Profilering ubiquitin och ubiquitin-liknande beroende post-translationella modifieringar och identifiering av betydande förändringar

Summary

Detta protokoll syftar till att upprätta ubiquitin (UB) och ubiquitin-likes (ubls) specifika proteom för att identifiera förändringar av denna typ av posttranslationella modifieringar (ptms), associerade med ett specifikt tillstånd såsom en behandling eller en fenotyp.

Abstract

Ubiquitin (UB) och ubiquitin-liknande (UBL) beroende post-translationella modifieringar av proteiner spelar grundläggande biologiska reglerande roller i cellen genom att kontrollera protein stabilitet, aktivitet, interaktioner, och intracellulär lokalisering. De gör det möjligt för cellen att reagera på signaler och att anpassa sig till förändringar i sin omgivning. Förändringar inom dessa mekanismer kan leda till svåra patologiska situationer såsom neurodegenerativa sjukdomar och cancer. Syftet med den teknik som beskrivs här är att etablera UB/ubls beroende PTMs profiler, snabbt och korrekt, från odlade cellinjer. Jämförelsen av olika profiler som erhålls från olika förhållanden gör det möjligt att identifiera specifika förändringar, såsom de som induceras av exempelvis en behandling. Lentiviral medierad celltransduktion utförs för att skapa stabila cellinjer som uttrycker en två-Tags (6His och flagga) version av modifieraren (ubiquitin eller en UBL som SUMO1 eller Nedd8). Dessa taggar tillåter rening av ubiquitin och därför av och proteiner från cellerna. Detta görs genom en två-stegs reningsprocess: den första utförs i denatureringsförhållanden med hjälp av 6His tagg, och den andra i inhemska förhållanden med hjälp av flaggan taggen. Detta leder till en mycket specifik och ren isolering av modifierade proteiner som därefter identifieras och semikvantifieras genom vätskekromatografi följt av tandem-masspektrometri (LC-MS/MS)-teknik. Enkel informatikanalys av MS-data med Excel-programvara gör det möjligt att etablera PTM-profiler genom att eliminera bakgrunds signaler. Dessa profiler jämförs mellan varje villkor för att identifiera specifika förändringar som sedan kommer att studeras mer specifikt, börjar med deras validering av vanliga biokemiska tekniker.

Introduction

Den metod som föreslås här är tillägnad studera PTMs förmedlas av ubiquitin familjemedlemmar från odlade däggdjursceller för att identifiera potentiella förändringar i samband med ett visst tillstånd (behandling, differentiering, etc). PTMs representerar det sista steget i regleringen av proteiners funktioner¹. Faktum är att en gång produceras av translationella maskiner, de flesta om inte alla proteiner genomgår olika typer av PTMs som modulera sin verksamhet, molekylära interaktioner, och intracellulära plats¹. Bland de överflöd av PTMs är de som förmedlas av ubiquitin familjen av proteiner, ubiquitin själv och alla ubiquitin-likes, har potential att reglera alla intracellulära eller delvis cytoplasmiska proteiner². Eftersom de själva är proteiner, de kan konjugeras till varandra, bildar homogena och heterogena kedjor av olika topologier, varje associerad med specifika reglerande funktioner². Verktyg behövs för att försöka dechiffrera och förstå denna komplexa maskiner. Många metoder har utvecklats över hela världen, med sina egna fördelar och nackdelar, och här föreslår vi en med hög prestanda som lämpar sig för odlade celler.

Den största fördelen med denna metod är dess noggrannhet. Faktum är att renheten av isolerade modifierade proteiner är mycket bättre genom den kombinatoriska användningen av de två taggarna (6his och flagga) och de två steg-förfarande och därför är det mycket mer selektiv än en enda tagg fusion UB/UBL^3,4. Närvaron av 6his tag möjliggör ett första steg i rening i ett helt denaturerande tillstånd därigenom undvika någon samrening av proteiner som innehåller ubiquitin bindande domäner eller andra proteiner som binder till de och sådana. Detta är ett tekniskt problem som uppstått på grund av flera andra tillvägagångssätt som bygger på affinitetsrening av ubiquitinerade proteomer med antingen specifika antikroppar⁵ eller tandem-bindningselement (rör)⁶. Viktigare är denna teknik inte partisk till förmån för rening av en viss typ av ubiquitination, eftersom det kan vara fallet för vissa andra metoder, eftersom både mono och olika typer av polyubiquitinations identifierades⁷. Följaktligen, en gång funnit, en förändring av ubiquitination kommer att behöva studeras i mer detaljer genom standard biokemiska metoder för att identifiera den exakta typen av ubiquitination inblandade.

Slutligen, en annan teknisk fördel med detta protokoll är användningen av lentivirus, som lätt och snabbt skapar stabila uttrycker cellinjer med rimlig nivå av uttryck för taggade modifierare utan att störa den normala cellulära beteende.

Medan en viktig roll ubiquitination är att rikta proteiner för proteasomen nedbrytning, är det nu känt att det har många andra reglerande egenskaper för potentiellt de flesta intracellulära eller delvis intracellulära proteiner¹. Numrera av dessa fungerar förstärks vidare av existensen av många ubiquitin lika proteiner som bildar en familj av proteiner som reglerar nästan varje cellmekanism¹. Deras förändringar kan få drastiska effekter på cellbiologi och kan leda eller delta i patologiska situationer⁸, såsom cancer⁹. Därför behövs verktyg för att utforska detta vidsträckta landskap och identifiera de förändringar som är förknippade med ett sjukdomstillstånd som kan fungera som nya terapeutiska mål.

Detta protokoll är tillägnad celler i kulturen eftersom de måste vara sensorik att uttrycka exogena taggade UB/UBL. När de har skapats kan dessa stabila cellinjer användas för att generera UBL-profiler från kulturen i 2D eller 3D eller xenografts, vilket utökar horisonten för de olika experimentella modellerna som kan användas för att studera PTMs-profiler.

Protocol

1. generering av stabila cellinjer uttrycker 6His-flagga-UBL

Obs: Co-transfektion av HEK-293T celler med pCCL-6HF-UBL, pVSVG och delta-Helper.

1. Dag 0: Seed 293t celler i en 6-brunn tallrik för att få 50-70% sammanflödet dagen efter.
2. Dag 1: Co-transfect 50-70% konfluenta celler med en blandning av 1 μg pccl-6hf-UBL eller pccl-GFP, 1 μg pvsvg och 1 μg delta-Helper vektorer, med hjälp av en transfektion reagens och protokoll för lentivirus produktion. Efter 6 h av transfektion, ändra mediet till en ny en motsvarande celler som ska transduced. Frö cellerna att vara sensorik i en 6 väl tallrik för att få en 10-20% sammanflödet dagen efter (dagen för att starta Transduction).
3. Dag 2:24 h efter transfektion, återvinna mediet innehållande lentivirala partiklar och filter med 0,45 μm filter. Om det behövs, tillsätt färskt medium på denna punkt för att producera en andra omgång av lentivirus. Byt ut mediet av celler som ska sensorik (10-20% Confluence) av den som innehåller lentiviruses.
   Anmärkning: Lentiviral medium kan hållas vid + 4 ° c i flera dagar före transduktion eller lagras vid-80 ° c i månader.
4. Inkubera cellerna med lentivirus mellan 24 h till 72 h i en standard inkubator (37 ° c, 5% CO₂), och sedan byta medium för färsk standard en. Om möjligt, kontrollera GFP uttryck med hjälp av en inverterad fluorescerande Mikroskop för att utvärdera effektiviteten i transduktion: procentandel av att uttrycka celler och relativ uttrycksnivå per cell. Om ingen fluorescens upptäcks, vänta ytterligare 2-3 dagar som uttrycket kan ta längre tid beroende på celler typ som ska transduced.
5. Om GFP Control är positivt, odla alla celler tills de har tillräckligt för att utföra ett uttryck kontroll av 6HF-UBL av immunofluorescensbildning och Western blot med anti-Flag antikropp.

2. dubbel rening av modifierade proteiner

Anmärkning: buffert 1:6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Buffert 2:50 mM NaH₂Po₄, 150 mm NaCl, 1% Tween20, 5% glycerol, pH 8,0.
Buffert 3:100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Cell lysis: när du är klar, tvätta kultur rätter minst en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur (RT) och fortsätt till cell lysis eller, alternativt, blixt frysa i flytande N₂ och förvara vid-80 ° c. För Lys, tillsätt 2 ml buffert 1 per 15 cm maträtt vid RT. Använd en cell skrapa för att återvinna alla celllysat i 50 ml koniska centrifugrör (slutlig volym ca 20 ml).
2. Sonikera celllysat tre gånger för 30 s separerade med en 1 min paus.
3. Centrifugera sonicated celllysat vid 15 000 x g i 15 min.
4. Överför supernatanten till ett nytt rör med hjälp av en cellsil (40 μm).
5. Bestäm provens koncentration och justera, om nödvändigt, för att erhålla samma mängd proteiner och samma volym. Använd en total mängd protein mellan 50 och 100 mg (10 rätter med 15 cm diameter för MiaPaCa-2 celler).
6. Tillsätt ni^{2 +}-nta-pärlor, med 2 μl pärlor per 1 mg protein.
7. Rotera vid 30 rpm under 2,5 h vid RT.
8. Pellets pärlorna vid 500 x g i 5 min.
9. Tvätta pärlorna med 1 mL buffert 1, överför proverna till ett 1,5 mL microcentrifugerör och överför sedan rören på isen. Utför alla nästa steg på is eller vid 4 ° c.
10. Tvätta två gånger med 1 mL iskalla buffert 2 innehållande 10 mM Imidazol.
11. För att eluera bundna proteiner, tillsätt 600 μL buffert 2 som innehåller 250 mM Imidazol och rotera för 2 h vid 4 ° c.
12. Pellets pärlorna genom centrifugering vid 500 x g för 1 min. överför supernatanterna till nya, förkylda, 1,5 ml-rör och tillsätt 50 μl anti-Flag m2 antikroppar konjugerade pärlor.
13. Rotera vid 30 RPM för 2,5 h vid 4 ° c, tvätta sedan 2 gånger med 500 μL buffert 2, sedan 2 gånger med 500 μL buffert 3.
14. För den slutliga elueringen, tillsätt 100 μL buffert 3 som innehåller en flagg peptid på 0,1 μg/μL och rotera vid 4 ° c i 1,5 h.
15. Centrifugera vid 500 x g i 1 min och överför supernatanterna till nya förkylda rör.
16. Ta 10% (10 μL) för att ladda på SDS-PAGE och gör en silver färgning av gelen för att kontrollera renings kvaliteten. Om reningen ser bra ut, analysera 90% kvar av LC-MS/MS.

3. behandling av masspektrometridata för att generera profiler av UB/Ubls PTMs och för att identifiera betydande skillnader mellan dem

Anm.: resultat från MS-analys innehåller många uppgifter, inklusive det totala antalet peptider samt topp områdes värden (medelvärde av topp 3 peptid område¹⁰) för varje protein som identifieras i varje prov. Dessa data kan bearbetas med hjälp av antingen peptid antal eller topparea värden, eller båda. För beräkning med topp-områden, eftersom dessa värden är vanligtvis i intervallet 10⁶, är det nödvändigt att dela upp dem med denna ordning innan du tillämpar samma formler enligt nedan. De resultat som erhålls med båda metoderna för inventering bör visa en stark korrelation som det brukar. För varje identifierat protein, Använd följande formler där:
v1 peptider värden i icke-behandlat ubiquitin prov (t. ex. UB-läkemedel)
v2 peptider värden i gemcitabin behandlat ubiquitin prov (t. ex., UB + läkemedel)
K1 peptider-värden i icke-behandlat kontroll-GFP-prov (t. ex. GFP-läkemedel)
K2 peptider värden i gemcitabin behandlade kontroll GFP prov (t. ex., GFP + läkemedel).

1. Normalisering: normalisera värden mellan läkemedelsbehandlade celler och obehandlade celler för ubiquitin och GFP med hjälp av följande formler. Normaliserade v = V och normaliserade k = K.
   V1 = v1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1); V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = K1. (∑ K1 + ∑ K2)/(2. ∑ K1); K2 = K2. (∑ K1 + ∑ K2)/(2. ∑ K2)
2. Borttagning av bakgrund: med hjälp av följande formler subtrahera du värden i kontroll exempel (GFP) från värden i ubiquitin-provet för att erhålla specifika värden (V ' 1 och V ' 2) för varje identifierat protein i båda villkoren.
   V ' 1 = v1-K1 om v1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 om v1-K1 < 0
   V ' 2 = v2-K2 om v2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 om v2-K2 < 0
3. Variation (var) av ubiquitination. För att få en poäng (mellan-100 och + 100) för positiva och negativa variationer av PTMs som induceras av ett läkemedel, Använd följande formel där skillnaden mellan specifika värden av behandlade och obehandlade prover divideras med summan av alla värden, inklusive de i kontroll (för att bestraffa proteiner som också identifierats i kontroll GFP), och multiplicera med 100.
   Var = (V' 2-V ' 1)/(v1 + K1 + v2 + K2) * 100; -100 < var < 100;
   Variationer under-50 (förtryck av PTM) eller över 50 (induktion av PTM) anses vanligtvis vara betydande.
4. Förtroende (conf). Använd följande formel för att få ett konfidens värde mellan 0 och 100%:
   Conf = ((v1 + v2)²/(1 + v1 + v2 + K1 + K2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 om < 0
   Värden över 50 anses vanligtvis vara självsäkra.
5. För att få en trevligare fördelning av induktion/repression värden och att överväga både variation och konfidensparametrar, multiplicera var och conf värden med hjälp av följande formel där V var och C conf
   = SI (v2 > 0;((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   Anmärkning: eftersom Peak Area värden är oftast mer exakt än peptid räkning, är det möjligt att använda särskild programvara som är avsedda för tolkningen av denna typ av data såsom Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), efter rekommendationer om användning.

Representative Results

Transduktion av kultur däggdjursceller för att skapa GFP och 6HF-UB som uttrycker celler
För att producera lentivirus som kommer att användas senare för att transduce miapaca-2 celler, 70% konfluenta hek-293t celler Co-transfected med en lika stor del av de tre vektorer, pccl-6hf-ubiquitin eller GFP/delta-Helper/pvsvg. Efter 24 h produktion, mediet innehållande lentivirala partiklar återvinns och filtreras. Det är möjligt på denna punkt att kontrollera effektiviteten i transfektion genom att kontrollera den gröna fluorescens av GFP uttrycker 293T celler på ett inverterat Mikroskop. Det bör vara nära 100% av cellerna. MiaPaCa-2 celler inkuberas med lentiviral supernatanten för 1 till 3 dagar. Effekten av lentiviral transduktion kontrolleras först genom att titta på GFP fluorescens av GFP-sensorik celler (figur 1en övre panel). Den GFP uttrycksnivå kan variera från en cell till en annan, men 100% av dem bör vara fluorescerande. När denna kontroll är klar, kommer uttrycket av flaggan-ubiquitin måste också kontrolleras. Detta görs genom immunofluorescensfärgning med hjälp av en anti-flaggad antikropp (vanligtvis m2 monoklonal) (figur 1en lägre panel). Detta kommer att Visa andelen sensorik celler, som bör vara 100% för att garantera ett stabilt uttryck över framtida passager av cellkultur. För att kontrollera uttrycksnivån för EXOGEN flagga-ubiquitin analyseras celllysat från omvandade celler av SDS-Page följt av Western blot med anti-Flag antikropp (figur 1B). Båda cellinjer kan frysas.

Två steg rening och kontroll av SDS sida och silver färgning
När den stabila uttryck cellinjer har validerats, både GFP och 6HF-ubiquitin celler förstärks tills tillräckligt med material erhålls för att fortsätta med två steg rening. Det rekommenderas att hålla en säkerhetskopia av dessa cellinjer som fryst lager i flytande kväve för att kunna Tina dem när det behövs. 36 h före bearbetning behandlas hälften av cellerna (halv GFP och halv 6HF-ubiquitin) med 10 μM gemcitabin. När de är klara renas ubiquitinerade proteiner från 6HF-ubiquitin och från GFP-kontrollceller med hjälp av det tvåstegs renings protokollet (figur 2A). 10% av den slutliga elueringen används för att kontrollera mängden och integriteten hos det renade materialet genom SDS-PAGE och silver färgning av gelen (figur 2B). Molekylvikt markörer band kan användas för att uppskatta mängden renade och proteiner. Alternativt kan en känd mängd BSA eller något annat protein lastas i en linje av gelen för att hjälpa till att kvantifiera de renade proteinerna. När verifieringen är klar analyseras de återstående 90% av proverna med vätskekromatografi kopplad till tandemmasspektrometri för att möjliggöra identifiering och semikvantifiering av renade proteiner.

Identifiering av ubiquitinerade proteiner med bakgrund (GFP-prov) subtraktion
Data från LC-MS/MS-analys av proverna ger namn och kvantifieringar (topp områden och antal observerade peptider) för varje identifierat protein i prover från GFP och 6HF-UB. De proteiner som har den högsta kvantifieringen i ubiquitin prov jämfört med GFP prov är mest sannolikt att de verkligen och och tillämpa de formler som beskrivs i metoder ovan tillåter deras klassificering genom att ge ett förtroende Poäng från 0 till 100% . Proteiner som identifierats med en poäng över 50% anses vara ubiquitinerade (figur 3a).

Detta steg som i princip avlägsnar bakgrunds proteiner (GFP) från ubiquitin prover ledde till identifiering av 364 proteiner signifikant och (figur 3B)⁷. Observera här att de proteiner som identifierats med de högsta poängen är oftast redan kända som huvudmål för ubiquitination som bevisar effekten av denna reningsmetod.

Därefter är det möjligt att utföra en analys av genanrikning (gsea) av dessa ubiquitinerade proteiner för att belysa de biologiska processer i vilka de är inblandade (figur 3C), deras molekylära funktioner, deras cell utrymme, eller någon annan kategorisering av gen ontologi. Det är intressant att jämföra denna och proteomet med hela proteomen i cellen när det är möjligt. Denna analys avslöjar faktiskt det verkliga bidraget från dessa ubiquitinerade proteiner i specifika processer såsom översättning eller proteolys till exempel (figur 3C).

Det huvudsakliga syftet med denna typ av experiment är att identifiera förändringar inom den och proteomet induceras av en behandling till exempel, här gemcitabin. Genom att jämföra ubiquitinome (den och specifika proteomen) i behandlade och obehandlade celler med hjälp av den specifika formeln ger ett värde från-100 (förtryck av ubiquitination) till + 100 (induktion av ubiquitination). Med tanke på att endast värdena under-50 eller högre + 50 är betydande, har totalt 73 inducerade ubiquitinations och 29 undertryckta ubiquitinations identifierats (figur 4a). GSEA analys av dessa förändringar av ubiquitination avslöjade specifika anrikningar i processer DNA-reparation eller cell cykel, och viktiga variationer i översättning och RNA metaboliska processer (figur 4B). Detta resultat är mycket logiskt eftersom gemcitabin är en bas analog som blockerar DNA-syntes och framkallar DNA-skador.

För att gå vidare är det också intressant att använda databaser av samverkande proteiner för att utforska och validera potentiella samverkande nätverk som bildas av gemcitabin inducerade förändringar av ubiquitination (figur 5). Detta ledde till identifiering av funktionella samverkande nätverk påverkas starkt av ökad eller minskad ubiquitination av de inblandade proteinerna.

Slutligen, bland de förändrade ubiquitination, vissa kan involvera proteiner av högsta intresse, på grund av deras kända eller potentiella funktioner enligt litteraturen. Därför är ett viktigt steg att validera att det som observeras av masspektrometri är verkligt och trovärdigt. PCNA var ett av de mest utbredda proteinhalten vid behandling med gemcitabin upptäckt av masspektrometrianalys (figur 4A). För att kontrollera att gemcitabin verkligen inducerar ubiquitination av PCNA, MiaPaCa-2 celler som uttrycker 6HF-UB och GFP odlas, behandlas eller inte, och omfattas av antingen ni-NTA rening i denatureringsförhållanden eller anti-flagga immunoprecipitation följt av flagga peptid eluering i inhemska tillstånd, löst på SDS sida följt av Western blot med motsvarande antikropp. Det resultat som visas i figur 6 bekräftade att faktiskt PCna är starkt och som svar på behandling med gemcitabin i miapaca-2 celler.

Figur 1: upprättande av stabila cellinjer som uttrycker 6His-flagga-UBL. A) kontroll av GFP-uttryck i GFP-transdukerade celler (övre panelen) och 6His-flagga-ubiquitin genom immunofluorescens med anti-Flag (m2) antikropp som primär och alexa-567 antimus sekundär antikropp. DAPI användes för att fläcka kärnor. Skalbar: 50 μm. B) kontroll av 6his-flagga-ubiquitin-uttryck i cell celllysat av Western blot med anti-flaggad antikropp (Alternativt kan en anti-6his-antikropp användas) till vänster och anti-ubiquitin-antikropp till höger för att jämföra uttrycket av 6His-sjunka-ubiquitin (6HF-Ubiq) med endogent ubiquitin (endo. Ubiq). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: rening av ubiquitinerade proteiner i två steg. A) schematisk representation av förfarandet. B) 10% av den slutliga elueringen UTSATTES för SDS-sida följt av silver färgning av gelen för att uppskatta kvantiteten och renheten (jämfört med GFP) av isolerade proteiner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: identifiering av ubiquitinerade proteiner (anpassad från Bonacci et al. ⁷). A) den relativa mängden specifikt (ubiquitin-prov) och icke-specifika (GFP-prov) peptider för varje identifierat protein plottas i funktion av deras säkra resultat. Som visats blir andelen icke-specifika över ubiquitinerade proteiner för viktig under poängen 50. Därför anses endast proteiner som identifierats med en poäng överlägsen 50 vara signifikanta. B tabell som visar de 20 bästa ubiquitinerade proteinerna bland de 364-Totalt identifierade. C) ompartitionering av ubiquitinerade proteiner och totala proteiner av MiaPaCa-2-celler inom biologiska processer (värden > 1,5% ansågs endast). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: gemcitabin inducerade förändringar av PTM-profiler (anpassade från Bonacci et al. ⁷). A) notering av de 20 proteiner som har störst ökning (totalt 73) eller minskat (totalt 29) ubiquitination vid behandling med gemcitabin (conf: förtroende; IND: induktion; Rep: repression). B) återpartitionering av inducerad förändrad gemcitabin i biologiska processer och jämförelse med icke-behandlad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: funktionella interactomer av gemcitabin inducerade förändrad ubiquitination. Potentiella interaktioner mellan alla proteiner med gemcitabin inducerad förändring av ubiquitination identifieras med hjälp av en protein-protein interaktioner databas (STRING: string-db.org). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: biokemiska valideringar av intressanta gemcitabin inducerade förändringar av ubiquitination. För att validera den ökade ubiquitination av PCNA efter behandling med gemcitabin har lysaterna av celler som uttrycker 6HF-ubiquitin, behandlats eller inte med gemcitabin, genomgått nickel pull-down (ni-NTA) följt av anti-PCNA Western blot. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi har utvecklat en robust och tillförlitlig metodik för att generera profiler av proteiner som modifierats av de viktigaste ubiquitin familjemedlemmarna. I själva verket har vi framgångsrikt tillämpat detta protokoll för att generera profiler av PTMs av ubiquitin, och även av SUMO och Nedd8, och för att upptäcka förändringar i samband med en behandling⁷, som svar på över uttryck eller knockdown av en viss gen (data inte som visats) och i celler som förvärvat en resistent fenotyp till olika kemoterapeutiska läkemedel.

Det finns bara några kritiska steg under förfarandet att manipulatorn bör vara försiktig med. Vid pipettering av pärlor (ni-NTA eller anti-flagga kopplade), är det viktigt att Omsuspendera dem grundligt, särskilt anti-flagga pärlor sedan suspenderas i en trögflytande glycerolbaserad buffert, och att skära lite i slutet av spetsen för att öka avsnittet. En annan försiktighetsåtgärd bör följas är att Pipettera långsamt för att undvika stapling av pärlor. Ytterligare kritiska steg är elueringen med Imidazol och sedan med flagg peptid. En ren Hamilton spruta måste användas för att återvinna supernatanten efter eluering för att undvika, så mycket som möjligt pipettering av pärlorna på vilka ospecifika proteiner kvar.

Beroende på celltyp och mängden nödvändigt slutmaterial för masspektrometri kan utgångsmaterialet ökas eller sänkas i enlighet med detta. Sedan, den enda viktiga justeringen finns i volymen av nickel pärlor som det bör vara av 2 μL per 1 mg proteiner i lysate. Det kan hända att mängden renat protein är för låg. Uttrycksnivån för taggade UB/UBL bör kontrolleras och, om det är för lågt, celler kan omtransduced med samma lentiviruses. Alternativt är det möjligt att öka mängden utgångsmaterial. Ibland är mängden ospecifikt renat material i GFP eller föräldra celler för hög. En lösning för att övervinna detta problem är att öka volymen och antalet tvättar på både ni-NTA och flagga reningssteg. Det är också möjligt att öka koncentrationen av Imidazol i tvättar med guanidin buffert, upp till 20 mM. Omvänt är det inte nödvändigt att öka koncentrationen av flagg peptid i det slutliga elutionssteget eftersom det inte kommer att öka elueringen. Det är viktigare att använda färska peptid som över tid, även om lagras vid-20 ° c, effekten av peptiden kan minska.

Den huvudsakliga begränsningen av detta protokoll är att den endast är lämplig för odlade celler eftersom de måste vara sensorik att uttrycka den önskade taggade UBL. Därför, alla studier på vävnader eller tumör prover måste utföras med hjälp av alternativa metoder såsom diGly peptider enrichments efter trypsin nedbrytning¹¹, immunoprecipitation med antikroppar som är specifika för UB/UBL av intresse⁵, eller användning av Rör⁶. Alla dessa alternativa metoder är också lämpliga för deras tillämpning i odlade celler. De har fördelen av att använda endogena UB/Ubls maskiner. Det finns dock flera nackdelar. Immunoprecipitations är svåra att utföra med en låg bakgrund och, som rör metoder, proteiner som interagerar med modifierade proteiner, och även modifieraren själv, kan inte elimineras, även om praktiska förbättringar har erhållits med hjälp av strängare villkor. DiGly peptider berikande är en mycket kraftfull Technic men kan motsvara olika typer av PTMs. Till exempel, digly berikning från en trypsin smält lysate kommer att identifiera främst och proteiner men också neddylated sådana, som Nedd8 lämnar samma kvarblivande digly signatur som ubiquitin gör¹¹.

En annan begränsning av detta protokoll är att förekomsten av den 6His-flagg tagg kan förändra den normala funktionen av UB/UBL och överuttryck i sig kan förändra maskinen. Detta kan till exempel hindra generering av polyubiquitin kedjor och gynna monoubiquitination. Men eftersom både mono multi och polyubiquitin kedjor har identifierats med hjälp av detta protokoll, verkar det som om det inte är fallet⁷. Närvaron av taggen vid N-Terminus förhindrar också bildandet av linjär ubiquitination, där ubiquitin beståndsdelarna är sammankopplade via N-terminalen metionin av ubiquitin. Men även om 6hf-udiquitin inte kan och på sin första met rester, har det fortfarande möjlighet att avsluta denna typ av kedja.

Även om det är en betydande fördel att använda lentivirus som möjliggör skapandet av stabila celler linjer i en eller två veckor, är det möjligt att inte alla celler skulle uttrycka den önskade konstruktionen. Detta kan inte vara ett verkligt problem för renings förfarandet så länge tillräckligt med celler uttrycker exogena UB/UBL, men problemet kan komma med långsiktig kultur som över flera passager det kan finnas en klon variation med berikning i celler med mindre eller ingen Uttryck. Denna nackdel, dock, kan lätt kringgås genom att använda lentivirus som innehåller antingen en resistens val gen eller ett fluorescerande protein som kan användas i flödescytometri att välja endast positiva celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag