Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Rotte mammary epitelcelletransplantasjon i Interscapular Hvit Fett Pad

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60401
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

Denne artikkelen beskriver en transplantasjonsmetode for å pode donor rottepattedyr epitelceller i interscapular hvit fett pute av mottakerdyr. Denne metoden kan brukes til å undersøke verts- og/eller donoreffekter på brystepitelutvikling og eliminerer behovet for forhåndsrensing, og dermed utvider nytten av denne teknikken.

Abstract

Så tidlig som på 1970-tallet har forskere vellykket transplantert brystepitelceller i interscapular hvit fett pute av rotter. Podebrystepitel ved hjelp av transplantasjonsteknikker utnytter det hormonelle miljøet som tilbys av den unge gnagerverten. Disse studiene er ideelt egnet til å utforske virkningen av ulike biologiske manipulasjoner på brystkjertelutvikling og dissekere mange aspekter av brystkjertelbiologi. En vanlig, men begrensende, funksjon er at transplanterte epitelceller er sterkt påvirket av den omkringliggende stroma og utkonkurrert av endogene epitel; for å utnytte innfødt brystvev, må abdominal-inguinal hvit fett pute fjernes for å fjerne vert brystepitel før transplantasjon. Et stort hinder når du bruker rottemodellorganismen er at å rydde det utviklende brysttreet i post-avvennede rotter ikke er effektivt. Når transplanteres inn i kjertelfrie fettpads, kan donorepitelceller fylle den ryddet vertsfettputen og danne en funksjonell brystkjertel. Interscapular fett pad er et alternativ sted for disse grafts. En stor fordel er at den mangler kanalstrukturer, men gir den normale stroma som er nødvendig for å fremme epitelutvekst og er lett tilgjengelig i rotten. En annen stor fordel med denne teknikken er at den er minimalt invasiv, fordi det eliminerer behovet for å cauterize og fjerne det voksende endogene pattedyrtreet. I tillegg inneholder interscapular fettputen et medial blodkar som kan brukes til å skille steder for pode. Fordi endogene kjertler forblir intakte, kan denne teknikken også brukes til studier som sammenligner endogene brystkjertel med den transplanterte kjertelen. Dette papiret beskriver metoden for pattedyr epitelcelletransplantasjon i interscapular hvit fett pute av rotter.

Introduction

Postnatal brystkjertelutvikling og ductal morfolever er prosesser som i stor grad påvirkes av hormonell signalering ved utbruddet av puberteten. Hos mus og rotter, ofte brukte modellorganismer av brystkjertelbiologi, begynner denne prosessen rundt 3 uker, hvor rask spredning og differensiering resulterer i dannelsen av det modne parenchymaet. Den modne brystkjertelen kan gjennomgå mange runder med ekspansjon og involution, en eiendom som har vært under etterforskning siden tidlig på 1900-tallet. Innenfor rammen av hyperproliferasjon og kreftutvikling ble brystkjerteltransplantasjonsteknikker utviklet på 1950-tallet1,og forbedret av den kvantitative metodikken bidratt av Gould et al. i 19772,3,4. Raffinement av transplantasjonsteknikken hos gnagere har bidratt til store fremskritt i forståelsen av normal brystkjertelbiologi som fortsatt er mye brukt til å studere effekten av ulike behandlinger og genetisk manipulasjon på normal brystkjertelutvikling og sykdomstilstander.

Mange hypoteser har blitt generert og senere testet ved hjelp av brystkjerteltransplantasjon, først beskrevet av DeOme et al. i 19591. Eksperimenter over flere tiår viste tilbøyelighet en ductal vev utskåret fra donor brystkjertler å befolke hele fett pad5,6,7 og indikerte at en kritisk komponent av brystkjertel utvikling ligger i disse epitelstrukturer. Senere studier på mus viste at en enkelt bryststamcelle kan befolke en ryddet fettpute og bidro til oppdagelsen av en enkelt, vanlig stamfar av basal og luminal brystepitelceller8,9,10. I tråd med disse konklusjonene har det blitt foreslått at transplantasjon øker bassenget av celler med multilineage-repopulating potensial som følge av plastisitet, slik at de transplanterte cellene å vokse en funksjonell brystkjertel7,10,11,12,13. Viktigere, bruk av transplantasjon teknikker i gnagere overvinner begrensningene av cellekultur-indusert abnormiteter14 og gir ofte resultater i løpet av bare noen uker.

Mens prosedyren opprinnelig ble beskrevet i sammenheng med preneoplastiske lesjoner hos mus, ble den snart utvidet til rotter og brukt sammen med kreftfremkallende behandling for å etablere mangfold som et mål på kreftmottakelighet15, men populariteten til transplantasjonsteknikker har fulgt utviklingen av genetiske verktøy for hver art. Selv om musestudier som omfatter transplantasjon har bidratt med mange translasjonelle funn, ligner parenchyma av rottebrystkjertelen mennesket tettere16,17 og tilbyr forskjellige fordeler for å studere østrogen reseptor-positiv (ER+) brystkreft. Brystsvulster er ududige i begge artene, men de varierer i form av hormonfølsomhet og genuttrykksprofiler. En primær forskjell er at rottebrystsvulster uttrykker og avhenger av funksjonen til ovarie- og hypofysenhormonreseptorer, nemlig østrogen og progesteron (PR), som ligner på luminal-A-undertypen av human brystkreft. Faktisk har pattedyr epitelcelletransplantasjon, som beskrevet i denne protokollen, blitt brukt til å studere genetiske varianter involvert i brystkreft og bestemme cellulær autonomi av effekter på brystepitelceller18.

I tillegg til tumorbiologien viser det kanalepitelet til den normale rottebrystkjertelen et høyere nivå av forgrening og flankeres av et tykkere lag av stroma enn musen. Betydningen av stroma er godt dokumentert i mammary epiteltransplantasjon studier. Brystepitel må samhandle med fet stroma, og ideelt sett sin egen mesenchyme, for å gjennomgå sin karakteristiske morfose19,20. Podevev i en mottakerbrystkjertel gir et optimalt miljø; Imidlertid kan tilstedeværelsen av endogene epitel forstyrre resultatene. Preclearing brystkjertelen av endogene epitel utføres vanligvis i musetransplantasjon analyser og krever kirurgisk eksisjon av endogene brystvev og / eller fjerning av brystvorten1,21,22. Selv om det er mulig, preclearing brystepitelet i post-avvenning rotter er ikke så mye utført, hovedsakelig på grunn av ineffektivitet av å rydde det voksende pattedyrtreet i post-avvenning rotter. Siden det har vist seg at regioner av fettvev andre steder i kroppen kan støtte veksten av transplantert brystepitel21,23,24, kan prosessen med preclearing lett unngås hos rotter ved podevev inn i interscapular hvit fett pute.

Transplantasjonsmetoden beskrevet i dette papiret innebærer injeksjon av enzymatically dissosiert brystkjertel organoider (fragmenter av brystkanalepitelepitel og andre celler typer i stand til morfose) eller monodispergerte celler i interscapular fett pad innavlet, isogene eller congene stammer av laboratorierotter2. Fordi interscapular fett pad er normalt blottet for brystvev, det gir et passende miljø for flere transplantasjon nettsteder uten å måtte pre-klare endogene epitel. Som et resultat er vertsdyrets endogene, abdominal-inguinal brystkjertler ikke gjenstand for kirurgisk manipulasjon, utvikler seg normalt, og kan ikke forstyrre tolkningen av resultatene. I tillegg kan de intakte brystkjertlene brukes til sammenligning for å evaluere vertsversus donoreffekter på brystepitelutviklingen og tumorigenese18,25. Selv om gjenpopulasjon av brystkjertelen fra en enkelt stamcelle er tilgjengelig for mus, er den ennå ikke utviklet for rotte, hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelighet av antistoffer for å velge for rottebryststamceller25,26,27. Til tross for dette, transplantasjon av monodispersed bryst epitelceller for å kvantifisere repopulating potensialet kan utføres, og disse cellene vil utvikle seg normalt når podet inn i riktig rammeverk2,3,4. Mens organoider er gode for mange formål, er monodispergerte celler nødvendig for kvantitative anvendelser, for eksempel for å bestemme antall pattedyr epitelceller som kreves for kreftinitiering etter ioniserende strålebehandling28 eller for å sammenligne egenskapene til strømningcytometrisk valgt brystepitelcellepopulasjoner29.

Til dags dato er prosedyren som er beskrevet her den mest robuste metoden for å utføre brystkjerteltransplantasjon i rotten med et overordnet mål om å studere brystkjertelutvikling og mekanismer underliggende brystkreftutvikling. Ofte blir donor- og/eller mottakerdyrene utsatt for forskjellige variabler før, under eller etter epiteltransplantasjonen. Eksempler inkluderer enkeltgenstudier som involverer kjemisk karsinogenese30,stråling28,31,32, genetisk manipulering av vert / donor genom18,og hormonell manipulasjon12. En stor fordel med enzymatisk dissosiasjon beskrevet i denne protokollen er muligheten til å isolere epitelorganoider eller monodiserte celler for komplementære eksperimenter som involverer flytcytometri, 3D-kultur, genredigering og mer. Fremtidige anvendelser av denne teknikken vil omfatte ytterligere manipulering av donor og / eller vertsvev med genteknologi. Donorceller kan for eksempel endres genetisk ex vivo ved en valgt genomisk locus ved hjelp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. På samme måte kan mottakerrotter også endres genetisk for å studere samspillet mellom donor- og mottakerkonstruerte genetiske faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr ble plassert og vedlikeholdt i et AAALAC-godkjent anlegg, og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble godkjent av MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dyr for bruk i gjensidig transplantasjon bør være en innavlet eller isogen belastning, med congenic status foretrukket eller backcrossed i minst 6 generasjoner.

1. Høsting donor rotte brystkjertel epitel

  1. Bestem antall donorrotter som trengs for transplantasjon.
    MERK: Vanligvis kan 1 donorrotte (4 ukers alder) gi nok celler til transplantasjon til 4 mottakerdyr. Visse anvendelser av denne protokollen vil kreve ytterligere antall celler, og det kan være belastningsspesifikke forskjeller i total avkastning.
  2. Merk alle rekvisita og sørg for tilgjengelig plassering for kirurgen (tabell 1).
  3. Registrer kroppsvekten til hver kvinnelige donorrotte. Følg institusjonelle retningslinjer for å bedøve eller euthanize donor rotten fullt ut. Se etter dybden av anestesi ved mangel på respons på tåklemmen.
  4. Flytt dyret til det sterile kirurgiske feltet. Plasser dyret på ryggen og spray hele ventraloverflaten med 70% etanol.
  5. Lag et sagittal, X-formet snitt, slik at tilgang til thorax, abdominal og inguinal brystkjertler. Dissekere alt brystkjertelvevet fra donorrotten ved hjelp av saks (Figur 1). Fjern alle synlige lymfeknuter.
  6. Trekk ut brystvevet ved hjelp av tang og legg i en merket 60 mm tallerken på is. Tilsett 500 μL serumfri DMEM/F12-mediet til 60 mm parabolen. Juster plasseringen av brystkjertelvevet slik at det forblir helt vått.
  7. Finhakk brystvevet ved hjelp av saks. For å gjøre dette, kutt vevet i stykker 1-2 mm3 i størrelse (Figur 1C). Hold kjertelen på is til alt donorvevet er høstet (ikke overstige 60 min).
    MERK: Ekstra personell kan hakke brystkjertler og i tillegg forberede kollagenslikerløsning mens kirurgen fortsetter med vevsekstraksjoner.

2. Trekk ut hjernevev fra eutaniserte donorer

  1. Snu forsiktig donordyrets kropp for å plassere det i utsatt stilling. Fest med pinner. Spray hodet og øvre rygg med 70% etanol.
  2. Finn bunnen av skallen og gjør et snitt under occipital condyles. Sett skarp saks under huden og kutt huden bort fra skallen, inkludert sidene av hodet.
  3. Bruk beinkuttere eller sterk saks til å kutte skallen langs midtlinjen, fra occipital til frontal bein. Hold bladet så overfladisk som mulig og vinkel oppover for å forhindre ødeleggelse av det underliggende hjernevevet.
  4. Skrell beinet bort ved hjelp av rongeurs eller sterke tang. Sett verktøyet sideveis til lillehjernen for å bryte beinet på hver side, og eksponer den benete hørselskanalen. Sever forbindelsene til meningene.
  5. Løft hjernen forsiktig med buede, fine-tip pinsett. Plasser hjernen på et stykke folie og registrer vekten, og overfør deretter umiddelbart til et 15 ml rør med like mye (w:v) media, lagret på is.
    1. Eventuelt, bruk fine-tip tang for å fjerne hypofysen (plassert under hjernen) for ytterligere bruk i transplantasjonsprosedyren, om nødvendig.
  6. Bruk en mekanisk homogenisator for å forstyrre vevet. Homogeniser hjernen for 10-15 s på lav hastighet. La blandingen sitte på is i minst 1 min, og deretter homogenisere igjen. Homogenisering er tilstrekkelig når den endelige blandingen er fri for store biter.
  7. Filtrer homogenatet ved å sende den gjennom et filter på 100 μm. Oppbevar filtratet på is til bruk (mindre enn 4 timer).

3. Fordøyelse og behandling av brystkjertelekstrakter

  1. Tin eller varme reagenser som angitt (Tabell 1). Følg de riktige trinnene for å gjenopprette organoider eller monodisperserte celler.
  2. Forbered 10 ml serumfrie fordøyelsesmedier (uten kollagenase) for hvert donordyr (Tilleggsfil 1).
    MERK: Volumet av fordøyelsesmedienn som brukes kan justeres (skaleres opp eller ned) for å imøtekomme det grupperte vevet, hvis det er aktuelt.
    1. For organoider hopper til 3,3.
    2. For monodisperserte celler, lag fersk monodispersjon blanding og inaktivering løsning (supplemental fil 2, tilleggsfil 3)i tillegg til serum-fri kollagennase fordøyelsesmedia. Fortsett til trinn 3.3.
  3. Når alt brystvevet fra donorer er ekstrahert og hakket, legg kollagenenzymet til de varme (eller romtemperatur) fordøyelsesmediene (Tilleggsfil 1). Bland ved å invertere.
  4. Pass kollagenkolene fordøyelsesmediet gjennom et 20 μm filter. Dispenser 10 ml filtrerte medier i de merkede 50 ml rørene for fordøyelsen.
  5. Bruk en ny 1000 μL pipettespiss for hver prøve og overfør hakket donorvev fra hver 60 mm tallerken til kollagennase fordøyelsesrøret. Klipp 1 cm av enden av en 1000 μL-spiss og plasser den manuelt på enheten før bruk. Bland forsiktig hakket vev ved pipettering opp og ned 1-2 ganger.
    MERK: Hvis vevet er vanskelig å pipette under overføring, bruk en liten mengde kollagennase fordøyelsesmedier fra 50 ml rør, og deretter overføre den tilbake.
  6. Plasser prøvene i horisontal stilling i en ristende inkubator og la prøvene fordøye 1,5-2 t ved 37 °C, 200-220 rpm.
    1. For organoider hopper til 3,7.
    2. For monodispergerte celler tilsett DNase I (0,2 μg/ml) til blandingen de siste 10 min av fordøyelsen. Inkuber som før, med kraftig risting. Fortsett til trinn 3.7.
  7. Når vevet er fullstendig fordøyd, pellet suspensjonen ved hjelp av kald sentrifugering (4 ° C) i 10 min ved 1200 x g (Figur 1D).
    MERK: Hold rørene på is mellom hvert trinn for å øke levedyktigheten til celler.
  8. Sørg for at en pellet har dannet seg, og hell deretter forsiktig av det supernatant og fettlaget. Forsiktig resuspendere pellet i 10 ml friske DMEM/F12-medier.
  9. Spinn kort på 68 x g i ca. 10 s. Lengden på spinnet (men ikke hastigheten) kan økes hvis det ikke er noen klar separasjon av celler. Inspiser pelleten visuelt før du fortsetter (Figur 1D).
  10. Fjern forsiktig supernatanten, og etterlater seg et lite volum. Fortsett til neste trinn, basert på om organoider eller monodisperserte celler er nødvendig.
    MERK Det er viktig å la et lite volum av medier i røret fordi pelleten vil være veldig løs. Det gjenværende volumet av media vil bli fortynnet gjennom vasketrinn.
    1. For organoider, legg til ytterligere 10 ml volum av DMEM / F12 media og gjenta vask / spinn. Etter den andre vasken, resuspendercellene i et mindre volum (1-2 ml) av DMEM / F12 media for filtrering. Fortsett til trinn 3.11.
    2. For monodisperte celler oppløses i 2 ml pre-oppvarmet HBSS med 0,025 % (w/v) Trypsin og 6,8 mM EDTA. Fordøye i 3-5 min ved 37 °C. Inaktiver umiddelbart.
      1. Tilsett 4 ml DMEM/F12 med 10 % FBS for å stoppe aktiveringen av trypsinen.
      2. Spinn cellene ved 270 x g i 5 min, og deretter resuspender i DMEM / F12 med 10% FBS igjen. Fortsett til trinn 3.11 for å filtrere cellene.
  11. Filtrer cellene ved hjelp av en 40 μm cellesil plassert i et nytt 50 ml rør. Forhåndsfukt silen ved å pipettere 1 ml samme bunnmedium som brukes til å suspendere cellene, og deretter passere cellesuspensjonen gjennom filteret ved hjelp av en pipette for å samle kanalfragmenter /organoider.
    MERK: Det omtrentlige utbyttet av filtrert epitel fra brystkjertelvevet til en enkelt, 4 uker gammel donorrotte er 1 x 106 celler.
    1. For organoider, kast filtrate. Mammary organoider vil forbli inne i kurven på cellesilen og mindre, uønskede celler vil bli eliminert. Snu cellesilen over et nytt 50 ml rør, og skyll med ethvert volum som er nødvendig for å samle cellene. Fortsett til trinn 3.12.
    2. For monodispergerte celler, kast cellesilen og hold filtrate fordi pattedyrepitelcellene vil passere gjennom filteret, sammen med mindre stromal og immunceller. Skyll røret som ble brukt til fordøyelsen/sentrifugering med et annet volum av DMEM/F12 med 10 % FBS og pass gjennom samme cellesil. Pellet de monodisperte cellene ved sentrifugering på 1200 x g i 5 min. Fortsett til trinn 3,12.
      MERK: De resuspenderte cellene er klare for etterfølgende programmer.
  12. Pulse spinner løsningen og sikrer dannelsen av en cellepellet før du fortsetter til neste trinn. Pulsspinn igjen, om nødvendig.
  13. Fjern forsiktig supernatanten. Resuspender pelleten i et lite volum (1000-2000 μL DMEM/F12) for å konsentrere cellene for telling.
  14. Telle celler og fortynne om nødvendig. Resuspender ønsket antall celler for transplantasjon i 20 μL DMEM/F12-medier for hvert dyr. Hold alltid celler på is.
    MERK: Donorcelleteller i området 1 x 105 - 1 x 106 celler vil være nødvendig for hvert graft-område basert på slutten av studien. For eksempel krever karsinogeneseeksperimenter ofte et større antall transplanterte celler, i forhold til andre applikasjoner. Antall celler som trengs må være eksperimentelt bestemt for hver belastning. Prosedyren som er beskrevet i denne protokollen, brukte 250 000 donorceller i 20 μL-medier per graft-sted, før blanding med hjernehomogenat, som beskrevet i trinn 3.16.
  15. Forbered eventuelle aliquot(s) av celler som trengs for andre eksperimenter (f.eks FACS isolasjon3,26,27,30,33).
    1. For organoider, fortsett til trinn 3.16.
    2. For monodispergerte celler, kvantifiser de levedyktige cellene ved hjelp av Trypan eller metylenblå farging, og fortsett deretter.
  16. Forbered enkeltgrupper av donormateriale for alle transplantasjonsmottakerne. Kombiner like volumer av cellesuspensjonen (20 μL) med 50 % hjernehomogenat (20 μL) for hvert anlegg for transplantasjon.
    MERK: Totalt 40 μL per sted vil bli injisert på hvert sted, men det anbefales å inkludere minst 25% ekstra volum for avfall.
  17. Fortsett umiddelbart til transplantasjon eller fryse celler for transplantasjon senere (potensielt stoppested).
    MERK: Frosne celler har ikke blitt testet med denne protokollen og vil kreve optimalisering i forkant av å generere en kohort av dyr for transplantasjonseksperimenter. Det anbefales sterkt å transplantere friske celler.

4. Transplantasjonprosedyre (mottakerrotter 4-5 uker gamle)

  1. Vei hver mottaker rotte og beregne riktig dose av godkjent smertestillende som skal brukes i prosedyren.
    MERK: Kroppsvekt kan måles opptil 24 timer i forkant av prosedyren. Følg institusjonelle retningslinjer for å begrense eller kort bedøve hvert dyr i løpet av barberingen.
  2. Barber det kirurgiske området på hvert dyr ved hjelp av elektriske klippere. Identifiser bunnen av skallen og start av vertebral kolonnen. Omtrent en tredjedel av veien ned ryggraden, barber en 3 cm x 2 cm område på den øvre thoraxdelen av ryggen.
    MERK: Barbering kan også utføres under anestesi på transplantasjonsdagen, men må utføres utenfor det sterile feltet. Returner rotten til sitt hjem bur til det er nødvendig.
  3. Finn alle forsyningene som trengs for transplantasjon (tabell 1).
  4. Evaluer laboratorietanimalanestesisystemet før bruk. Topp av væske og skift ut eventuelle tanker eller deler som trengs. Sørg for at gassledningen til anestesikammeret er åpent og alle perifere linjer er lukket, slik at isoflurananestesi og oksygen kan fritt strømme til dyret når det er plassert i kammeret.
  5. Varm varmeputer for å støtte kroppstemperaturen til mottakerdyr.
  6. Generer det sterile feltet som skal brukes til kirurgi. Ordne rekvisitasomet som beskrevet i tabell 1.
  7. Administrer preoperativanalgetika til mottakerrotter som indikert av institusjonelt godkjent dyrepleieprotokoll.
  8. Skyll Hamilton sprøyter med sterile DMEM / F12 media for å hindre tap av celler. Sørg for at nålen er festet til sprøytens kropp, sett nålen inn i væsken og trekk tilbake stempelet. Fyll til det maksimale volumet. Trykk stempelet ned og utvise innholdet i et avfallsinnsamlingsrør. Gjenta 3-5 ganger.
  9. Legg hele volumet av donormateriale (utarbeidet i trinn 3.16) i en egen sprøyte for hver tilstand (f.eks. kontroll, behandlet, villtype, knockout osv.). Sett nålens spiss inn i væsken, trekk stempelet tilbake og hold nålen under overflaten av blandingen etter hvert som volumet i røret minker.
    MERK: Ta med minst 10 % ekstra volum i hver sprøyte. Ikke kast den gjenværende blandingen lukk røret og hold den på is i tilfelle det er behov for mer.
  10. Snu sprøyten etter at den er fulllastet og trykk stempelet litt for å fjerne luftbobler på spissen av nålen. Fortsett til neste trinn når alt er forberedt.
    MERK: Pass på at tuppen på nålen aldri berører noen annen overflate, selv innenfor det sterile feltet. Det er nyttig å hvile sprøytens kropp over en liten beholder med is for å fremme levedyktighet en cellene.
  11. Plasser mottakerdyret i anestesikammeret og slå på maskinen.
  12. Når dyret er helt avslappet (reagerer ikke på tapping eller mild bevegelse av kammeret), rett anestesi til nesekjeglen og overfør dyret til det sterile feltet.
    MERK: Forlenget varighet av anestesi tolereres ikke godt av rotter. Fullfør prosedyren for hvert dyr i 10 min eller mindre.
  13. Plasser dyret i en utsatt stilling (på magen) slik at baksiden av hodet og den øvre ryggraden er tilgjengelig.
    MERK: Sørg for tilstrekkelig varmestøtte for dyret hele tiden og vurder regelmessig dybden av anestesi ved hjelp av en fast tåklype.
  14. Eventuelt, bruk oftalmisk veterinær salve for å forhindre tørking av øynene.
  15. Rengjør det nybarberte området for å fjerne overflødig hår. Bruk en sirkulær bevegelse og påfør 70% etanol (eller en annen reagens, per institusjonelle retningslinjer) til huden, etterfulgt av et antiseptisk (for eksempel jod), og gjenta. Plasser et håndkle drapere over dyret slik at bare regionen for barbert område er utsatt.
  16. Sørg for at dyret ikke reagerer på dype stimuli med en fast tåklype, og fortsett deretter til neste trinn.
  17. Lag et lite (2 cm) interscapularsnitt ved hjelp av et skarpt kirurgisk blad.
    MERK: Kuttet må være overfladisk, da fettputen ligger like under huden.
  18. Finn det mediale blodkaret for orientering (figur 2B).
  19. Løft huden på den ene siden av snittet ved hjelp av tang og hold den borte fra fettputen mens transplantasjonen utføres (figur 2B). Sett nålen inn i graft-stedet.
    1. Eventuelt, flytte spissen av nålen inne i vevet og lage en liten lomme for å samle cellene. Bruk en liten, repeterende bevegelse. Ikke fjern nålen.
      MERK: Dette trinnet anbefales for førstegangsbrukere av protokollen. Vær svært forsiktig når du oppretter en lomme, da interscapular fettputevev er svært delikat.
  20. Injiser forsiktig 40 μL av celleblandingen i interscapular fettputevevet. Fjern nålen langsomt.
  21. Hold vevet på plass og la de transplanterte cellene bosette seg for 3-5 s. Bruk et ekstra par tang, om nødvendig.
  22. Fjern nålen. Gjenta injeksjonsprosedyren (trinn 4.18-4.21) på det andre transplantasjonsstedet.
    MERK: Epitelet fra en donorgruppe kan injiseres i samme side av fettputen i hvert dyr, eller vekslende sider for å forhindre batcheffekter fra kirurgens hånddominans.
  23. Lukk det kirurgiske såret ved hjelp av sårklips eller suturer, og avslutt deretter anestesi.
  24. Gi postoperativ analgetika som angitt av institusjonelt godkjent protokoll.
  25. Flytt umiddelbart dyret til et gjenopprettingsbur med varmestøtten. Overvåk for tegn på nød som blødning fra snittet eller problemer med å puste.
    MERK: Dyret skal komme seg fullt ut innen 5-10 min. Se institusjonelle retningslinjer for retur av dyr til kolonien og postoperativ overvåking etter overlevelsesprosedyrer.
  26. Du kan eventuelt utføre karsinogenesestudier på graftstedet(e) ved å administrere kreftfremkallende til mottakerrotter 3-4 uker etter transplantasjon.
    MERK: Vanligvis utføres rottemammakarsinogenese ved hjelp av en kjemisk kreftfremkallende behandling ved 50-57 dager. Denne behandlingen dikterer alderen på transplantasjonsoperasjonen (som må gjøres mellom 29-36 dager) for å gi nok tid til at de transplanterte cellene kan initiere veksten av brystkjertelen.

5. Vurdering av epitelutvekst

  1. Overvåk estrus syklusen av rotter gjennom daglig vaginal lavage og undersøke cytologi på et mikroskop lysbilde. Begynn 8-12 dager før slutten av studien. Ofre alle rotter i samme stadium. Dette er et valgfritt trinn.
    MERK: Rotteesyklusen er 4-5 dager. Å tillate dyret å gå gjennom 1-2 fulle sykluser vil lette tolkning, som lavage lysbilder fra tidligere sykluser kan brukes til sammenligning.
  2. Offer transplantasjon mottaker rotter 6-8 uker etter transplantasjon, i henhold til institusjonelle retningslinjer.
    MERK: Utvekst er vanligvis påviselig 3-6 uker etter transplantasjon, men ekstra tid kan være nødvendig.
  3. Plasser dyret i en utsatt stilling og rengjør kroppen med 70% etanol. Løft huden med tang og lag et snitt langs vertebralkolonnen for å eksponere interscapular fettputen. Dissekerhuden bort fra vevet slik at flertallet av fettputen er synlig.
  4. Identifiser den mediale blodkaret som skiller graft-stedene i interscapular fettpute. Avgiftsy hele puten som et enkelt stykke vev eller kutt langs blodkaret og fjern sider individuelt.
  5. Plasser vevet på et positivt ladet mikroskoplysbilde for hele fjellet. Bruk 2 par stumpe tang og spre vevet forsiktig for å gjenopprette sin opprinnelige konformasjon på lysbildet.
    MERK: Rottepattedyrvev er ekstremt delikat. Kantene av vevet kan krølle seg under seg selv. Håndter alltid forsiktig og hold på plass til vevet fester seg til lysbildet (noen sekunder).
  6. Hele montereminst en av endogene abdominal-inguinal brystkjertler (med lymfeknuter for orientering) til sammenligning.
  7. Plasser lysbildene i 70% etanol i 7-10 dager for å defat vevet. Fyll etanol så ofte som nødvendig for å sikre at vevet ikke tørker ut.
  8. Forbered alum-karminflekken og behandle lysbildene når vevet er tilstrekkelig ugjennomsiktig. La flekken avkjøles før bruk (Tilleggsfil 4).
    MERK: Flekken kan tilberedes opptil en dag i forkant av fikserings- og rehydreringstrinnene. Løsningen kan lagres ved 4 °C og har begrenset potensial for gjenbruk.
  9. Fest vevet ved å plassere lysbildene i 25% glacial eddiksyre: 75% etanol i 60 min.
    1. Rehydrerveve gjennom en serie på 3 vasker i en rekke synkende konsentrasjon av etanol: 70% etanol i 15 min, 50% etanol i 5 min og dH2O i 5 min.
  10. Flekk med alumkarmin i 4-8 dager. Kontroller baksiden av lysbildene hver dag for å finne ut om flekken har fullstendig penetrert vevet. Fortsett til neste trinn når farging er fullført.
    MERK: Farging er fullført når de tykkeste delene av kjertelen har en lilla nyanse og ikke lenger vises hvit.
  11. Deflekk og dehydrere vevet ved å overføre lysbildene gjennom en rekke økende konsentrasjon av etanol: 70% etanol i 30 min, 95% etanol i 30 min og 100% etanol i 30 min.
  12. Plasser dehydrerte lysbilder i xylen i 3 + dager for å fjerne vevet. Overføring til mineralolje for langtidslagring.
  13. Når lysbildene er fjernet, kan du bruke mikroskopi med lavt strømforbruk eller høyoppløselig digital fotografering for å skaffe bilder av lysbildene for analyse. Kontroller at parametere for bildeinnhenting er konsekvente for alle lysbilder.
    MERK: Epitelutvekst må være tydelig utstående.
  14. Behandle tilstedeværelsen av utvekst som et binært utfall.
  15. Beregn gjennomsnittlig antall transplanterte epitelceller som produserte ≥ 1 brystutvekst i 50% av graft-nettstedene ved hjelp av de oppkjøpte bildene. Kvantifisering andre fysiske funksjoner, etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Donor og mottaker brystkjertler
Trinnene for å isolere og forberede rottepattedyrepitelceller for transplantasjon er vist i figur 1A. Ved 4 ukers alder har den endogene brystkjertelen til donorrotten begynt modning og epitel kan visualiseres på hele monterte lysbilder farget med alumkarmin (Figur 1B). En donorrotte i denne alderen vil gi ca 1 x 106 celler for transplantasjon. Hvis mengden donorvev som samles inn eller påfølgende hakking er utilstrekkelig, kan utbyttet av celler etter kollagennasfordøyelse være lav. Som sådan er det viktig å samle så mye brystkjertelvev som mulig fra donorene. Fullt fordøyd brystkjertelvev bør ha et fet utseende, uten synlige biter av vev i suspensjonen (Figur 1C). Fullstendig fordøyelse av brystkjertelvevet fra en enkelt donor bør resultere i dannelsen av en synlig pellet som inneholder brystorganoider, som vist i (Figur 1D). Hvis en pellet ikke er synlig, kan analysen kreve optimalisering. I figur 2vises rottebrystkjertel og interscapular fettputesteder. Resultatene kan ikke tolkes med mindre biologiske referansepunkter er riktig identifisert på tidspunktet for vevsinnsamling (figur 2A) og transplantasjon (figur 2B). I denne analysen brukes den mediale blodkaret til interscapular hvit fettpute som et biologisk referansepunkt.

Kvalitativ og kvantitativ vurdering av epitelutvekst
Tilstedeværelsen, fraværet eller overflod av epitel kan evalueres for å bestemme suksessen til eksperimentet, samt autonomi av effekter knyttet til eksperimentelle variabler. For sistnevnte kan visse studier kreve hele monterte lysbilder med endogene abdominal-inguinal brystkjertel av verten for sammenligning. Som et foreløpig mål kan lysmikroskopi brukes til å dokumentere den epitelmessige utveksten som et binært utfall. Disse dataene kan analyseres statistisk for å teste hypotesen om at avvisning av transplantat er avhengig av donor- eller mottakervariabler. Et gjensidig transplantasjonseksperiment der hver av disse faktorene har 2 nivåer- for eksempel wildtype (WT) vs knockout (KO), vil skape 4 transplantasjonsgrupper for hypotesetesting (Figur 3A). Transplantasjonsgruppene, uttrykt som donor:mottaker genotype, er: WT:WT, WT:KO, KO:KO, KO:WT. Når isogene eller nær-congene dyr brukes, er graft avvisning mindre og forekommer like på tvers av transplantasjonsgruppene. En fordel med flere steder for transplantasjon i interscapular fett pad er en reduksjon av mottaker dyr som trengs, siden 2 donor celletyper kan evalueres i en enkelt vert. I tillegg kan begge nettstedene brukes til å teste en enkelt donorcelletype med høyere forekomst, ved hjelp av samme antall rotter. Ved hjelp av genotype som et eksempel, er dette demonstrert i figur 3B.

Den epitelen utvekst kan også analyseres ved hjelp av bilder av lysbildene som tidligere ble kjøpt. Et eksempel på en helmontert interscapular fettpute som inneholder epitelutvekst på begge graft-stedene (registrert som positive resultater) er vist for et eksperiment ved hjelp av brystcelletransplantasjonsprotokollen beskrevet her (Figur 3C). Mangel på epitel i interscapular fett pute over mange prøver kan indikere et teknisk problem med prosedyren og behandles som et negativt resultat.

Utfallet av gjensidige transplantasjonseksperimenter kan videre brukes til å skille effekter som er autonome eller ikke-autonome til mammary epitelceller. For å teste hypotesen om at en effekt er drevet av prosesser i mammary epitelceller (celle-autonome) eller påvirket av verten / mikromiljøet (ikke-autonom), konkordans av donorcelle fenotype til verten (endogene) fenotype behandles som et ditoløs utfall. I et eksempel som en karsinogeneseanalyse kan tumorforekomst analyseres som binære responsdata, og logistisk regresjonsanalyse som brukes til å avgjøre om donor,vert eller donor-vert interaksjon bidrar betydelig til tumorforekomsten på transplantasjonsstedet. Hvis effekten drives av egenskapene til donorepitelet, kan et lignende transplantasjonsresultat observeres på tvers av mottakergrupper, uavhengig av vertens tilstand. Hvis donorepitelet utvikler seg som om det var endogen tvert imot verten, på grunn av et bidrag fra vertens genotype eller behandling, kan effekten være ikke-autonom. I begge situasjoner bør transplantasjonsgruppene der donorepitelceller matchet verten (selvselv) tolkes som kontroller, og konklusjoner støttet av statistiske analyser.

For å demonstrere resultatene av autonome og ikke-autonome effekter på transplantert epitel, har det blitt gitt en illustrasjon (figur 4A), sammen med lysbilder fra gjensidig transplantasjon av vill type og Cdkn1b knockout rottebrystepiteleksperimenter. Resultatene av denne studien antydet ikke-pattedyr celle-autonome effekter18 (Figur 4B). For gjensidige transplantasjonsutfall klassifisert som en binær respons, kan sannsynligheten for utfallet (f.eks. konkordans av fenotype for å være vert for epitel, eller vellykket utvekst i kvantitative analyser) avhengig av kategoriske variabler (f.eks. donor eller mottakergenotype) ved å bygge en logistisk regresjonsmodell for hovedeffekter og samhandlingsvilkår.

Figure 1
Figur 1: Forberedelse av donorbrystkjertler. (A) Oversikt over prosedyren for å trekke ut brystkjertelvev fra donordyr og gjenopprette organoider for transplantasjon. (B) Helmontert endogene abdominal-inguinal brystkjertler av en 4-ukers gammel rotte (typisk alder av transplantasjon donorer), etter alum karmin flekker. Ved 4 ukers alder var brystepitelet i ferd med å ekspandere, men kanaltreet trenger ikke helt inn i fettputen, noe som gjenspeiles av nærhet til de sentrale lymfeknutene. (C) Konsistensen av hakket brystkjertelen er vist etter hakking (rosa) i en 60 mm tallerken på is, med en passende mengde DMEM / F12 media for å holde den fuktig. De tilstøtende bildene gir en sammenligning av hakket epitel etter overføring av slurry til Kollagennase Fordøyelsemedia og når fordøyelsen er fullført, 90-120 minutter senere. (D) Pelleted epitelorganoider og lagseparasjon er synlige etter sentrifugering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Identifisering av grenser for vevsinnsamling og brystepitelcelleinjeksjon. (A) Steder av rottebrystkjertler for vevsamling vises. Den omtrentlige plasseringen av endogene abdominal-inguinal brystkjertler høstet fra givere og mottakere er skissert. (B) Etter barbering og å lage et overfladisk snitt, blir den hvite interscapular fettputen til en transplantasjonsmottaker utsatt. Toppbilde: det mediale blodkaret (gul pil) er synlig i midten av snittet. Bunnbilde: huden på den ene siden av snittet løftes for å vise bredden på IS-fettputen under huden, i forhold til det mediale blodkaret (gul pil). Donor epitel injiseres under denne klaffen i fettputen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Gjensidig transplantasjonskjema. (A) Typisk eksperimentell design for gjensidig transplantasjon vises, ved hjelp av genotyper som et eksempel. Testing av en enkelt eksperimentell variabel, for eksempel genknockout (KO) i forhold til donorepitelet (WildType) (WT), skaper 4 transplantasjonsmottakergrupper. (B) Eksempel design for en enkelt mottaker dyr mottar 2 injeksjoner av donor materiale. Flere steder for pode er tilgjengelige når du bruker interscapular hvit fett pute på grunn av tilstedeværelsen av et blodkar langs midtlinjen. Separate preparater av vill type og knockout donor epitel (eller andre testforhold) kan injiseres til venstre og høyre for blodkaret. (C) Representativt hele montert IS fett pute vev fra en transplantasjon mottaker vises i samme retning som i eksemplet presentert i (B). Mammary epitelutvekst er synlig på to steder av transplantasjon på en helmontert lysbilde med alum-karmin farget vev. Interscapular fett pad ble skåret som en enkelt stykke 6 uker etter transplantasjon. Ekstra tid for epitelutvikling kan være nødvendig, men kan også legge til rette for overvekst og vanskeligheter med å skille individuelle donortransplantater. Vanlige biologiske gjenstander kan være synlige: MS = muskel, TP = transplantert epitel, BF = brunt fettfettvev. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Mammary celle autonome og ikke-autonome resultater analyse. (A) Simulering av resultater som kan observeres når det er betydelige bidrag fra autonome og ikke-autonome effekter på fenotypen av donorepitel. I dette eksemplet brukes endogene abdominal-inguinal kjertler fra verten som en sammenligning. Concordance av fenotypen av donor epitelutvekst, sammenlignet med endogene kjertel, kan brukes som referanse, men bør ikke brukes til utelukkende å bestemme effekter. (B) Donor brystepitel utvekst er vist på stedet for transplantasjon, ved siden av bilder av endogene kjertel for alle 4 grupper i et gjensidig transplantasjoneksperiment. Ikke-autonome effekter på brystepitel observert etter knockout av et enkelt gen, Cdkn1b, noe som tyder på at vertens mikromiljø påvirker den utviklende rottebrystkjertelen18. Skalabarer representerer 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Trinn nødvendig Gjenstander på is Tint/pre-oppvarmet Elementer i nærheten av kirurg
1. Utarbeidelse av brystkjertelepitel 60 mm parabolen Sterile kirurgiske verktøy
Aliquot av DMEM/F12 70% etanol
2. Donor hjerneutvinning Aliquot av medier i 15 eller 50 ml rør (ca. 1-2 ml/donor) Balanse for veiing av hjernen, innenfor sterilt felt
Merket 15 ml rør for hver donor, egnet for homogenisering Folie
Pipett og spisser (1000 μL eller elektronisk med 5 ml serologiske pipetter)
Mekanisk homogenisator
3. Enzymatisk fordøyelse av donorkjertler Tilstrekkelig DMEM/F12 for vasker Serumfrie fordøyelsesmedier Laboratorieskala (g)
DNAse I Monodispersjonblanding Inkubator/shaker
Løsning for inaktivering 50 ml rør (merket) for hver donor
10 ml (eller større) sprøyte for steril-filtrering kollagenase fordøyelsesmedier
20-40 μM filtre
Aliquot av media til pre-våte filter (er)
50 ml rør(er) for innsamling av filtrert enzymoppløsning
Steril saks for å kutte engangsrørtips
Stort beger for å samle supernatant, eller vakuumlinje for aspirating
4. Transplantasjon Donor epitel + hjerne homogenisere blanding Hamilton sprøyter – 1 per donor genotype/tilstand
Aliquot av DMEM/F12 til prime sprøyter Skala
Sterile kirurgiske forsyninger (skalpell/saks, flere tang)
Sårklips/suturer
Gasbind
70 % etanol eller isopropanol
Beta-spis eller jod
Smertestillende
Varmestøtte for mottakerdyr
Papirhåndklær eller delikate oppgaveservietter

Tabell 1: Elementer som krever forhåndsvurdering i hvert trinn. Denne listen er utformet for å brukes som referanse når du forbereder et eksperiment og bør ikke betraktes som uttømmende. Reagenser kan bare være nødvendig for spesifikke anvendelser av protokollen, basert på inkludering/ utelukkelse av valgfrie trinn. I et hvilket som helst eksperiment må disse elementene være tilgjengelige uten forsinkelse når prosedyren er startet.

Tilleggsfil 1: Serumfri kollagensfordøyelse Media Forberedelse. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggsfil 2: Monodispersjon blanding forberedelse. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggsfil 3: Forberedelse til inaktiveringsløsning. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggsfil 4: Alum-Carmine Stain Forberedelse. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en epitelcelletransplantasjonsteknikk optimalisert for arbeid med rotter. Isolert pattedyr epitelial organoider fra donorrotter (3-5 uker) er podet inn i interscapular hvit fett pad av mottaker rotter (også 3-5 uker av alder). Resultatene kan tolkes så lite som 4-6 uker senere, ved hjelp av lysmikroskopi for å undersøke det transplanterte vevet; Men den optimale tiden mellom transplantasjon og offer må bestemmes før du implementerer et fullt eksperiment. Hvis det er for lite eller for mye tid som har gått, vil resultatene verken være tolkelige eller meningsfulle. For å optimalisere protokollen, analysere utveksten i et lite sett med dyr 6-8 uker etter transplantasjon. Hvis det transplanterte epitelet er tilstede, men underutviklet, øker tiden. Hvis grafts er godt utviklet, men overlappende trekk ved epitelet forstyrre analysene, vurdere å redusere antall uker for epitel utvekst. Hvis tiden ikke kan forkortes (f.eks. i bisinogeneseeksperimenter), anbefales det å injisere samme type donorepitel i begge transplantasjonsstedene (en på hver side av mediale blodkar), da resultatene ikke kan tolkes fra individuelle sider med 100% sikkerhet. Hvis noen form for interaksjon (autokrint, paracrine) mistenkes, anbefales det sterkt å inkludere ekstra kontrolldyr injisert med samme type donorepitel i begge transplantasjonsstedene. Kritiske trinn i prosedyren inkluderer riktig kvantifisering av donorceller etter enzymatisk fordøyelse, og jevn blanding med hjernehomogenat. Ekstra forsiktighet må tas på disse trinnene for å sikre at antall transplanterte celler er konsistent på tvers av mottakerdyr. Også under injeksjon, sørg for at transplantert vevblandingen ikke lekker ut av interscapular fettpute. 3. Utskårer interscapular fettpute ved endepunktet i forsøket. Hele puten kan fjernes som et enkelt stykke, men må tas hvis du velger å skille de 2 sidene av interscapular fettpute, kutte bare etter å ha identifisert medial blodkar. Det kan være vanskelig å bestemme siden som utvekst oppsto, spesielt når en pode har overgrodd inn i den andre, noe som gjør fjerning som et enkelt stykke mer ideell.

En vanlig endring av prosedyren er tillegg av en kreftfremkallende behandling av mottakerenrotte25,29. Det transplanterte vevet kan beholde følsomheten til karsinogenese som var besatt av donorrotten25,eller omvendt kan donorvevet vedta følsomheten til verten30. Disse effektene kan bare bestemmes ved bruk av interscapular fett pute som stedet for transplantasjon, fordi endogene brystkjertler forblir intakt og fungerer som en positiv, intern kontroll.

Ved bruk av brystkjertelorganoider for transplantasjon, fravær av epitelutvekst kan skyldes problemer med donor celle forberedelse eller injeksjon prosedyre. Graft avvisning kan også oppstå når mottakeren og donor stammen ikke er congenic, forårsaker en immunrespons i verten. I slike tilfeller anerkjenner mottakerens immunsystem donorvevet som ikke-selv, initierer en immunrespons, og det transplanterte vevet vokser ikke. For å redusere risikoen for graft svikt når donor og mottaker er på ulike genetiske bakgrunner, minst 6, og ideelt sett, mer enn 10 generasjoner av backcrossing anbefales for å hindre utfordringer som kan påvirke resultattolkning. På 6 backcross generasjoner, de fleste grafts vil vokse ut, men et mindretall kan fortsatt mislykkes. Når du feilsøker donorcelleforberedelse som årsak til graftsvikt, bør du vurdere om den enzymatiske fordøyelsen var for hard, cellene ble holdt på for høy eller for lav temperaturer, forurensningskilder, optimalisering av donorcellenumre som brukes til analysen eller andre protokollavvik som påvirker cellelevedyktighet og utvekst.

Enkelt bryststamceller har blitt vist i musen for å kunne rekonstituere en funksjonell brystkjertel, som illustrerer at tilsetning av hormonell støtte ikke er nødvendig for det primære utfallet. Tillegg av hjernen homogenat forbedrer betydelig utfallet av transplantasjon ved å tjene som en strukturell matrise fordonorcellene og redusere risikoen for migrasjon transplantasjon avvisning3,34,35,36. Kombinert med hjernehomogenat, reduseres det minste antallet brystepitelceller som kreves for transplantasjon, mer enn 10 ganger, sammenlignet med alternativer3. Viktigere, blanding av syngende hjerne homogenat har ikke vist seg å påvirke fenotypen av transplantert epitel, og har produsert konsistente resultater i brystkarsinogenese og mottakelighetstudier i over 40 år.

Noen kan hevde at interscapular fett pad er ikke representativ for endogene mammary fett pad på grunn av anatomiske forskjeller: nærhet av IS fett pad til brun fettvev, potensielle forskjeller i blodkar tetthet resulterer i forskjeller i eksponering for hormoner eller tilstedeværelsen av fremtredende lymfeknuter i inguinal-abdominal fett pad, som kan utsette epitelet til ulike nivåer av cytokiner. Selv om dette ikke har blitt spesifikt testet hos rotter, er begge disse depotene subkutane og utvikler seg før visceral adipose37,38; i menneskelig fett, større molekylære forskjeller finnes på tvers av fettområder, og heterogeniteten i grupper er ikke fullt ut forstått38,39. En ekstra faktor å vurdere er at den hvite interscapular og pattedyr fett pads dele Myf5+ mesenchymal forløper avstamning, men varierer i antall celler avledet fra at befolkningen40. Til tross for at det er tilstrekkelig bevis for at den hvite interscapular fettputen gir et mikromiljø som ligner på den nedre brystkjertelen. Mammary epitel kombinert med sin egen mesenchyme utvikler en typisk mammary mønster20, en effekt som er godt dokumentert i gnagerstudier og støtter observasjoner i menneskelig fettvev19,20,24,41,42. Fremfor alt er de primære determinantene for mammary epiteltransplantasjon suksess i både rotter og mus størrelsen og integriteten til fett pute43,44. Ved bruk av denne teknikken, mange brystkreft mottakelighet studier har bevist at funksjonelle brystvev kan effektivt og rutinemessig genereres når transplantert inn i den hvite interscapular fett pad18,30,45.

På grunn av den høye kompatibiliteten er den epitelbaserte utveksten mottagelig for mammary celle-autonome og ikke-autonome faktorer og vil reagere på hormonell manipulering av mottakerrotter, for eksempel for å fremme differensiering eller funksjonell sekresjon av melk. Transplantasjon av organoider brukes ofte til å studere faktorer som påvirker utviklingen av brystkjertelen og/eller karsinogenese. Organoider kan videre fordøyes til enkeltcellesuspensjoner for å lette kvantitativ tolkning av resultatene. Mens metoden beskrevet i dette papiret kan tilpasses til pode intakte deler av brystkjertelvev (som vanlig utføres hos mus), tillater de enzymatiske dissosiasjonstrinnene mer detaljerte konklusjoner å bli gjort. Siden preclearing endogene mammary fett pad i rotten er ikke mulig, dette er for tiden den eneste metoden som tillater pode av rotte pattedyr epitel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilotforskningsfinansiering fra National Institutes of Health (https://www.nih.gov/),og midler fra Department of Pathology & Laboratory Medicine ved Medical University of South Carolina. Vi vil takke Marijne Smiths for å ha spilt inn intervjuuttalelsene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µM syringe filters Fisher Scientific 09-715G sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 05-408-129 containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers Corning 431752 filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles Hamilton 81001 & 90525 For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette - - transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube Falcon (Corning) 352196 brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers Corning 431750 filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes Fisher Scientific 05-539-6 for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes Thermo Scientific 130181 for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate Sigma-Aldrich 243361/237086 staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use - - follow institutional protocol
Beta-dine or iodine - -
Borosilicate glass culture tube for homogenization Fisher Scientific 14-961-26 for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine Sigma-Aldrich C6152/1022 staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus - -
Clean animal cages for recovery - - follow institutional protocol
Collagenase Type 3 Worthington Biochemical Corp. LS004183 enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water - - for chemical solutions
DMEM/F12 GIBCO 11320033 for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA - - monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2705/2701 mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone - inactivation solution
Gauze - -
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-212 use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS GIBCO - monodispersion mixture
Heating pads - - follow institutional protocol
Ice buckets (x2) - -
Incubator with orbital rotation - - must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia - - follow institutional protocol
Light microscope or digital camera - - visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer Fisher Scientific - TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure Sigma-Aldrich/ ACROS Organics 8042-47-5 long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer - - follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes - -
Positively-charged microscope slides Thermo Scientific P4981-001 mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic - - Institutional protocol
Scale body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver - - electric clippers, or other
Staining jars - - minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes IMCO 4410-IMC used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) - - autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater) - - for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin Worthington monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) - -
Wound clip applier, clips, and removal tool Fine Science Tools 12020-00 Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 clearing mammary gland whole mount slides after staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).

Tags

Kreftforskning Utgave 157 rottebrystkjertel epiteltransplantasjon monodispergerte celler kvantifisering brystkjertelutvikling brystkreft karsinom pode
Rotte mammary epitelcelletransplantasjon i Interscapular Hvit Fett Pad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D.,… More

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D., Gould, M. N., Smits, B. M. G. Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad. J. Vis. Exp. (157), e60401, doi:10.3791/60401 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter