Summary
Her beskriver vi en ny metode til påvisning af vellykket etablering af fælles blodcirkulation af to parabionter gennem en caudal vene injektion af glukose, som forårsager minimal skade og er ikke dødelig for parabionts.
Abstract
Parabiosis er en eksperimentel metode til kirurgisk kombinere to parallelle dyr langs den langsgående akse af kroppen. Vi præsenterer en protokol for påvisning af en vellykket etablering af blodkimerisme i parabionter ved en caudal vene injektion af glukose. Parabiotiske mus blev bygget. Glucose blev injiceret i donormusen gennem halevenen, og udsvingene i blodsukkerniveauet blev målt i begge mus ved hjælp af en blodglucometer på forskellige tidspunkter. Vores resultater viste, at efter glukoseinjektion steg blodsukkerniveauet i donormus kraftigt efter 1 min og faldt langsomt derefter. I mellemtiden toppede blodsukkerniveauet for recipientmusene 15 min efter injektion. Lignende resultater blev opnået med Evans blå, anvendes som en positiv kontrol for glukose. Den synkrone udsving i blodsukkerniveauet indikerer, at blodgennemstrømningen mellem de to mus blev etableret med succes.
Introduction
Parabiosis er en modelmetode, hvor to levende organismer samles kirurgisk og udvikles som et enkelt fysiologisk system med et fælleskredsløbssystem 1. Sådanne modeller har været meget anvendt til at studere fysiologi på grund af den fordel, at de stoffer, der produceres af en enkelt person, kan handle på begge dyr på samme tid via det fælles kredsløbssystem. Siden midten af 1800-tallet, hvor parabiotiske eksperimenter blev banebrydende af Paul Bert2, metoderne til at konstruere parabiotiske modeller er blevet standardiseret. Men en enkel og bekvem metode til at kontrollere en vellykket etablering af blodkimerisme har manglet. Det er blevet rapporteret, at cross-cirkulation kan med held vurderes ved intraperitonealt indsprøjtning 0,5% Evans blå farvestof i en af de parabionts efterfulgt af måling af absorbans af Evans blå i blodet af begge parabionter med en mikroplade læser3. En anden metode kræver en specifik muserace, der indeholder CD45.1+- og CD45.2+-mærket monocytter i hver parabiont. Cellecytometri anvendes derefter til at bestemme blodkimerisme ved at måle hyppigheden af de to markører i monocytter fra milt eller blod4. Men disse metoder er ofte dødelige eller besværlige for dyrene, og en sikker og enkel metode til hurtig og pålidelig kontrol af parabiotiske modeller er meget ønskeligt. I denne undersøgelse etablerede vi en ny metode til dette formål, som blev valideret i en musemodel af parabiosis. Glukosekoncentrationen i blodprøver, der er udtaget fra en halevene, måles ved hjælp af en glucometer, og mønsteret af ændringer i glukoseniveauet hos donor- og recipientmus betragtes som en indikation af kimærisme i omløb. Vi kaldte denne metode for "glukoseudsvingsmetoden". Anvendelsen af denne valideringsmetode er ikke begrænset til mus, men kan udvides til forskellige patologiske modeller undtagen dem med alvorlig dysregulering af glukosemetabolismen. Proceduren er enkel, tidsbesparende og sikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr og deres pleje blev godkendt af Den Institutionelle Dyrepleje og Brug udvalg af Harbin Medical University.
BEMÆRK: De værktøjer og det udstyr , der kræves til metoden, er opført i materialetabellen.
1. Fremstilling af materialer og dyr
- Bestil C57BL/6 hanmus med vægt mellem 20 g-25 g fra en standard leverandør af laboratoriedyr.
- Hav musene i en cyklus på 12 h lys: 12 h mørke ved 24−26 °C med ad libitum adgang til vand og mad.
2. Parabiosis
- Bedøve musene ved intraperitoneal injektion af 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol ved en koncentration på 0,1 ml/10 g. Bekræft korrekt bedøvelse som angivet ved muskelafslapning, langsom og stabil vejrtrækning, tab af hudstimuleringsrefleks og forsvinden af hornhinderefleks.
- Påfør oftalmologiske salve med en Q-tip for at forhindre tørre øjne.
- Udfør parabiosiproceduren som tidligere beskrevet5.
- Læg musene i supine position. Barber den ene mus venstre side og højre side af den anden mus med ca. 1 cm over albuen til 1 cm under knæet med en elektrisk barbermaskine. Brug hårfjerncreme til helt at rydde pelsen på den barberede hud.
- Tør de barberede områder af med iodophor. Læg musene på en opvarmet pude dækket af en steril pude.
- Opret langsgående hud snit fra 0,5 cm over albuen til 0,5 cm under knæleddet ved hjælp af en par skarpe saks på hvert dyrs barberet side.
- Tag huden ud af den subkutane fascia forsigtigt efter snittet.
- Tilslut olecranon og knæ et parabiont med en 3-0 sutur.
- Sutur den barberede hud med en kontinuerlig 5-0 sutur.
- Injicer 0,5 ml 0,9% NaCl subkutant til hver mus for at forhindre dehydrering.
- Injicer tramadol (10 mg/25 g/dag) intramuskulært til hver mus for at lindre smerter.
3. Validering af kimærisme i omløb
- Glukoseudsvingsmetode
BEMÆRK: Kontroller den vellykkede konstruktion af cirkulationkimkende mellem parabionter ved hjælp af glukoseudsvingsmetoden (ingen faste) den tiende dag efter parabiosiskirurgi.- Bedøve parabionterne ved intraperitoneal injektion på 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol til hver mus med en koncentration på 0,1 ml/10 g.
- Fix donormus i en Venous visuel mus hale fiksator.
- Gnid caudal venerne i flanken af en af parabionthale med en vat i blød i 70−75% alkohol for at rense halen og spile blodkarrene.
- Hold en 1,0 ml sprøjte med glukose i højre hånd, og hold nålen parallelt med venen (mindre end 15°).
- Sæt nålen i en position ca. 2−4 cm fra halespidsen.
- Tilføres 100 μL glukose (1,2 g/kg) til donoren inden for 10 s.
BEMÆRK: Udtrykket donor refererer til parabiont, der modtager glukose injektion gennem halen vene. Modtageren er den anden parabiont, som ikke modtager glukose direkte. - Rengør tæerne med iodophor. Skær tæerne af donor og modtager mus med en saks og indsamle en dråbe blod på forskellige tidspunkter efter injektion af glukose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 50 min og 60 min). Fjern blodproppen ved hvert opsamlingstidspunkt for at undgå flere skader.
BEMÆRK: Mængden af indsamlet blod var 10-25 ul for en test, og 90-225 ul i alt. - Drypp blodet ind i midten af glucometer teststrimler for glukose niveau detektion.
- Brug Evan's blå Counterstain som en positiv kontrol3.
- Tilføres 200 μL på 0,5% Evan's blå Counterstain intraperitoneally i donormusen.
- 2 h senere, euthanize parabionts ved intraperitoneal injektion af 20 g/L 2,2-tribromoethanol til hver mus i en koncentration på 0,2 ml/10 g, og indsamle blod fra begge parabionter ved hjertepunktering.
- Blodprøverne centrifugeres ved 916 x g i 15 min.
- Saml serum fra supernatanten.
- Fortynd serum med 0,9% NaCl kl 1:50.
- Absorbering af de fortyndede serumprøver måles ved 620 nm med et spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I seks donormus steg blodsukkerniveauet kraftigt til 26,5 μmol/L (173% stigning) ved et gennemsnit på 1 min efter injektionen af 100 μL glukose (1,2 g/kg) gennem halevenen og faldt gradvist til 13,3 μmol/L ved 60 min. Hos recipientmus steg blodsukkeret langsomt efter injektion og nåede det første topniveau ved 15 min (47% stigning, 12,2 μmol/L). På grundlag af ovenstående resultater blev standarden for kimærisme i omløb sat som følger: 1) en kraftig stigning i blodsukkerniveauet (en stigning på mindst 100 % eller >20 μmol/l) i donormus inden for1 min efter glukoseinjektion og 2) en betydelig stigning i blodsukkerniveauet hos recipientmus 15 min efter injektion (en stigning på mindst 37 %).
Koncentrationen af Evans blå farvestof i serum af parabionter viste også en vellykket konstruktion af cirkulation kimærisme (figur 2). Vi aflivede parabionterne efter blodsukkermåling ved hjælp af 5 ml 2,2,2-tribromoethanol (20 g/L). De subkutane karulære kryds mellem parabionterne blev tydeligt observeret (figur 3).
Supplerende figur 1 viser, at donormusene havde en signifikant stigning i blodsukkerniveauet 1 minut efter glukoseinjektion, mens modtagermusenes blodsukkerniveau ikke var forhøjet, hvilket viste, at blodkimerisme i parabionter ikke var etableret med succes 1 dag efter parabiosiskirurgi. På samme måde var blodOD-niveauet hos recipientmus ikke så forhøjet som donormus (supplerende figur 2).
Based on the results from the glucose fluctuation method, we found that two pairs of parabionts did not establish blood chimerism 15 days after parabiosis surgery. Som vist i supplerende tabel 1havde de to recipientmus ikke et forhøjet blodsukkerniveau inden for 60 minutter efter glukoseinjektion i donormusene. Blodkoncentrationen af Evans blå i de to modtagere var heller ikke forhøjet (supplerende tabel 2), hvilket viste, at glukoseudsvingsmetoden var lige så følsom som Evans's blå metode.
For at vurdere virkningen af indsprøjtet glukose på insulinmetabolismen påviste vi desuden blodets insulinniveau 1 time og 3 timer efter injektion af 100 μL glukose (1,2 g/kg) hos mus (supplerende figur 3). Blodetinsulinniveauet blev bemærkelsesværdigt nedsat 1 time efter glukoseinjektion på grund af hurtigt øget glukose og kom sig til normale niveauer ved 3 timer. Disse resultater viste, at virkningerne af glukose, vi injiceres på insulinmetabolismen, kunne genoprettes.
Figur 1: Ændringer i blodsukkerniveauet hos parabionter efter injektion af glukose gennem caudalvenen. (A) Blodsukkerniveau af donormus. B) Blodsukkerniveau for recipientmus (n = 6). Dataene præsenteres som den gennemsnitlige ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. 0 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Koncentrationen af Evans blå i serumprøver af parabionter målt af en mikropladelæser. Dataene præsenteres som den gennemsnitlige ± SEM. ***p < 0,001 (n = 6). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Generation af subkutane vasoganglions i forbundet hud mellem parabionterne. Venstre: Repræsentativt billede af parabiosismus. Højre: Et repræsentativt billede af den subkutane vasoganglion mellem parabionterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Blodsukkerniveauet for parabionter blev testet 1 dag efter parabiosis kirurgi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 2: Koncentrationen af Evans blå målt ved mikropladelæser i parabionternes serum 1 dag efter parabiosisoperation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 3: Koncentrationen af insulin i musenes serum efter glukoseinjektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 0 min. | 5 min. | 15 min. | 20 min. | 40 min. | 60 min. | |
| Donor-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Modtager-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Donor-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Modtager-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Supplerende tabel 1: Blodsukkerniveau (μmol/L) hos parabionter 15 dage efter parabiosisoperation.
| Kontrol-1 | Donor-1 | Modtager-1 | Kontrol-2 | Donor-2 | Modtager-2 | |
| OD-værdi | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Supplerende tabel 2: Blodkoncentration af Evans blå (OD værdi) i parabionts 15 dage efter parabiosis kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiosis henviser til den kirurgiske teknik til at forbinde to levende dyr til at etablere et fælles vaskulære system ved forsøg betyder6,7,8. Fordelen ved denne model er, at de stoffer, der produceres af en enkelt person, kan handle på begge dyr på samme tid. Således kan parabiosis model bruges til at udforske den rolle, et stof eller en faktor i en beslægtet sygdom, der producerer mange meningsfulde og innovative konklusioner. I betragtning af den store anvendelsesværdi har modellen medført en bedre forståelse af hjerte-kar-sygdomme8,9,10,11,12,13, nervesystemet lidelser14,15, organtransplantation16, og diabetes17,18.
Kontrol af en vellykket etablering af kimærisme i omløb er imidlertid det første og afgørende trin for undersøgelser med parabiosis. Nuværende undersøgelser har rapporteret nogle metoder til påvisning af kimærisme i omløb. Loffredo et al.4 rapporterede, at blodkimerisme blev bekræftet i parabiotiske par ved at måle den blandede frekvens af monocytter i milten med forskellige mærkede markører i donoren (CD45.1+ )og recipient (CD45.2+) mus. I denne metode blev specifikke mus med CD45.1+- eller CD45.2+-mærket monocytter for hver parabiont brugt til parabiosis. Cellecytometri var nødvendig for at bestemme blodkimerisme ved at måle integrationen af de markerede blodlegemer. Desuden vurderede Marta et al.3 krydscirkulationen ved intraperitonealt indsprøjtning af 200 μL på 0,5% Evans blå farvestof i en af parabionterne. Blod fra begge parabionter blev indsamlet 2 timer senere ved hjertepunktering. Blodkimerisme blev bestemt af en øget Evans blå koncentration i modtageren mus, som blev testet af en mikroplade læser. Selv om disse strategier giver os mulighed for at bestemme blodkimerisme, er der stadig mange begrænsninger, der ikke kan ignoreres. For det første, for dødelige metoder, blodkimerisme kan kun bekræftes ved udførelsen. Men i vores metode, etablering af blod kimærisme kan testes når som helst efter parabiosis kirurgi. Parabionts med mislykket etableret cirkulation kimærisme kan udelukkes til yderligere undersøgelse på forhånd for at reducere unødvendig arbejdsbyrde. Faktisk ved hjælp af vores glukose udsving metode, vi var i stand til at udvælge mus med mislykket konstruktion af blodkimerisme i visse parabionts, som kan skyldes utilstrækkelig tid af parabiosis, ustabil kirurgi manipulation, forsinket sårheling, eller afbrudt kropsvæv forårsaget af dyr kæmper. Under sådanne omstændigheder blev svigt af blodkimerisme også bekræftet ved hjælp af Evans blå metode. Disse resultater viser, at glukoseudsvingsmetoden var lige så effektiv som evans-metoden(supplerende figur 1 og supplerende figur 2, supplerende tabel 1 og supplerende tabel 2). For det andet er de aktuelt anvendte valideringsmetoder alt for tidskrævende og vanskelige i modsætning til denne nye metode, som er enkel og effektiv.
I denne undersøgelse, Vi med succes testet for cirkulation kimærisme i parabiotiske mus ved glukose udsving metode. Musene blev anæstesiiseret til glukoseinjektion og blodsukkerniveau målinger, hvilket gjorde deres manipulation lettere. Vi injicerede 100 μL glukose (1,2 g/kg) gennem musenes halevene inden for 10 s. Under disse betingelser blev der observeret regelmæssige udsving i blodsukkerniveauet hos donor- og recipientmus. Vigtigere, mængden af glukose, vi brugte tendens til at stabilt hæve blodsukkerniveauet inden for et bestemt interval. Desuden viste resultaterne, at blodets insulinniveau, der blev genvundet til normalområdet 3 timer efter glukoseinjektion (supplerende figur 3), hvilket tyder på, at den mængde glukose, der injiceres i musene, havde minimale virkninger på insulinmetabolismen. Desuden var den dosis af glukose, vi gav donoren, lavere end den, der blev anvendt til glukosetolerancetesten af mus (for GTT, 2 g/kg glukose, intraperitonealt injiceres til musene, svarende til ca. 1,6 g/kg gennem caudalveneinjektion19,20,21), hvilket betyder, at doseringen af glukose for glukoseudsvingsmetoden ikke ville forårsage hyperglykæmi og andre skadelige ændringer. Afslutningsvis er den metode, vi brugte, effektiv, harmløs og tidsbesparende. Men, Det kan være begrænset til diabetisk mus i parabiosis, som stadig har brug for yderligere eksperimenter for bekræftelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Nature Science Foundation of China (81570399 og 81773735), National Key Research and Development Program of China - Traditional Chinese Medicine Modernization Research project (2017YFC1702003), og Hei Long Jiang Fremragende Ungdomsvidenskabfond (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
