alle Folien konsistent sind.
HINWEIS: Epithelwachstum muss deutlich unterscheidbar sein. - Behandeln Sie das Vorhandensein von Wachstum als binäres Ergebnis.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der transplantierten Epithelzellen, die in 50 % der Transplantatstellen unter Verwendung der aufgenommenen Bilder ein Brustwachstum von 1 € produzierten. Quantifizierung anderer physischer Merkmale bei Bedarf.
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Representative Results
Spender und Empfänger Brustdrüsen
Die Schritte zur Isolierung und Vorbereitung von Ratten-Mamma-Epithelzellen für die Transplantation sind in Abbildung 1Adargestellt. Im Alter von 4 Wochen hat die endogene Brustdrüse der Spenderratte mit der Reifung begonnen und Epithel kann auf ganzen montierten Dias visualisiert werden, die mit Alumcarmine gefärbt sind (Abbildung 1B). Eine Spenderratte in diesem Alter wird etwa 1 x 106 Zellen für die Transplantation zur Verfügung stellen. Wenn die Menge des gesammelten Spendergewebes oder der anschließenden Hacken nicht ausreicht, kann die Ausbeute der Zellen nach der Kollagenaseverdauung gering sein. Daher ist es wichtig, so viel Brustdrüsengewebe wie möglich von den Spendern zu sammeln. Vollständig verdautes Brustdrüsengewebe sollte ein öliges Aussehen haben, ohne sichtbare Gewebestücke in der Suspension (Abbildung 1C). Die vollständige Verdauung des Brustdrüsengewebes von einem einzigen Spender sollte zur Bildung eines sichtbaren Pellets führen, das die Mamma-Organoide enthält, wie in Abbildung1Ddargestellt. Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist, kann der Test optimiert werden. In Abbildung 2werden Rattenbrustdrüse und interscapuläre Fettpolsterpositionen dargestellt. Die Ergebnisse können nur interpretiert werden, wenn biologische Bezugspunkte zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme (Abbildung 2A) und der Transplantation (Abbildung 2B) ordnungsgemäß identifiziert wurden. In diesem Test wird das mediale Blutgefäß des interscapularen weißen Fettpolsters als biologischer Bezugspunkt verwendet.
Qualitative und quantitative Bewertung des epitheliaalen Auswuchses
Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Fülle von Epithel kann bewertet werden, um den Erfolg des Experiments zu bestimmen, sowie die Autonomie von Effekten im Zusammenhang mit experimentellen Variablen. Für letztere können bestimmte Studien ganze montierte Dias mit der endogenen Bauch-Leisten-Brustdrüse des Wirts zum Vergleich erfordern. Als vorläufige Maßnahme kann die Lichtmikroskopie verwendet werden, um das epitheliale Auswachsen als binäres Ergebnis zu dokumentieren. Diese Daten können statistisch analysiert werden, um die Hypothese zu testen, dass die Transplantatabstoßung von Spender- oder Empfängervariablen abhängig ist. Ein reziprokiertes Transplantationsexperiment, bei dem jeder dieser Faktoren zwei Ebenen hat - zum Beispiel Wildtyp (WT) vs Knockout (KO), wird 4 Transplantationsgruppen für Hypothesentests erstellen (Abbildung 3A). Die Transplantationsgruppen, ausgedrückt als Spender:Empfänger-Genotyp, sind: WT:WT, WT:KO, KO:KO, KO:WT. Wenn isogene oder nahezu kongene Tiere verwendet werden, ist die Transplantatabstoßung gering und tritt in allen Transplantationsgruppen gleichermaßen auf. Ein Vorteil mehrerer Transplantationsstandorte innerhalb des interskapularen Fettpolsters ist eine Reduzierung der benötigten Empfängertiere, da 2 Spenderzelltypen in einem einzigen Wirt bewertet werden können. Darüber hinaus können beide Standorte verwendet werden, um einen einzelnen Spenderzelltyp mit einer höheren Inzidenzrate zu testen, mit der gleichen Anzahl von Ratten. Am Beispiel des Genotyps wird dies in Abbildung 3Bgezeigt.
Das epitheliale Auswuchs kann auch anhand von Bildern der zuvor erfassten Dias analysiert werden. Ein Beispiel für ein ganzes montiertes interskapulares Fettpad, das epitheliale Auswüchse an beiden Transplantatstellen enthält (als positive Ergebnisse aufgezeichnet), wird für ein Experiment mit dem hier beschriebenen Mammarienzelltransplantationsprotokoll gezeigt (Abbildung 3C). Der Mangel an Epithel im interskapularen Fettpolster über viele Proben kann auf ein technisches Problem mit dem Verfahren hinweisen und wird als negatives Ergebnis behandelt.
Das Ergebnis gegenseitiger Transplantationsexperimente kann weiter genutzt werden, um Effekte zu unterscheiden, die autonom oder nicht autonom zu Denepithelzellen der Brust sind. Um die Hypothese zu testen, dass ein Effekt durch Prozesse in den Brustepithelzellen (zellautonom) angetrieben oder durch die Wirts-Mikroumgebung (nicht-autonom) beeinflusst wird, wird die Übereinstimmung des Spenderzell-Phänotyps mit dem des (endoogenen) Phänotyps des Wirts (endoogenen) als dichotomes Ergebnis behandelt. In einem Beispiel wie einem Carcinogenese-Assay kann die Tumorinzidenz als binäre Reaktionsdaten analysiert und eine logistische Regressionsanalyse verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Interaktion zwischen Spender, Wirt oder Spender-Host erheblich zur Tumorinzidenzrate an der Transplantationsstelle beiträgt. Wenn der Effekt durch die Eigenschaften des Spenderepithels getrieben wird, kann ein ähnliches Transplantationsergebnis über Empfängergruppen hinweg beobachtet werden, unabhängig vom Zustand des Gastgebers. Wenn sich das Spenderepithel aufgrund eines Beitrags des Genotyps oder der Behandlung des Wirts so entwickelt, als wäre es endogene dem Wirt, kann die Wirkung nicht autonom sein. In beiden Situationen sollten die Transplantationsgruppen, in denen die Epithelzellen der Spender dem Wirt entsprachen (Selbst:selbst), als Kontrollen interpretiert werden und Schlussfolgerungen, die durch statistische Analysen gestützt werden.
Um Die Ergebnisse autonomer und nicht-autonomer Wirkungen auf transplantiertes Epithel zu veranschaulichen, wurde eine Illustration bereitgestellt (Abbildung 4A), zusammen mit Dias aus der gegenseitigen Transplantation wilder Art und Cdkn1b Knockout-Ratten-Mammathelexperimenten. Die Ergebnisse dieser Studie legten nicht-mammäre zellautonome Effekte nahe18 (Abbildung 4B). Bei wechselseitigen Transplantationsergebnissen, die als binäre Reaktion klassifiziert sind, kann die Wahrscheinlichkeit, dass das Ergebnis (z. B. Konkordanz des Phänotyps mit dem Wirtsepithel oder erfolgreiches Wachstum in quantitativen Assays) von kategorialen Variablen (z. B. Spender- oder Empfängergenotyp) abhängig ist, durch Die Erstellung eines logistischen Regressionsmodells für Haupteffekte und Wechselwirkungsbegriffe getestet werden.
Abbildung 1: Vorbereitung der Spender-Brustdrüsen. (A) Überblick über das Verfahren zur Extraktion von Brustdrüsengewebe von Spendertieren und zur Rückgewinnung von Organoiden zur Transplantation. (B) Ganzmontierte endogene Bauch-Leisten-Brustdrüsen einer 4 Wochen alten Ratte (typisches Alter von Transplantationsspendern), nach Alum-Karmin-Färbung. Im Alter von 4 Wochen war das Brustepithel im Begriff, sich auszudehnen, aber der duktale Baum dringt nicht vollständig in das Fettpolster ein, wie die Nähe zu den zentralen Lymphknoten zeigt. (C) Die Konsistenz der gehackten Brustdrüse wird nach dem Hacken (rosa) in einer 60 mm Schale auf Eis gezeigt, mit einer entsprechenden Menge an DMEM/F12-Medien, um sie feucht zu halten. Die angrenzenden Bilder bieten einen Vergleich des gehackten Epithels nach der Übertragung der Gülle auf Collagenase Digestion Media und wenn die Verdauung abgeschlossen ist, 90-120 Minuten später. (D) Die pelletierten Epithelorganoide und die Schichttrennung sind nach der Zentrifugation sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Identifizierung von Grenzen für die Gewebesammlung und die Injektion von Brustepithelzellen. (A) Standorte der Rattenbrustdrüsen zur Gewebesammlung werden gezeigt. Die ungefähre Lage der endogenen Abdominal-Leisten-Brustdrüsen, die von Spendern und Empfängern geerntet wurden, wird skizziert. (B) Nach der Rasur und einem oberflächlichen Schnitt wird das weiße zwischensakuläre Fettpolster eines Transplantationsempfängers freigelegt. Oberes Bild: Das mediale Blutgefäß (gelber Pfeil) ist in der Mitte des Einschnitts sichtbar. Unteres Bild: Die Haut auf einer Seite des Schnittes wird angehoben, um die Breite des IS-Fettpolsters unter der Haut zu zeigen, relativ zum medialen Blutgefäß (gelber Pfeil). Spenderepithel wird unter dieser Klappe in das Fettpolster injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gegenseitiges Transplantationsschema. (A) Typisches experimentelles Design für die gegenseitige Transplantation wird am Beispiel von Genotypen gezeigt. Durch das Testen einer einzelnen experimentellen Variable, wie z. B. Gen Knockout (KO) im Verhältnis zum Wildtyp-Epithel (WT), entstehen 4 Transplantationsempfängergruppen. (B) Beispieldesign für ein einzelnes Empfängertier, das 2 Injektionen von Spendermaterial erhält. Mehrere Standorte für die Transplantation sind zugänglich, wenn sie das interscapuläre weiße Fettpolster verwenden, da ein Blutgefäß entlang der Mittellinie vorhanden ist. Separate Präparate des Wildtyps und Desk.-Spender-Epithel (oder andere Testbedingungen) können links und rechts des Blutgefäßes injiziert werden. (C) Repräsentatives ganzes montiertes IS-Fettpolstergewebe eines Transplantationsempfängers wird in der gleichen Ausrichtung angezeigt wie in dem inBdargestellten Beispiel. Das epitheliale Auswachsen der Mamma ist an zwei Transplantationsstellen auf einer ganz montierten Rutsche mit Alum-Karmin-Gefärbtgewebe sichtbar. Das interskapulierliche Fettpolster wurde 6 Wochen nach der Transplantation als Einzelstück ausgeschnitten. Zusätzliche Zeit für die Epithelentwicklung kann benötigt werden, kann aber auch Überwucherung und Schwierigkeiten bei der Unterscheidung einzelner Spendertransplantate erleichtern. Häufige biologische Artefakte können sichtbar sein: MS = Muskel, TP = transplantiertes Epithel, BF = braunes Fettgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Autonome und nicht-autonome Analyse der Mammazellen. (A) Simulation von Ergebnissen, die beobachtet werden können, wenn signifikante Beiträge autonomer und nicht-autonomer Wirkungen auf den Phänotyp des Spenderepithels auftreten. In diesem Beispiel werden die endogenen Bauch-Leistendrüsen des Wirts als Vergleich verwendet. Die Konkordanz des Phänotyps des Epithelwachstums des Spenders im Vergleich zur endogenen Drüse kann als Referenz verwendet werden, sollte aber nicht ausschließlich zur Bestimmung von Wirkungen verwendet werden. (B) Spender-Mammaepithelwachstum wird am Ort der Transplantation gezeigt, neben Bildern der endogenen Drüse für alle 4 Gruppen in einem gegenseitigen Transplantationsexperiment. Nicht-autonome Wirkungen auf Dasmammaepithel, die nach dem Knockout eines einzelnen Gens, Cdkn1b,beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass die Mikroumgebung des Wirts die sich entwickelnde Rattenbrustdrüse18betrifft. Maßstabsleisten stellen 5 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Schritt erforderlich | Artikel auf Eis | Aufgetaut/Vorgewärmt | Artikel in der Nähe von surgeon |
| 1. Herstellung von Brustdrüsenepithel | 60 mm Schale | Sterile chirurgische Werkzeuge | |
| Aliquot von DMEM/F12 | 70% Ethanol | ||
| 2. Spender-Gehirnextraktion | Aliquot von Medien in 15 oder 50 ml Rohr (ca. 1-2 ml/Spender) | Balance zum Wiegen des Gehirns im sterilen Feld | |
| Beschriftetes 15 ml Rohr für jeden Spender, geeignet für homogenisierung | Folie | ||
| Pipette und Spitzen (1000 l oder elektronisch mit 5 ml serologischen Pipetten) | |||
| Mechanischer Homogenisator | |||
| 3. Enzymatische Verdauung von Spenderdrüsen | Ausreichend DMEM/F12 für Wässer | Serumfreie Verdauungsmedien | Laborskala (g) |
| DNAse I | Monodispersionsmischung | Inkubator/Shaker | |
| Inaktivierungslösung | 50 ml Schlauch (beschriftet) für jeden Spender | ||
| 10 ml (oder höher) Spritze für sterilfilternde Kollagennase-Verdauungsmedien | |||
| 20-40 -M-Filter | |||
| Aliquot von Medien zu Vor-Nass-Filter(n) | |||
| 50 ml Tuben zum Sammeln gefilterter Enzymlösung | |||
| Sterile Schere zum Schneiden von Einweg-Pipettenspitzen | |||
| Großer Becher zum Sammeln von Überstand oder Vakuumleitung zum Ansaugen | |||
| 4. Transplantation | Spenderepithel + Hirnhomogenat-Mischung | Hamilton Spritzen – 1 pro Spendergenotyp/Zustand | |
| Aliquot von DMEM/F12 zu Prime Spritzen | Skala | ||
| Sterile chirurgische Versorgung (Skalpell/Schere, Mehrfachzange) | |||
| Wundclips/Nähte | |||
| Gaze | |||
| 70% Ethanol oder Isopropanol | |||
| Beta-Dine oder Jod | |||
| Analgetische | |||
| Wärmeunterstützung für Empfängertiere | |||
| Papiertücher oder filigrane Aufgabentücher |
Tabelle 1: Elemente, die bei jedem Schritt einer Vorprüfung bedürfen. Diese Liste dient als Referenz bei der Vorbereitung eines Experiments und sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden. Reagenzien dürfen nur für bestimmte Anwendungen des Protokolls erforderlich sein, die auf der Einbeziehung/Ausschluß fakultativer Schritte beruhen. In jedem Experiment müssen diese Elemente nach dem Start der Prozedur unverzüglich zugänglich sein.
Ergänzende Datei 1: Serum-freie Collagenase Verdauung Medienvorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Akte 2: Monodispersion Sischemischzubereitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Datei 3: Inaktivierungslösungvorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Datei 4: Alum-Carmine Flecken Vorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Brustepithelzelltransplantationstechnik, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist. Isolierte Epithelorganoide von Spenderratten (3-5 Wochen alt) werden in das interskapulierliche weiße Fettpolster der Empfängerratten (ebenfalls 3-5 Wochen alt) eingepfropft. Die Ergebnisse können nur 4-6 Wochen später interpretiert werden, mit Hilfe der Lichtmikroskopie, um das transplantierte Gewebe zu untersuchen; Allerdings muss vor der Durchführung eines vollständigen Experiments die optimale Zeit zwischen Transplantation und Opfer bestimmt werden. Wenn zu wenig oder zu viel Zeit vergangen ist, sind die Ergebnisse weder interpretierbar noch aussagekräftig. Um das Protokoll zu optimieren, analysieren Sie das Auswachsen in einem kleinen Satz von Tieren 6-8 Wochen nach der Transplantation. Wenn das transplantierte Epithel vorhanden ist, aber unterentwickelt ist, erhöhen Sie die Zeit. Wenn die Transplantate gut entwickelt sind, aber sich überlappende Merkmale des Epithels mit den Analysen stören, sollten Sie die Anzahl der Wochen für epitheliale Auswüchse reduzieren. Wenn die Zeit nicht verkürzt werden kann (z. B. in Carcinogenese-Experimenten), wird empfohlen, den gleichen Spender-Epithel-Typ in beide Transplantationsstellen zu injizieren (eine auf jeder Seite des medialen Blutgefäßes), da die Ergebnisse nicht von Mit 100% Sicherheit. Wenn irgendeine Art von Interaktion (Autokrin, Parakrin) vermutet wird, wird dringend empfohlen, zusätzliche Kontrolltiere, die mit der gleichen Art von Spenderepithel in beide Transplantationsstellen injiziert werden, aufzunehmen. Kritische Schritte im Verfahren sind eine korrekte Quantifizierung der Spenderzellen nach der enzymatischen Verdauung und eine gleichmäßige Vermischung mit Hirnhomogenat. Bei diesen Schritten muss besonders darauf geachtet werden, dass die Anzahl der transplantierten Zellen bei den Empfängertieren konsistent ist. Achten Sie während der Injektion auch darauf, dass die transplantierte Gewebemischung nicht aus dem mittelskapulierten Fettpolster austritt. 3. Excising der interscapularfetten Pad am Endpunkt des Experiments. Das gesamte Pad kann als einzelstück entfernt werden, aber vorsichtshalber ist, wenn man sich entscheidet, die beiden Seiten des zwischenförmigen Fettpolsters zu trennen und erst nach der Identifizierung des medialen Blutgefäßes zu schneiden. Es kann schwierig sein, die Seite zu bestimmen, von der aus das Auswuchs entstanden ist, vor allem, wenn ein Transplantat in das andere überwuchert ist, was die Entfernung als einzelnes Stück idealer macht.
Eine häufige Änderung des Verfahrens ist die Zugabe einer krebserregenden Behandlung der Empfängerratte25,29. Das transplantierte Gewebe kann die Anfälligkeit für Karzinogenese behalten, die von der Spenderratte25besessen wurde, oder umgekehrt kann das Spendergewebe die Anfälligkeit des Wirtsübernehmen 30. Diese Effekte können nur bestimmt werden, wenn das interskapuläre Fettpolster als Ort der Transplantation verwendet wird, da die endogenen Brustdrüsen intakt bleiben und als positive, interne Kontrolle fungieren.
Bei der Verwendung von Brustdrüsenorganoiden für die Transplantation kann das Fehlen von epithelialem Wachstum auf Probleme mit der Spenderzellvorbereitung oder dem Injektionsverfahren zurückzuführen sein. Graft-Ablehnung kann auch auftreten, wenn der Empfänger und der Spenderstamm nicht kongogen sind, was eine Immunantwort im Wirt verursacht. In solchen Fällen erkennt das Immunsystem des Empfängers das Spendergewebe als nicht selbst, löst eine Immunantwort aus, und das transplantierte Gewebe wächst nicht. Um das Risiko eines Transplantatversagens zu reduzieren, wenn Spender und Empfänger unterschiedlichen genetischen Hintergrund haben, werden mindestens 6 und im Idealfall mehr als 10 Generationen von Backcrossing empfohlen, um Herausforderungen zu vermeiden, die sich auf die Ergebnisinterpretation auswirken können. Bei 6 Backcross-Generationen werden die meisten Transplantate auswachsen, aber eine Minderheit könnte immer noch scheitern. Bei der Fehlerbehebung bei der Vorbereitung von Spenderzellen als Ursache für Transplantatversagen sollten Sie prüfen, ob die enzymatische Verdauung zu hart war, die Zellen bei zu hohen oder zu niedrigen Temperaturen gehalten wurden, Kontaminationsquellen, Optimierung der Spenderzellzahlen, die für den Test verwendet wurden oder andere Protokollabweichungen, die die Zelllebensfähigkeit und das Wachstum beeinflussen.
Einzelne Bruststammzellen wurden in der Maus gezeigt, um eine funktionelle Brustdrüse rekonstruieren zu können, was zeigt, dass die Zugabe von hormoneller Unterstützung für das primäre Ergebnis nicht notwendig ist. Die Zugabe von Hirnhomogenat verbessert das Ergebnis der Transplantation erheblich, indem sie als Strukturmatrix für die Spenderzellen dient und das Risiko einer Abstoßung von Migrationstransplantationen3,34,35,36reduziert. In Kombination mit Gehirnhomogenat wird die mindeste Anzahl der für die Transplantation erforderlichen Brustepithelzellen im Vergleich zu alternativen3um mehr als das Zehnfache reduziert. Wichtig ist, dass die Beimischung von syngenem Hirnhomogenat nicht gezeigt wurde, dass sie den Phänotyp des transplantierten Epithels beeinflusst, und hat seit über 40 Jahren konsistente Ergebnisse in Mammakarzinogenese- und Anfälligkeitsstudien hervorgebracht.
Einige mögen argumentieren, dass das interskapuläre Fettpolster aufgrund der anatomischen Unterschiede nicht repräsentativ für das endogene Brustfettpad ist: die Nähe des IS-Fettpolsters zu braunem Fettgewebe, mögliche Unterschiede in der Blutgefäßdichte, die zu Unterschieden in der Exposition gegenüber Hormonen oder dem Vorhandensein prominenter Lymphknoten im Leisten-Bauch-Fettpad führen, die das Epithel verschiedenen Zytokinspiegeln aussetzen können. Obwohl dies nicht speziell an Ratten getestet wurde, sind beide Depots subkutan und entwickeln sich vor viszeralem Fett37,38; in menschlichen Fetten gibt es größere molekulare Unterschiede zwischen Denkopodenregionen, und die Heterogenität innerhalb von Gruppen ist nicht vollständig verstanden38,39. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist, dass die weißen interskapulären und brustförmigen Fettpolster Myf5+ mesenchymale Vorläuferlinie teilen, sich aber in der Anzahl der Zellen unterscheiden, die von dieser Population abgeleitet werden40. Ungeachtet dessen gibt es genügend Hinweise darauf, dass das weiße interskapulierhaltige Fettpolster eine Mikroumgebung bietet, die der der unteren Brustdrüse ähnelt. Mammary Epithel recombined with its own mesenchyme develops a typical mammary pattern20, a effect that is well-document in nagetier studies and supports the observations in human adipose tissue19,20,24,41,42. Die primären Determinanten des Erfolgs der Brustepitheltransplantation bei Ratten und Mäusen sind vor allem die Größe und Integrität des Fettpolsters43,44. Bei der Verwendung dieser Technik haben viele Brustkrebs-Empfindlichkeitsstudien bewiesen, dass funktionelles Brustgewebe effektiv und routinemäßig erzeugt werden kann, wenn es in das weiße interskapulierfarbene Fettpolster18,30,45transplantiert wird.
Aufgrund der hohen Verträglichkeit ist das epitheliale Auswuchs für brustzellautonome und nicht-autonome Faktoren zugänglich und reagiert auf hormonelle Manipulationen der Empfängerratten, um beispielsweise die Differenzierung oder funktionelle Sekretion von Milch zu fördern. Transplantation von Organoiden wird oft verwendet, um Faktoren zu untersuchen, die die Entwicklung der Brustdrüse und/oder Karzinogenese beeinflussen. Organoide können weiter zu einzelzelligen Suspensionen verdaut werden, um die quantitative Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern. Während die in diesem Papier beschriebene Methode an die Transplantation intakter Abschnitte des Brustdrüsengewebes angepasst werden kann (wie es häufig bei Mäusen durchgeführt wird), ermöglichen die enzymatischen Dissoziationsschritte detailliertere Schlussfolgerungen. Da eine Vorreinigung des endogenen Brustfettpolsters bei der Ratte nicht möglich ist, ist dies derzeit die einzige Methode, die die Transplantation von Ratten-Mammaepithel ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Forschungsfinanzierungsmittel des Hollings Cancer Center es Cancer Center Support P30 CA138313 von den National Institutes of Health (https://www.nih.gov/) und Mittel des Department of Pathology & Laboratory Medicine der Medical University of South Carolina finanziert. Wir danken Marijne Smiths für die Aufzeichnung der Interview-Aussagen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | - | - | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | - | - | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | - | - | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | - | - | |
| Clean animal cages for recovery | - | - | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | - | - | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | - | - | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | - | inactivation solution |
| Gauze | - | - | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | - | monodispersion mixture |
| Heating pads | - | - | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | - | - | |
| Incubator with orbital rotation | - | - | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | - | - | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | - | - | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | - | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | - | - | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | - | - | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | - | - | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | - | - | electric clippers, or other |
| Staining jars | - | - | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | - | - | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | - | - | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | - | - | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
References
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