Biology

מזהה הקמת אספקת דם משותף בעכברים Parabiotic על ידי הזרקת הסוכר קאודל וריד

Published: February 6, 2020 doi: 10.3791/60411

Xin Liu¹, Xue Bai¹, Mingqi Li¹, Huimin Li¹, Yong Zhang^1,2, Baofeng Yang^1,3

¹Department of Pharmacology, The State-Province Key Laboratories of Biomedicine-Pharmaceutics of China, Key Laboratory of Cardiovascular Research, Ministry of Education, College of Pharmacy, Harbin Medical University, ²Institute of Metabolic Disease, Heilongjiang Academy of Medical Science, ³Department of Pharmacology and Therapeutics, Melbourne School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences University of Melbourne

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חדשה של זיהוי הקמת מוצלח של זרימת דם משותפת של שני parabits באמצעות הזרקת וריד caudal של גלוקוז, הגורם נזק מינימלי והוא לא קטלני לתוך parabionts.

Abstract

Parabiosis היא שיטה ניסיונית לשילוב בניתוח שתי בעלי חיים מקבילים לאורך ציר האורך של הגוף. אנו מציגים פרוטוקול לגילוי הקמתה המוצלחת של כימריזם דם בפראביטס על ידי הזרקת וריד caudal של גלוקוז. . עכברים מיוטיים נבנו גלוקוז הוזרק לתוך העכבר התורם דרך הווריד הזנב, ותנודות של רמת הגלוקוז בדם נמדד בשני העכברים באמצעות גלומוטר דם בנקודות זמן שונות. התוצאות שלנו הראו כי לאחר הזרקת גלוקוז, רמת הגלוקוז בדם בעכברים תורמים גדל בחדות אחרי 1 דקות ירד לאט לאחר מכן. בינתיים, רמת הגלוקוז בדם של עכברים הנמען לשיאה 15 דקות לאחר ההזרקה. תוצאות דומות הושגו עם אוונס כחול, משמש שליטה חיובית עבור גלוקוז. התנודות הסינכרוניות של רמות הגלוקוז בדם מעידות על כך שזרימת הדם בין שני העכברים הוקמה בהצלחה.

Introduction

Parabiosis היא שיטת דוגמנות שבה שני אורגניזמים חיים מחוברים יחד בניתוח ולהתפתח כמערכת פיזיולוגית אחת עם מערכת משותפת מחזור הדם¹. דגמים כאלה שימשו באופן נרחב לחקר הפיזיולוגיה בשל היתרון כי החומרים המיוצרים על ידי אדם אחד יכולים לפעול על שתי בעלי חיים באותו זמן דרך מערכת הדם המשותפת. מאז אמצע 1800, כאשר הניסויים parabiotic היו חלוץ על ידי פול ברט², השיטות לבניית מודלים parabiotic הפכו סטנדרטיים. עם זאת, שיטה פשוטה ונוחה לאימות הקמתה המוצלחת של כימריזם דם חסר. נמסר כי מחזור הזרימה ניתן להעריך בהצלחה על ידי intraperitoneally הזרקת 0.5% הצבע הכחול אוונס באחד הפראביבטים ואחריו מדידה של בספיגת כחול אוונס בדם של שני הפראביב עם קורא מיקרולוח³. שיטה נוספת מחייבת גזע עכבר מסוים המכיל CD 45.1⁺-ו-cd 45.2⁺-מונוציטים עם התווית בכל מבנה. Cy, תא הציטונסה משמש לאחר מכן כדי לקבוע כמינות דם על ידי מדידת תדירות של שני סמנים ב מונוציטים מן הטחול או הדם⁴. עם זאת, שיטות אלה הן לעתים קרובות קטלני או מסורבל לבעלי חיים, ושיטה בטוחה ופשוטה לאימות מהיר ואמין של מודלים parabiotic הוא רצוי מאוד. במחקר זה, הקמנו שיטה חדשה למטרה זו, אשר אומתה במודל העכבר של parabiosis. הריכוז של גלוקוז בדגימות דם שנלקח מווריד הזנב נמדד באמצעות גלוקומיטר, והתבנית של שינויים ברמת הגלוקוז בעכברי התורם והנמען נחשבת אינדיקציה לצ המחזור. קראנו לשיטה זו את שיטת התנודות בגלוקוז. היישום של שיטת אימות זו אינו מוגבל לעכברים, אך ניתן להרחיב אותם למודלים פתולוגיים שונים, למעט אלה עם חוסר התקנה רציני של מטבוליזם הגלוקוז. ההליך הוא פשוט, הצלת זמן, ובטוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים והטיפול בהם אושרו על-ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים ובוועדת הרפואה של חרבין.

הערה: הכלים והציוד הנדרשים לשיטה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים ובעלי חיים

סדר C57BL/6 עכברים זכרים עם משקל בין 20 g-25 גרם מספק בעלי חיים סטנדרטיים המעבדה.
הבית העכברים במחזור של 12 h החושך: 12 h החשיכה ב -24 עד 26 ° צ' עם גישה בליבינום למים ומזון.

2. פרביוזיס

באמצעות הזרקה של 20 גרם/L 2, 2, 2-tribromoethanol בריכוז של 0.1 mL/10 g. לאשר הרגעה הולמת כפי שמצוין על ידי הרפיה שריר, נשימה איטית ויציבה, אובדן רפלקס העור, היעלמות רפלקס הקרנית.
החלת משחה אופטלמולוגית עם טיפ-עצה כדי למנוע עיניים יבשות.
בצע את ההליך parabiosis כפי שמתואר בעבר⁵.
1. מניחים את העכברים במצב פרקדן. לגלח ביסודיות את הצד השמאלי של עכבר אחד בצד ימין של העכבר השני החל כ 1 ס מ מעל המרפק ל 1 ס מ מתחת לברך עם מכונת גילוח חשמלית. השתמש קרם דפילציה כדי לנקות לחלוטין את הפרווה על העור מגולח.
2. לנגב את האזורים המגולחים. עם שפתי-האור מניחים את העכברים על משטח מחומם מכוסה על ידי כרית סטרילי.
3. צור חתכים בעור האורך החל מ 0.5 ס מ מעל המרפק כדי 0.5 ס מ מתחת למפרק הברך באמצעות זוג מספריים חדים על הצד המגולח של כל חיה.
4. לנתק את העור מfascia תת עורית בעדינות לאחר החיתוך.
5. לחבר את האוקרגון והברך של parabiont עם תפר 3-0.
6. תפר את העור מגולח עם תפר מתמשך 5-0.
הכנס 0.5 mL של 0.9% התת-עורי אל כל עכבר כדי למנוע התייבשות.
הכנס טרמדול (10 מ"ג/25 גרם/יום) הפנימי מוברג לכל עכבר כדי להקל על הכאב.

3. ואלידציה של כימנות מחזור

שיטת התנודה בגלוקוז
הערה: לוודא את הבנייה המוצלחת של הצ מחזור בין parabionts בשיטת תנודות הגלוקוז (אין צום) ביום העשירי לאחר ניתוח parabionts.
1. באמצעות הזרקת הצפק של 20 גרם/L 2, 2, 2-טריברואואתנול לכל עכבר בריכוז של 0.1 mL/10 גרם.
2. לתקן את עכברי התורמים בתוך. תיקון זנב של עכבר חזותי ורידי
3. שפשף את הורידים הקאואל באגף של אחד מזנבו של הפראבונט עם כדור צמר גפן שנספג ב 70-75% אלכוהול כדי לנקות את הזנב ולהתרחב בכלי הדם.
4. החזק מזרק 1.0 mL המכיל גלוקוז ביד ימין ולשמור את המחט במקביל הווריד (פחות מ 15 °).
5. הכניסו את המחט לתנוחה כ-2-4 ס מ מקצה הזנב.
6. הכנס 100 μL של גלוקוז (1.2 g/ק"ג) לתוך התורם בתוך 10 s.
  הערה: המונח תורם מתייחס לפרביונט המקבל את הזרקת הגלוקוז דרך העורק האחורי. המטופל הוא הפרבימונט השני, שאינו מקבל גלוקוז ישירות.
7. נקה את הבהונות. עם שפתי-האור לחתוך את הבהונות של עכברים התורם והנמען עם מספריים ולאסוף טיפת דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה של גלוקוז (1 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 30 דקות, 40 דקות, 50 דקות, ו 60 דקות). הסר את קריש הדם בכל נקודת זמן איסוף כדי למנוע נזק נוסף.
  הערה: הנפח של דם שנאסף היה 10-25 ul עבור בדיקה אחת, ו 90-225 ul בסך הכל.
8. לטפטף את הדם לתוך מרכז מבחני גלוקומיטר עבור זיהוי רמת גלוקוז.
תשתמש בכתם הכחול של. אוון כשליטה חיובית³
1. הכנס 200 μL של 0.5% כחול הנוגדן של אוון intraperitoneally לתוך העכבר התורם.
2. 2 h מאוחר יותר, המתת החסד על ידי הזרקה התוך הצפק של 20 גרם/L 2, 2, 2-tribromoethanol לכל עכבר בריכוז של 0.2 mL/10 גרם, ולאסוף דם משני parabits על ידי ניקוב לב.
3. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 916 x עבור 15 דקות.
4. . אספו נסיוב מהסופרנטאנט
5. דלל את הנסיוב עם 0.9% הנאגל בשעה 1:50.
6. למדוד את ספיגת דגימות סרום מדולל ב 620 ננומטר עם ספקטרוסקופיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ב שישה עכברים תורמים, רמות הגלוקוז בדם עלה בחדות כדי 26.5 μm/L (173% עלייה) בממוצע של 1 דקות לאחר ההזרקה של 100 μL של גלוקוז (1.2 g/ק"ג) דרך הווריד הזנב ולאחר מכן ירד בהדרגה ל 13.3 μm/L ב 60 דקות. בעכברי הנמען, הגלוקוז בדם עלה באיטיות לאחר ההזרקה והגיע לרמת השיא הראשונה ב -15 דקות (47% הגדלה, 12.2 μm/L). בהתבסס על התוצאות הנ ל, התקן של מחזור המחזור הוגדר כדלקמן: 1) עלייה חדה ברמת הגלוקוז בדם (מינימום 100% להגדיל או > 20 μm/L) בעכברים תורמים בתוך 1 דקות לאחר הזרקת גלוקוז, ו 2) עלייה משמעותית ברמת הגלוקוז בדם בעכברים הנמען 15 דקות לאחר ההזרקה (מינימום 37% עלייה) (איור 1

הריכוז של הצבע הכחול אוונס בסרום של parabionts הצביע גם על בנייה מוצלחת של כימריזם המחזור (איור 2). הורמנו את הפראביטס לאחר מדידת הגלוקוז בדם באמצעות 5 מ ל 2, 2, 2-triרומטוזיס (20 g/L). הצמתים התת עורית בין הפראביטים נצפו בבירור (איור 3).

איור משלים 1 מראה כי העכברים התורמים היה רמת הגלוקוז משמעותי בדם להגדיל 1 דקות לאחר הזרקת גלוקוז, בעוד רמת הגלוקוז בדם של עכברי המטופל לא היה גבוה, אשר הוכיחה כי הצ של המחזור בפראביבטס לא הוקמה בהצלחה 1 יום לאחר ניתוח parabionts. באופן דומה, רמת ה-OD בדם בעכברי הנמען לא הייתה מוגבהת כמו זו של עכברים תורמים (איור משלים 2).

בהתבסס על התוצאות משיטת תנודות הגלוקוז, מצאנו ששני זוגות של פראביטים לא התבססו על כימנות דם 15 יום לאחר ניתוח הפראוזיס. כפי שמוצג בטבלה השלמה 1, שני עכברי הנמען לא הגדילו את רמת הגלוקוז בדם בתוך 60 דקות לאחר הזרקת הגלוקוז לתוך העכברים התורמים. ריכוז הדם של אוונס הכחול בשני הנמענים גם הוא לא גבוה (טבלה משלימה 2), אשר הוכיחה כי שיטת תנודות הגלוקוז היה רגיש כמו שיטת אוונס כחול.

יתר על כן, כדי להעריך את ההשפעה של גלוקוז מוזרק על מטבוליזם אינסולין, גילינו את רמת האינסולין בדם 1 h ו 3 h לאחר ההזרקה של 100 μL של גלוקוז (1.2 g/ק"ג) בעכברים (איור משלים 3). רמת האינסולין בדם הצטמצמה במידה ניכרת 1 h לאחר הזרקת גלוקוז בגלל במהירות הסוכר גדל והתאושש לרמות נורמלי ב 3 h. תוצאות אלה הראו כי ההשפעות של גלוקוז שהזריקו על מטבוליזם אינסולין היו ניתנים לשחזור.

איור 1: שינויים ברמת הגלוקוז בדם בפראביבטס לאחר הזרקה של גלוקוז דרך הווריד caudal. (א) רמת הגלוקוז בדם של עכברים תורמים. (ב) רמת הגלוקוז בדם של עכברים הנמען (n = 6). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 לעומת 0 דקות. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הריכוז של אוונס כחול בדגימות סרום של parabionts נמדד על ידי קורא מיקרופלייט. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. * * * p < 0.001 (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: יצירת מעטפת תת עורית בעור מחובר בין הפראביטים. שמאלה: דמות מייצגת של העכברים הפראביוזיס. מימין: דמות מייצגת של הצינור התת. התת עורי בין הפראביטים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 1
איור משלים 1: רמת הסוכר בדם של הפראביטים נבדקה יום אחד לאחר ניתוח הפראוזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 2
איור משלים 2: הריכוז של אוונס כחול נמדד על ידי קורא אימונולוגיה בסרום של הפראביטים 1 יום לאחר ניתוח parabionts. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 3
איור משלים 3: ריכוז האינסולין בסרום של העכברים לאחר הזרקת גלוקוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

	0 דקות	5 דקות	15 דקות	20 דקות	40 דקות	60 דקות
תורם -1	5.7	26.2	21.2	17.6	16.9	15.4
נמען -1	6.7	5.8	5.9	6.2	5.2	5.4
התורם -2	8.4	25.5	21.1	20.5	17.4	13.8
נמען -2	6.7	5.8	5.9	6.2	5.2	5.4

טבלה משלימה 1: רמת הגלוקוז בדם (μa/L) בפראביטס 15 ימים לאחר ניתוח הפרבולה.

	שליטה-1	תורם -1	נמען -1	שליטה-2	התורם -2	נמען -2
ערך OD	0.059	0.935	0.062	0.068	0.862	0.073

טבלה משלימה 2: ריכוז דם של אוונס כחול (ערך OD) בפראביטים 15 ימים לאחר ניתוח הפרבולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Parabiosis מתייחס לטכניקה כירורגית של חיבור שתי חיות חיים כדי להקים מערכת כלי דם משותף על ידי ניסיוני פירושו⁶^,⁷^,⁸. היתרון של מודל זה הוא כי החומרים המיוצרים על ידי אדם אחד יכול לפעול על שני בעלי חיים באותו זמן. לפיכך, ניתן להשתמש במודל הפרביוזיס כדי לחקור את התפקיד של חומר או גורם במחלה קשורה, תוך הפקת מסקנות משמעותיות וחדשניות רבות. לאור ערך היישום הגדול שלה, המודל הביא להבנה טובה יותר של מחלות לב וכלי דם⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, הפרעות מערכת העצבים¹⁴^,¹⁵, השתלת איברים¹⁶, סוכרת¹⁷^,¹⁸.

עם זאת, אימות של הקמתה המוצלחת של מחזור המחזור הוא הצעד הראשון והקובע ללימודים עם parabiosis. מחקרים נוכחיים דיווחו על כמה שיטות לגילוי כימריזם המחזור. לאחר ואח '⁴ דיווחו כי כאשר הצ דם אושרה בזוגות parabiotic על ידי מדידת התדר המעורב של מונוציטים בטחול עם סמנים שונים עם תוויות בתורם (cd 45.1⁺) והנמען (cd 45.2⁺) עכברים. בשיטה זו, עכברים ספציפיים עם CD 45.1⁺-או cd 45.2⁺-מונוולוציטים עבור כל parabiont שימשו עבור parabiosis. Cy, החוליה הייתה נחוצה כדי לקבוע כימנות דם על ידי מדידת שילוב של כדוריות הדם המסומנות. בנוסף, מרתה ואח '³ העריכו החוצה-מחזור על ידי intraperitoneally הזרקת 200 μl של 0.5% הצבע הכחול אוונס באחד הפראביבטים. דם משני הצדדים נאסף 2 שעות מאוחר יותר על ידי ניקוב לב. כימנות דם נקבע על ידי מוגבר הריכוז הכחול של אוונס בעכברי הנמען, אשר נבדק על ידי קורא מיקרופלייט. למרות שאסטרטגיות אלה מאפשרות לנו לקבוע כיוריזם דם, יש עדיין מגבלות רבות שלא ניתן להתעלם מהן. , ראשית, עבור שיטות קטלניות. ניתן לאשר את כימיית הדם רק בהוצאה להורג עם זאת, בשיטה שלנו, הקמת כימריזם דם ניתן לבחון בכל עת לאחר ניתוח parabiosis. Parabionts עם כושלים הוקמה מחזור המחזור יכול להיות מנשלל למחקר נוסף מראש כדי להפחית עומס עבודה מיותרת. אכן, באמצעות שיטת תנודות הגלוקוז שלנו היינו מסוגלים לבחור את העכברים עם בנייה מוצלחת של כימריזם דם בתוך parabionts מסוימים, אשר עשוי להיות בגלל זמן מספיק של פראביוזיס, ניתוח מניפולציה לא יציבה, ריפוי פצע מתעכב, או רקמת גוף מנותקת שנגרמו על ידי בעלי חיים נאבק. בנסיבות כאלה, גם הכישלון של כימריזם הדם אושר על ידי שימוש בשיטה הכחולה של אוונס. תוצאות אלו מצביעות על כך ששיטת התנודות בגלוקוז הייתה יעילה כמו השיטה הכחולה של אוונס (איור משלים1 ואיורמשלים 2, טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2). שנית, השיטות המשמשות כעת לאימות הן זמן רב מדי וקשות, בניגוד לשיטה חדשה זו, שהיא פשוטה ואפקטיבית.

במחקר הנוכחי, בחנו בהצלחה את הצ של המחזור בעכברים parabiotic על ידי שיטת תנודות הגלוקוז. העכברים היו מורדם עבור הזרקת גלוקוז ורמת הסוכר בדם מדידות, אשר עשה מניפולציה שלהם קל יותר. הזרקנו 100 μL של גלוקוז (1.2 g/ק"ג) דרך הווריד הזנב של העכברים בתוך 10 s. בתנאים אלה, הבחינו תנודות סדירות ברמות הגלוקוז בדם בעכברי התורם והנמען. חשוב מכך, כמות הגלוקוז שנהגנו נטו לרומם את רמת הגלוקוז בדם בטווח מסוים. יתר על כן, התוצאות הראו כי רמת אינסולין בדם התאושש לטווח הרגיל 3 שעות לאחר הזרקת גלוקוז (המשלים איור 3), הרומז כי כמות הגלוקוז מוזרק לתוך העכברים היו השפעות מינימליות על חילוף החומרים באינסולין. בנוסף, המינון של הגלוקוז שנתנו לתורם היה נמוך יותר מאשר משמש לבדיקת עמידות הגלוקוז של עכברים (עבור ה-gtt, 2 g/kg גלוקוז הוא intraperitoneally מוזרק לעכברים, משווה כ 1.6 g/ק"ג באמצעות הזרקת וריד caudal¹⁹^,²⁰^,²¹), כלומר המינון של גלוקוז עבור שיטת תנודות הגלוקוז לא יגרום היפררגליקמיה ושינויים מזיקים אחרים. לסיכום, השיטה בה השתמשנו היא יעילה, לא מזיקה וחוסכת זמן. עם זאת, זה יכול להיות מוגבל עכברים סוכרתית ב parabiosis, אשר עדיין צריך ניסויים נוספים לאישור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81570399 ו 81773735), תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין-מסורתי הרפואה הסינית מודרניזציה פרויקט מחקר (2017YFC1702003), ו היי לונג ג'יאנג הקרן המצטיין למדעי הנוער (JC2017020).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#