Summary
ここでは、グルコースの尾静脈注射を通じて2つのパラバイオリンの共有血液循環の確立を成功させたことを検出する新しい方法について説明します。
Abstract
パラビオシスは、身体の縦軸に沿って2つの平行動物を外科的に結合するための実験的方法である。我々は、グルコースの尾静脈注射によってパラバイオントにおける血液キメラリズムの確立を成功させるためのプロトコルを提示する。パラバイオティクスマウスを構築した。グルコースは、尾静脈を介してドナーマウスに注入され、そして、血糖量の変動を異なる時点で血液グルコメーターを用いて両マウスで測定した。我々の結果は、グルコース注射後、ドナーマウスの血糖値が1分後に急激に増加し、その後ゆっくりと減少することを示した。一方、レシピエントマウスの血糖値は、注射後15分にピークを迎えた。同様の結果は、グルコースの陽性対照として使用されるエバンスブルーで得られた。血糖レベルの同期変動は、2つのマウス間の血流が正常に確立されたことを示す。
Introduction
パラビオシスは、2つの生物が外科的に結合し、共有循環系1を有する単一の生理システムとして発達するモデリング方法である。このようなモデルは、単一の個人によって産生される物質が共有循環系を介して両方の動物に同時に作用できるという利点のために生理学を研究するために広く使用されている。1800年代半ば以来、パラバイオティクス実験がPaul Bert2によって開拓された、パラバイオティクスモデルを構築するための方法が標準化されています。しかし、血液キメラリズムの確立が成功したことを確認するための簡単で便利な方法は欠けています。クロス循環は、腹腔内注射で0.5%のエバンスブルー染料を1つのパラバイオエントに注入し、続いてマイクロプレートリーダーを用いた両方のパラバイオレントの血液中のエバンスブルーの吸光度の測定によって正常に評価できることが報告されている。別の方法は、各パラバイオレントにCD45.1+ -とCD45.2+- 標識単球を含む特定のマウス品種を必要とします。細胞サイトメトリーは、次に脾臓または血液4から単球中の2つのマーカーの頻度を測定することによって血液キメラリズムを決定するために使用される。しかし、これらの方法は、動物に対して致死的または面倒であることが多く、かつ、パラバイオティクスモデルの迅速かつ確実な検証のための安全で簡単な方法が非常に望ましい。本研究では、パラビオシスのマウスモデルで検証された新しい方法を確立しました。尾静脈から採取した血液サンプル中のグルコース濃度はグルコメーターを用いて測定され、ドナーマウスとレシピエントマウスにおけるグルコースレベルの変化のパターンは循環キメラリズムの指標と考えられる。この方法を「グルコース変動法」と名付けた。この検証方法の適用は、マウスに限らず、グルコース代謝の深刻な調節不変を有するものを除いて、多様な病理学的モデルに拡張することができる。手順は簡単で、時間を節約し、安全です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物とそのケアに関するすべての手順は、ハルビン医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました.
注: この方法に必要な工具および装置は、材料表にリストされています。
1. 素材・動物の製造
- 標準的な実験動物の供給業者からの20 g-25 g間の重量のC57BL/6雄のマウスを注文する。
- マウスを12時間の光のサイクルに収容する:水と食物へのアドリビタムアクセスで24-26°Cで12時間の暗闇。
2. パラビオシス
- 0.1 mL/10 gの濃度で20g/L 2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射によってマウスを麻酔する。筋肉弛緩、ゆっくりと安定した呼吸、皮膚刺激反射の喪失、角膜反射の消失によって示される適切な麻酔法を確認する。
- 眼の軟膏をQチップで塗布し、目が乾くのを防ぎます。
- 前述の5に従ってパラビオシス手順を実行します。
- マウスを上向きの位置に置きます。片方のマウスの左側ともう一方のマウスの右側を肘の上約1cmから膝より1cm下に電気かけで剃ります。脱毛クリームを使用して、剃った皮膚の毛皮を完全にクリアします。
- ヨードファーでかき部分を拭きます。無菌パッドで覆われた加熱パッドの上にマウスを置きます。
- 肘の上0.5cmから膝関節の下0.5cmまで、各動物の剃った側に鋭いはさみを使用して縦皮切開を作成します。
- 切開後に皮下筋膜から皮膚をそっと取り外す。
- 3-0縫合糸でパラバイオレントのオレクラノンと膝を接続します。
- 連続5-0縫合糸で剃った皮を縫合する。
- 脱水を防ぐために、各マウスに0.9%NaClを皮下に0.5mL注入します。
- 痛みを和らげるために、各マウスにトラマドール(10mg /25 g/日)を筋肉内に注入する。
3. 循環キメラリズムの検証
- グルコース変動方法
注:パラバイオシス手術後10日目にグルコース変動法(断食なし)を用いて、パラバイオント間の循環キメラリズムの構築が成功したことを確認します。- 20g/L2,2,2-トリブロモエタノールを濃度0.1mL/10gで各マウスに腹腔内注射することにより、パラバイオントを麻酔する。
- ドナーマウスを静脈ビジュアルマウス尾フィクサーで固定します。
- 70〜75%のアルコールに浸した綿のボールで、パラバイオントの尾の脇腹に尾静脈をこすり、尾をきれいにし、血管を拡張します。
- 右手にブドウ糖を含む1.0 mLの注射器を持ち、針を静脈に平行に保ちます(15°未満)。
- 尾端から約2~4cmの位置に針を挿入します。
- 100 μLのグルコース(1.2g/kg)を10秒以内にドナーに注入します。
注:ドナーという用語は、尾静脈を介してグルコース注射を受けるパラバイオレントを指す。レシピエントは他のパラバイオレントで、グルコースを直接受け取りません。 - ヨードファーでつま先をきれいにします。ドナーマウスとレシピエントマウスのつま先をハサミで切り取り、グルコースの注射後に異なる時点(1分、5分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分)で血液の滴を採取する。より多くの損傷を避けるために、各収集時点で血栓を取り除く。
注:採取された血液の量は、1回の検査で10〜25ul、合計で90〜225ulであった。 - グルコースレベル検出のためのグルコメーターテストストリップの中心に血液を滴下.
- エバンの青いカウンターステインをポジティブコントロールとして使う3.
- 0.5%のエヴァンの青いカウンターステインを腹腔内の200 μLをドナーマウスに注入します。
- 2時間後、20g/L2,2-トリブロモエタノールを各マウスに0.2mL/10gの濃度で腹腔内注射してパラバイオイントを安楽死させ、心臓穿刺により両方のパラバイオレントから血液を採取する。
- 血液サンプルを916 x gで15分間遠心分離する。
- 上清から血清を集める。
- 血清を0.9%NaClで1:50に希釈します。
- 分光光度計で620nmで希釈した血清サンプルの吸光度を測定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ドナーマウス6匹では、血糖濃度が100μLのブドウ糖(1.2g/kg)を尾静脈に注射した後、平均1分で26.5μmol/L(173%増加)に急上昇し、60分で13.3μmol/Lに徐々に低下した。レシピエントマウスでは、注射後に血糖値がゆっくりと上昇し、15分で最初のピークレベルに達した(47%増加、12.2μmol/L)。上記の結果に基づいて、循環キメラ症の標準は次のように設定した:1)グルコース注入後1分以内のドナーマウスにおける血糖値の急激な上昇(最低100%増加または20μmol/L)、及び2)注射後15分のレシピエントマウスにおける血糖値の有意な増加(最小37%増加)(図1)。
また、パラバイオントの血清中のエバンス青色素の濃度は、循環キメラリズムの構築に成功したことを示した(図2)。血中グルコース測定後のパラビオを安楽死させたのは、2,2,2-トリブロモエタノール(20g/L)の5mLを用いた。パラバイオント間の皮下血管接合部が明らかに観察された(図3)。
補足図1は、ドナーマウスがグルコース注入後1分で有意な血糖値上昇を示し、レシピエントマウスの血糖値が上昇しなかった一方で、パラバイオシス手術の1日後にパラバイオントの循環キメラリズムが正常に確立されないことを示した。同様に、レシピエントマウスにおける血中ODレベルはドナーマウスのそれと同様に上昇しなかった(補足図2)。
グルコース変動法の結果に基づいて、パラバイオシス手術の15日後に2組のパラバイオインが血液キメラリズムを確立しなかったことがわかりました。補足表1に示すように、2匹のレシピエントマウスは、ドナーマウスへのグルコース注入後60分以内に血糖値が上昇しなかった。2人のレシピエントにおけるエバンスブルーの血中濃度も上昇しなかった(補足表2)、グルコース変動法がエバンスブルー法と同様に敏感であることを実証した。
また、インスリン代謝に対する注入されたグルコースの影響を評価するために、マウスで100μLのグルコース(1.2g/kg)を注射した後、血中インスリンレベル1hと3時間を検出した(補正図3)。グルコースを急速に増加させて3時間で正常なレベルに回復したため、グルコース注入後1時間の血中インスリンレベルが著しく低下した。これらの結果から、インスリン代謝に対するグルコース注入の効果は、修復可能であることが示された。
図1:尾静脈を介したグルコースの注射後のパラバイオントにおける血糖値の変化。(A) ドナーマウスの血糖値(B) レシピエントマウスの血糖値(n=6)。データは平均 ±SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 0 分として表示されます。
図2:マイクロプレートリーダーで測定したパラバイオントの血清サンプル中のエバンスブルーの濃度。データは平均 ± SEM として表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:パラバイオント間の連結皮膚における皮下血管異性節の発生左:パラビオシスマウスの代表的な画像。右:パラバイオント間の皮下血管ガングリオンの代表的な画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1:パラバイオイントの血糖値は、パラバイオシス手術の1日後に試験した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 2:パラバイオシス手術の1日後にパラバイオントの血清中のマイクロプレートリーダーによって測定されたエバンスブルーの濃度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 3:グルコース注射後のマウスの血清中のインスリンの濃度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 0分 | 5分 | 15分 | 20分 | 40分 | 60分 | |
| ドナー-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| 受信者-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| ドナー-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| 受信者-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
補足表 1:パラバイオシス手術後15日目のパラバイオントにおける血糖値(μmol/L)。
| コントロール-1 | ドナー-1 | 受信者-1 | コントロール-2 | ドナー-2 | 受信者-2 | |
| OD 値 | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
補足表 2:パラバイオシス手術後15日目のパラバイオントにおけるエバンスブルー(OD値)の血中濃度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
パラバイオシスは、実験手段6、7、8によって共通の血管系を確立するために2匹の生きている動物を接続する外科的技術を指す。このモデルの利点は、単一の個人によって生成された物質が同時に両方の動物に作用することができるということです。したがって、パラビオシスモデルは、関連疾患における物質または因子の役割を探求するために使用することができ、多くの有意義で革新的な結論を生み出す。その大きな適用価値の観点から、モデルは、心血管系疾患8、9、10、11、12、13、神経系障害14、15、臓器移植16、および糖尿病17、18のより良い理解をもたらしている。
しかし、循環キメラリズムの確立が成功したの検証は、パラバイオシスを用いた研究の最初の決定ステップである。現在の研究では、循環キメラリズムを検出するためのいくつかの方法が報告されています。Loffredo et al.4は、ドナー内の異なる標識マーカーを有する脾臓中の単球の混合頻度を測定することによってパラバイオティクス対で血中キメラリズムが確認されたことを報告した(CD45.1+)マウス( CD45.1)マウス。この方法では、各パラバイオレントに対してCD45.1+またはCD45.2+-標識単球を有する特異的マウスをパラバイオシスに使用した。細胞サイトメトリーは、マークされた血液細胞の統合を測定することによって血液キメラリズムを決定するために必要であった。さらに、マルタら3は、パラバイオントの1つに200μLの0.5%エバンスブルー染料を腹腔内注入することによって交差循環を評価した。両方の副生物由来の血液は、心臓穿刺によって2時間後に採取された。血液キメライズムは、マイクロプレートリーダーによって試験されたレシピエントマウスにおけるエバンス青色濃度の増加によって決定された。これらの戦略は、私たちは血液キメラリズムを決定することができますが、無視できない多くの制限がまだあります。まず、致死的な方法については、血液キメラリズムは実行時にのみ確認できる。しかし、我々の方法では、血液キメラリズムの確立は、パラバイオシス手術後いつでもテストすることができる。確立された循環キメラリズムが失敗したパラバイオントは、不必要な作業負荷を減らすために事前にさらなる研究のために除外することができる。実際、私たちのグルコース変動法を使用して、パラバイオシスの不十分な時間、不安定な手術操作、遅れた創傷治癒、または動物の苦労によって引き起こされる切断された体組織による可能性がある特定のパラバイオリン酸における血液キメラリズムの構築に失敗したマウスを選ぶことができました。このような状況では、血液キメラリズムの失敗もエバンスブルー法を用いて確認された。これらの結果は、グルコース変動法がエバンスブルー法と同じくらい有効であることを示している(補足図1及び補足図2、補足表1及び補足表2)。第二に、現在使用されている検証方法は、この新しい方法とは対照的に、時間がかかり、困難です。
本研究では、グルコース変動法によるパラバイオティクスマウスの循環キメラリズムの試験に成功しました。マウスはグルコース注射と血糖値測定のために麻酔を受け、操作が容易になった。マウスの尾静脈を通して100μL(1.2g/kg)を10秒以内に注入した。これらの条件下では、ドナーマウスおよびレシピエントマウスにおける血糖値の規則的な変動が認められた。重要なことに、我々が使用したグルコースの量は、一定の範囲内で安定して血糖値を上昇させる傾向があった。また、グルコース注入後3時間の正常範囲まで血中インスリンレベルが回復したことを示した(補足図3)、マウスに注入されたグルコース量は、インスリン代謝に対する影響が最小限であることを示唆した。また、ドナーに与えたグルコースの投与量は、マウスのグルコース耐性試験に使用されたものよりも低かった(GTTの場合、2g/kgグルコースはマウスに腹腔内注射され、尾静脈注射19、20、21を通じて約1.6g/kgに等しい)、グルコース変動法のグルコース投与量が高血糖および他の損傷を引き起こさないことを意味する。結論として、私たちが使用した方法は効果的で無害で、時間を節約します。しかし、パラバイオシスの糖尿病マウスに限定される可能性があり、確認のためにさらなる実験が必要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81570399および81773735)、中国の国家主要研究開発プログラム-伝統的な中国医学近代化研究プロジェクト(2017YFC1702003)、および平龍江によって支援されました優れた青少年科学基金(JC2017020)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
