Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Summary

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Abstract

Las modificaciones post-traduccionales dependientes de la ubiquitina (ub) y la ubiquitina (ubl) dependientes de las proteínas desempeñan un papel regulador biológico fundamental dentro de la célula mediante el control de la estabilidad de las proteínas, la actividad, las interacciones y la localización intracelular. Permiten a la célula responder a las señales y adaptarse a los cambios en su entorno. Las alteraciones dentro de estos mecanismos pueden conducir a situaciones patológicas graves como enfermedades neurodegenerativas y cánceres. El objetivo de la técnica descrita aquí es establecer perfiles de PTF dependientes de ub/ubls, de forma rápida y precisa, a partir de líneas celulares cultivadas. La comparación de diferentes perfiles obtenidos a partir de diferentes condiciones permite la identificación de alteraciones específicas, como las inducidas por un tratamiento, por ejemplo. La transducción celular mediada por Lentiviral se realiza para crear líneas celulares estables que expresan una versión de dos etiquetas (6His y Flag) del modificador (ubiquitina o ubl como SUMO1 o Nedd8). Estas etiquetas permiten la purificación de la ubiquitina y por lo tanto de proteínas ubiquitinadas de las células. Esto se hace a través de un proceso de purificación de dos pasos: El primero se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando la etiqueta 6His, y el segundo en condiciones nativas usando la etiqueta Flag. Esto conduce a un aislamiento muy específico y puro de proteínas modificadas que posteriormente se identifican y semicuantifican mediante cromatografía líquida seguida de tecnología de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El fácil análisis informático de los datos de MS mediante el software Excel permite el establecimiento de perfiles PTM mediante la eliminación de señales de fondo. Estos perfiles se comparan entre cada condición con el fin de identificar alteraciones específicas que luego se estudiarán más específicamente, comenzando con su validación por técnicas de bioquímica estándar.

Introduction

El método propuesto aquí está dedicado a estudiar los PTM mediados por los miembros de la familia ubiquitina a partir de células de mamíferos cultivadas con el fin de identificar posibles alteraciones asociadas con una condición específica (tratamiento, diferenciación, etc.). Los PPT representan el último paso de regulación de las funciones de las proteínas¹. De hecho, una vez producidas por la maquinaria traslacional, la mayoría, si no todas las proteínas, se someten a diferentes tipos de MPT que modulan su actividad, interacciones moleculares y ubicación intracelular^1. Entre las plétolas de LOS PTM se encuentran las mediadas por la familia de proteínas ubiquitina, la ubiquitina en sí y todas las ubiquitinas, tienen el potencial de regular todas las proteínas intracelulares o parcialmente citoplasmáticas^2. Debido a que son en sí mismas proteínas, se pueden conjugar entre sí, formando cadenas homogéneas y heterogéneas de diversas topologías, cada una asociada con funciones reguladoras específicas^2. Se necesitan herramientas para tratar de descifrar y comprender esta compleja maquinaria. Muchos enfoques fueron desarrollados en todo el mundo, teniendo sus propias ventajas y desventajas, y aquí proponemos uno con alto rendimiento adecuado para células cultivadas.

La principal ventaja de este método es su precisión. De hecho, la pureza de las proteínas modificadas aisladas se ve muy mejorada por el uso combinatorio de las dos etiquetas (6His y Flag) y los dos pasos-procedimiento y por lo tanto es mucho más selectivo que una sola fusión de etiqueta Ub/Ubl^3,4. La presencia de la etiqueta 6His permite un primer paso de purificación en una condición de desnaturalización completa evitando así cualquier co-purificación de proteínas que contengan dominios de unión a ubiquitina u otras proteínas que se unen a los ubiquitinados. Este es un problema técnico encontrado por varios otros enfoques basados en la purificación de afinidad de proteomes ubiquitinados utilizando anticuerpos específicos⁵ o elementos de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)⁶. Es importante destacar que esta técnica no está sesgada a favor de la purificación de un determinado tipo de ubiquitinación, como podría ser el caso de algunos otros enfoques, ya que se identificaron tanto mono como diferentes tipos de poliubiquitinaciones⁷. En consecuencia, una vez que se encuentre, una alteración de la ubiquitinación tendrá que ser estudiada en más detalle por enfoques bioquímicos estándar con el fin de identificar el tipo exacto de ubiquitinación involucrada.

Por último, otra ventaja técnica de este protocolo es el uso de lentivirus, que crea fácil y rápidamente líneas celulares de expresión estables con un nivel razonable de expresiones de modificador etiquetado sin interferir con el comportamiento celular normal.

Mientras que un papel importante de la ubiquitinación es apuntar a las proteínas para la degradación proteasomal, ahora se sabe que tiene muchas otras propiedades reguladoras para potencialmente la mayoría de las proteínas intracelulares o parcialmente intracelulares¹. El número de estas funciones se incrementa aún más por la existencia de muchas ubiquitinas como proteínas, formando una familia de proteínas que regulan casi todos los mecanismos celulares¹. Sus alteraciones pueden tener un impacto drástico en la biología celular y pueden conducir o participar en situaciones patológicas^8,como el cáncer^9. Por lo tanto, se necesitan herramientas para explorar este vasto paisaje e identificar las alteraciones asociadas con una condición patológica que podría servir como nuevas dianas terapéuticas.

Este protocolo está dedicado a las células en el cultivo ya que necesitan ser transducidas para expresar exógena etiquetada Ub/Ubl. Una vez creadas, estas líneas celulares estables se pueden utilizar para generar perfiles Ubl a partir de cultivos en 2D o 3D o xenoinjertos, extendiendo así el horizonte de los diferentes modelos experimentales que se pueden aplicar para estudiar perfiles de PTM.

Protocol

1. Generación de líneas celulares estables que expresan 6His-Flag-Ubl

NOTA: Co-transfección de células HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG y delta-Helper.

1. Día 0: Seed 293T células en una placa de 6 pocillos para obtener 50-70% de confluencia al día siguiente.
2. Día 1: Células co-transfectas 50-70% de confluente con una mezcla de 1 g de pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g de pVSVG y 1 g de vectores delta-Helper, utilizando un reactivo de transfección y un protocolo para la producción de lentivirus. Después de 6 h de transfección, cambie el medio a uno fresco correspondiente a las células a transducir. Sembrar las células a transdujer en una placa de 6 pocillos con el fin de obtener una confluencia del 10-20% al día siguiente (el día de inicio de la transducción).
3. Día 2: 24 h después de la transfección, recuperar el medio que contiene partículas lentivirales y filtrar utilizando filtros de 0,45 m. Si es necesario, agregue un medio fresco en este punto para producir un segundo lote de lentivirus. Reemplace el medio de las células a transdujer (10-20% de confluencia) por la que contiene lentivirus.
   NOTA: El medio lentiviral puede mantenerse a +4 oC durante varios días antes de la transducción o almacenarse a -80 oC durante meses.
4. Incubar las células con lentivirus entre 24 h y 72 h en una incubadora estándar (37 oC, 5% CO₂), y luego cambiar el medio para uno estándar fresco. Si es posible, compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio fluorescente invertido para evaluar la eficiencia de la transducción: porcentaje de células que expresan y nivel relativo de expresión por célula. Si no se detecta fluorescencia, espere 2-3 días adicionales, ya que la expresión puede tardar más tiempo dependiendo del tipo de células que se transduzca.
5. Si el control GFP es positivo, crezca todas las células hasta tener suficiente para realizar un control de expresión de 6HF-Ubl por inmunofluorescencia y western blot usando anticuerpos anti-Flag.

2. Doble purificación de proteínas modificadas

NOTA: Tampón 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Tampón 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glicerol, pH 8.0.
Zona de influencia 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Lisis celular: Una vez listo, lave los platos de cultivo al menos una vez con solución salina con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) y proceda a la lisis celular o, alternativamente, a la congelación del flash en líquido N₂ y guárdelos a -80 oC. Para la lisis, agregue 2 ml de tampón 1 por una placa de 15 cm en RT. Utilice un rascador de células para recuperar todos los lysates en tubos centrífugos cónicos de 50 ml (volumen final de unos 20 ml).
2. Sonicar los lysates tres veces durante 30 s separados por una pausa de 1 min.
3. Centrifugar los líticos sonicados a 15.000 x g durante 15 min.
4. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo usando un colador de células (40 m).
5. Determinar la concentración de las muestras y ajustar, si es necesario, para obtener la misma cantidad de proteínas y el mismo volumen. Utilizar una cantidad total de proteína entre 50 y 100 mg (10 platos con 15 cm de diámetro para las células MiaPaCa-2).
6. Añadir las perlas Ni²⁺-NTA, utilizando 2 l de perlas por cada 1 mg de proteína.
7. Gire a 30 rpm durante 2,5 h a RT.
8. Peletizar las perlas a 500 x g durante 5 min.
9. Lavar las perlas con 1 ml de Tampón 1, transfiriendo las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y, a continuación, transferir los tubos sobre hielo. Realice todos los siguientes pasos sobre hielo o a 4 oC.
10. Lavar dos veces con 1 ml de tampón de hielo 2 que contiene 10 mM de imidazol.
11. Para eluir proteínas unidas, añadir 600 ml de tampón 2 que contenga 250 mM de imidazol y girar durante 2 h a 4 oC.
12. Reventar las perlas por centrifugación a 500 x g durante 1 min. Transfiera los sobrenatantes a nuevos tubos conjugados de 1,5 ml preenfriados y añada 50 ml de perlas conjugadas con anticuerpos anti-Bandera M2.
13. Gire a 30 rpm durante 2,5 h a 4 oC y, a continuación, lave 2 veces con 500 ml de tampón 2 y, a continuación, 2 veces con 500 oC de tampón 3.
14. Para la elución final, agregue 100 ml de Tampón 3 que contenga un péptido de bandera a 0,1 g/l y gire a 4 oC durante 1,5 h.
15. Centrifugar a 500 x g durante 1 min y transferir los sobrenatantes a nuevos tubos preenfriados.
16. Tomar 10% (10 l) para cargar en SDS-PAGE y realizar una tinción de plata del gel para controlar la calidad de purificación. Si la purificación se ve bien, analice el 90% dejado por LC-MS/MS.

3. Procesamiento de datos de espectrometría de masas para generar perfiles de LOS PPT de Ub/Ubls e identificar diferencias significativas entre ellos

NOTA: Los resultados del análisis de LA MS contienen mucha información, incluyendo el número total de péptidos, así como los valores de área pico (media del área del péptido TOP 3¹⁰⁾para cada proteína identificada en cada muestra. Estos datos se pueden procesar utilizando los números de recuento de péptidos o los valores de área pico, o ambos. Para el cálculo con áreas pico, ya que estos valores están generalmente en el rango de 10⁶, es necesario dividirlos por este orden antes de aplicar las mismas fórmulas como las siguientes. Los resultados obtenidos con ambas metodologías de conteo deben mostrar una fuerte correlación como suele hacer. Para cada proteína identificada, utilice las siguientes fórmulas cuando:
v1 valores de péptidos en la muestra de ubiquitina no tratada (por ejemplo, Ub - fármaco)
v2 valores de péptidos en la muestra de ubiquitina tratada con Gemcitabina (por ejemplo, Ub + medicamento)
valores de péptidos k1 en la muestra de GFP de control no tratada (por ejemplo, GFP - medicamento)
valores de péptidos k2 en la muestra de GFP de control tratada con Gemcitabina (por ejemplo, GFP + medicamento).

1. Normalización: Normalizar los valores entre las células tratadas con fármacos y las células no tratadas para Ubiquitina y GFP utilizando las siguientes fórmulas. Normalizado v a V y k normalizado a K.
   V1-v1. (v1+ v2) / (2. v1) ; V2-v2. (v1+ v2) / (2. v2)
   K1-k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2-k2. (k1+ k2) / (2. k2)
2. Eliminación del fondo: Utilizando las siguientes fórmulas, restar valores en la muestra de control (GFP) de los valores de la muestra de ubiquitina para obtener valores específicos (V'1 y V'2) para cada proteína identificada en ambas condiciones.
   V'1-V1-K1 si V1-K1-0 ; V'1-0 si V1-K1<0
   V'2-V2-K2 si V2-K2-0 ; V'2 s 0 si V2-K2<0
3. Variación (Var) de ubiquitinación. Para obtener una puntuación (entre -100 y +100) para las variaciones positivas y negativas de los MPT inducidas por un medicamento, utilice la siguiente fórmula en la que la diferencia entre los valores específicos de las muestras tratadas y no tratadas se divida por la suma de todos los valores, incluidos los de (para penalizar las proteínas también identificadas en el control de la PTF) y multiplicar por 100.
   Var (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ; -100Las variaciones por debajo de -50 (represión de La PTM) o superiores a 50 (inducción de La PTM) generalmente se consideran significativas.
4. Confianza (Conf). Utilice la siguiente fórmula para obtener un valor de confianza entre 0 y 100%,:
   Conf ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; 0 si <0
   Los valores superiores a 50 generalmente se consideran seguros.
5. Para obtener una distribución mejor de los valores de inducción/represión y tener en cuenta los parámetros de variación y confianza, multiplique los valores Var y Conf utilizando la siguiente fórmula donde V Var y C Conf
   SI (V2>0;((V2*C2)-2)/(10-6);-((V2*C2)-2)/(10-6))
   NOTA: Como los valores de área pico suelen ser más precisos que el recuento de péptidos, es posible utilizar software específico que se dedica a la interpretación de este tipo de datos como Perseo (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), recomendaciones de uso.

Representative Results

Transducción de células de mamíferos de cultivo para crear células de expresión de GFP y 6HF-Ub
Para producir lentivirus que se utilizarán más adelante para transducir las células MiaPaCa-2, las células HEK-293T confluentes del 70% se co-transtan con la misma cantidad de los tres vectores, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Después de 24 h de producción, el medio que contiene partículas lentivirales se recupera y filtra. Es posible en este punto controlar la eficiencia de la transfección comprobando la fluorescencia verde de GFP expresando 293T células en un microscopio invertido. Debe estar cerca del 100% de las células. Las células de MiaPaCa-2 se incuban con sobrenadante lentiviral durante 1 a 3 días. La eficacia de la transducción lentiviral se controla primero examinando la fluorescencia GFP de las células transducidas por GFP(Figura 1Panel superior). El nivel de expresión de GFP puede variar de una celda a otra, pero el 100% de ellos debe ser fluorescente. Una vez hecho este control, la expresión de Flag-ubiquitin también tendrá que ser controlada. Esto se hace mediante la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-Flag (generalmente M2 monoclonal)(Figura 1Panel inferior). Esto mostrará el porcentaje de células transducidas, que debe ser 100% para garantizar una expresión estable sobre futuros pasajes del cultivo celular. Con el fin de controlar el nivel de expresión de la bandera-ubiquitina exógena, los lysatos de las células transducidas son analizados por SDS-PAGE seguido de Western blot con anticuerpo anti-Bandera(Figura 1B). Ambas líneas celulares se pueden congelar.

Dos pasos de purificación y control por SDS PAGE y tinción de plata
Una vez validadas las líneas celulares de expresión estables, las células de PPP y 6HF-ubiquitina se amplifican hasta obtener suficiente material para proceder con la purificación de dos pasos. Se recomienda mantener una copia de seguridad de estas líneas celulares como stock congelado en nitrógeno líquido para poder descongelarlas cuando sea necesario. 36 h antes del procesamiento, la mitad de las células (mitad GFP y la mitad 6HF-Ubiquitin) se tratan con 10 m de gemcitabina. Cuando están listas, las proteínas ubiquitinadas se purifican a partir de 6HF-ubiquitina y de las células de control de GFP, utilizando el protocolo de purificación de dos pasos(Figura 2A). El 10% de la elución final se utiliza para controlar la cantidad y la integridad del material purificado por SDS-PAGE y la tinción de plata del gel(Figura 2B). Las bandas de marcadores de peso molecular se pueden utilizar para estimar la cantidad de proteínas ubiquitinadas purificadas. Alternativamente, una cantidad conocida de BSA o cualquier otra proteína se puede cargar en una línea del gel para ayudar a cuantificar las proteínas purificadas. Una vez realizada esta verificación, el 90% restante de las muestras se analizan mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem para permitir la identificación y semi-cantidadización de proteínas purificadas.

Identificación de proteínas ubiquitinadas por sustracción por fondo (muestras de PFP)
Los datos del análisis LC-MS/MS de las muestras proporcionan los nombres y cuantificaciones (áreas pico y número de péptidos observados) de cada proteína identificada en muestras DeSM y 6HF-Ub. Las proteínas que tienen la mayor cuantificación en la muestra de ubiquitina en comparación con la muestra de GFP son más propensas a ser las realmente ubiquitinadas y la aplicación de las fórmulas descritas en los métodos anteriores permite su clasificación dando una puntuación de confianza de 0 a 100% . Las proteínas identificadas con una puntuación superior al 50% se consideran ubiquitinadas(Figura 3A).

Este paso que básicamente elimina las proteínas de fondo (GFP) de las muestras de ubiquitina condujo a la identificación de 364 proteínas significativamente ubiquitinadas(Figura 3B)⁷. Tenga en cuenta aquí que las proteínas identificadas con las puntuaciones más altas ya se conocen principalmente como objetivos principales de la ubiquitinación que demuestra la eficacia de este método de purificación.

A continuación, es posible realizar un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de estas proteínas ubiquitinadas con el fin de destacar los procesos biológicos en los que están involucrados(Figura 3C),sus funciones moleculares, su compartimento celular, o cualquier otra categorización ontológica genética. Es interesante comparar este proteome ubiquitinado con el proteome completo de la célula cuando sea posible. De hecho, este análisis revela la contribución real de estas proteínas ubiquitinadas en procesos específicos como la traducción o la proteólisis, por ejemplo(Figura 3C).

El propósito principal de este tipo de experimento es identificar alteraciones dentro del proteome ubiquitinado inducido por un tratamiento, por ejemplo, aquí gemcitabina. Al comparar el ubiquitinome (el proteome específico ubiquitinado) en células tratadas y no tratadas utilizando la fórmula específica produce un valor de -100 (represión de la ubiquitinación) a +100 (inducción de ubiquitinación). Teniendo en cuenta que sólo los valores por debajo de -50 o más +50 son significativos, se han identificado un total de 73 ubiquitizaciones inducidas y 29 ubiquitizaciones reprimidas (Figura 4A). El análisis GSEA de estas alteraciones de la ubiquitinación reveló enriquecimientos específicos en los procesos de reparación del ADN o ciclo celular, y variaciones importantes en los procesos metabólicos de traducción y ARN(Figura 4B). Este resultado es altamente lógico ya que la gemcitabina es un análogo de base que bloquea la síntesis de ADN y provoca daños en el ADN.

Para ir más allá, también es interesante utilizar bases de datos de proteínas que interactúan con el fin de explorar y validar posibles redes de interacción formadas por alteraciones inducidas por gemcitabina de ubiquitinación(Figura 5). Esto condujo a la identificación de redes de interacción funcionales fuertemente afectadas por el aumento o disminución de la ubiquitinación de las proteínas involucradas.

Finalmente, entre la ubiquitinación alterada, algunos pueden involucrar proteínas de mayor interés, debido a sus funciones conocidas o potenciales según la literatura. Por lo tanto, un paso importante es validar que lo que se observa mediante espectrometría de masas es real y confiable. PCNA fue una de las proteínas más sobre-ubiquitinadas en el tratamiento con gemcitabina detectada por el análisis de espectrometría de masas(Figura 4A). Para verificar que la gemcitabina de hecho induce la ubiquitinación de PCNA, las células MiaPaCa-2 que expresan 6HF-Ub y GFP se cultivan, tratan o no, y están sujetas a la purificación de Ni-NTA en condiciones de desnaturalización o a la inmunoprecipitación anti-bandera seguida de Flag elución de péptidos en condiciones nativas, resuelta en SDS PAGE seguida de western blot con el anticuerpo correspondiente. El resultado mostrado en la Figura 6 confirmó que de hecho PCNA está fuertemente ubiquitinado en respuesta al tratamiento con gemcitabina en células de MiaPaCa-2.

Figura 1: Establecimiento de líneas celulares estables que expresan 6His-Flag-Ubl. (A) Control de la expresión gFP en células transducidas por GFP (panel superior) y de 6His-Flag-Ubiquitin por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-Flag (M2) como anticuerpo secundario antiratón primario y alexa-567. DAPI se utilizó para manchar los núcleos. Barra de escala: 50 m. (B) Control de la expresión de 6His-Flag-Ubiquitin en las lisates celulares por western blot usando anticuerpos anti-Flag (Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo anti-6his) a la izquierda, y anticuerpo anti-ubiquitina, a la derecha, para comparar la expresión de 6Su bandera-ubiquitina (6HF-Ubiq) con Ubiquitina endógena (Endo. Ubiq). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Purificación de dos pasos de proteínas ubiquitinadas. (A) Representación esquemática del procedimiento. (B) El 10% de la elución final fue sometida a SDS PAGE seguida de la tinción plateada del gel para estimar la cantidad y pureza (en comparación con GFP) de proteínas aisladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Identificación de proteínas ubiquitinadas (adaptadas de Bonacci et al. ⁷). (A) La cantidad relativa de péptidos específicos (muestra de ubiquitina) y no específicos (muestra de FPG) para cada proteína identificada se trazaron en función de sus puntuaciones seguras. Como se muestra, la proporción de proteínas no específicas sobre las ubiquitinadas se vuelve demasiado importante por debajo de la puntuación de 50. Por lo tanto, sólo las proteínas identificadas con una puntuación superior a 50 se consideran significativas. (B) Tabla que muestra las 20 mejores proteínas ubiquitinadas entre el total 364 identificado. (C) Repartición de proteínas ubiquitinadas y proteínas totales de células MiaPaCa-2 dentro de procesos biológicos (valores > 1,5% se consideraron solamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Alteraciones inducidas por Gemcitabina de perfiles PTM (adaptadas de Bonacci et al. ⁷). A) Listado de las 20 proteínas con mayor aumento (total 73) o disminución (total 29) ubiquitinación tras el tratamiento con gemcitabina (Conf: confianza; Ind: inducción; Rep: represión). (B) La repartición de Gemcitabina indujo ubiquitinación alterada dentro de procesos biológicos y comparación con no tratada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Interactomes funcionales de gemcitabina indujeron ubiquitinación alterada. Las posibles interacciones entre todas las proteínas con la alteración inducida por gemcitabina de la ubiquitinación se identifican mediante una base de datos de interacciones proteína-proteína (STRING: string-db.org). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Validaciones bioquímicas de interesantes alteraciones inducidas por gemcitabina de ubiquitinación. Con el fin de validar el aumento de la ubiquitinación de PCNA después del tratamiento con gemcitabina, los lysates de células que expresan 6HF-Ubiquitina, tratadas o no con gemcitabina, fueron sometidos a níquel-abajo (Ni-NTA) seguido de la mancha occidental anti-PCNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hemos desarrollado una metodología robusta y fiable para generar perfiles de proteínas modificados por los principales miembros de la familia ubiquitina. De hecho, hemos aplicado con éxito este protocolo para generar perfiles de PTM según ubiquitina, y también por SUMO y Nedd8, y para detectar alteraciones asociadas con un tratamiento^7,en respuesta a la sobreexpresión o derribo de un determinado gen (datos no y en las células que adquirieron un fenotipo resistente a diversos fármacos quimioterápicos.

Hay sólo unos pocos pasos críticos durante el procedimiento que el manipulador debe tener cuidado con. Tras el pipeteo de cuentas (Ni-NTA o anti-Flag acoplado), es importante resuspenderlas a fondo, especialmente las cuentas anti-Bandera ya que están suspendidas en un tampón viscoso basado en glicerol, y cortar un poco el extremo de la punta para aumentar la sección. Otra precaución debe ser seguida es pipetear lentamente con el fin de evitar el apilamiento de cuentas. Pasos críticos adicionales son la elución con imidazol y luego con péptido de bandera. Se debe utilizar una jeringa Hamilton limpia para recuperar el sobrenadante después de la elución para evitar, en la medida de lo posible el pipeteo de las perlas en las que quedan proteínas inespecíficos.

Dependiendo del tipo de celda y la cantidad de material final requerido para la espectrometría de masas, el material de partida puede aumentarse o disminuirse en consecuencia. Entonces, el único ajuste importante reside en el volumen de cuentas de níquel, ya que debe ser de 2 l por 1 mg de proteínas en el lisato. Puede suceder que la cantidad de proteínas purificadas sea demasiado baja. El nivel de expresión de Ub/Ubl etiquetado debe ser controlado y, si es demasiado bajo, las células se pueden re-transducir usando los mismos lentivirus. Alternativamente, es posible aumentar la cantidad de material de partida. A veces, la cantidad de material purificado inespecífico en la PFP o en las células parentales es demasiado alta. Una solución para superar este problema es aumentar el volumen y el número de lavados tanto en Ni-NTA como en los pasos de purificación de flag. También es posible aumentar la concentración de imidazol en lavados con tampón de guanidina, hasta 20 mM. Inversamente, no es necesario aumentar la concentración de péptido de bandera en el paso de elución final, ya que no aumentará la elución. Es más importante utilizar péptido fresco como con el tiempo, incluso si se almacena a -20 oC, la eficacia del péptido puede disminuir.

La principal limitación de este protocolo es que sólo es adecuado para las células cultivadas porque tienen que ser transducidas para expresar el Ubl etiquetado deseado. Por lo tanto, cualquier estudio sobre tejidos o muestras tumorales debe realizarse utilizando enfoques alternativos como enriquecimientos de péptidos diglilos después de la digestión de trippsina¹¹, inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de la Ub/Ubl de interés⁵, o el uso de TUBEs⁶. Todos estos métodos alternativos también son adecuados para su aplicación en celdas cultivadas. Tienen la ventaja de utilizar la maquinaria endógena Ub/Ubls. Sin embargo, existen varios inconvenientes. Las inmunoprecipitaciones son difíciles de realizar con un fondo bajo y, al igual que los enfoques de las TUBEs, las proteínas que interactúan con las proteínas modificadas, e incluso el propio modificador, no se pueden eliminar, a pesar de que se han obtenido mejoras prácticas utilizando condiciones más estrictas. El enriquecimiento de péptidos DiGly es una técnica muy poderosa, pero puede corresponder a diferentes tipos de PTM. Por ejemplo, el enriquecimiento digly de un lisato digerido de trippsina identificará principalmente proteínas ubiquitinadas pero también enredted, ya que Nedd8 deja la misma firma diGly remanente que la ubiquitina¹¹.

Otra limitación de este protocolo es que la presencia de la etiqueta 6His-Flag puede alterar el funcionamiento normal de Ub/Ubl y la sobreexpresión por sí misma podría alterar la maquinaria. Esto podría, por ejemplo, impedir la generación de cadenas de poliubiquitina y favorecer la monoubiquitinación. Sin embargo, dado que las cadenas mono multi y poliubiquitina se han identificado utilizando este protocolo, parece que no es el caso⁷. La presencia de la etiqueta en el N-terminus también impide la formación de ubiquitinación lineal, donde las mitades de ubiquitina se unen entre sí a través de la N-terminal metionina de ubiquitina. Sin embargo, a pesar de 6HF-udiquitin no puede ser ubiquitinado en su primer residuo Met, todavía tiene la capacidad de poner fin a este tipo de cadena.

Además, mientras que es una ventaja sustancial utilizar lentivirus que permite la creación de líneas de células estables en una o dos semanas, es posible que no todas las células expresen la construcción deseada. Esto puede no ser un problema real para el procedimiento de purificación, siempre y cuando suficientes células expresen el Ub/ubl exógeno, pero el problema puede venir con el cultivo a largo plazo, ya que en varios pasajes podría haber una variación clonal con el enriquecimiento en células con menos o ningún Expresión. Este inconveniente, sin embargo, se puede omitir fácilmente mediante el uso de lentivirus que contienen un gen de selección de resistencia o una proteína fluorescente que se puede utilizar en la citometría de flujo para seleccionar sólo células positivas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag