Summary
Здесь мы описываем новый метод выявления успешного установления общего кровообращения двух парабионтов через инъекцию caudal вен глюкозы, которая вызывает минимальный ущерб и не является фатальной для парабионтов.
Abstract
Парабиоз является экспериментальным методом хирургического объединения двух параллельных животных вдоль продольной оси тела. Мы представляем протокол для обнаружения успешного установления химеризма крови в парабионтах путем инъекции caudal вен глюкозы. Были построены парабиотические мыши. Глюкоза вводилась в донорскую мышь через хвостовую вену, и колебания уровня глюкозы в крови измерялись у обеих мышей с помощью глюкометра крови в разное время. Наши результаты показали, что после инъекции глюкозы уровень глюкозы в крови у мышей-доноров резко повысился после 1 мин и медленно снизился после этого. Между тем, уровень глюкозы в крови мышей-реципиентов достиг 15 мин после инъекции. Аналогичные результаты были получены с Эванс синий, используется в качестве положительного контроля для глюкозы. Синхронные колебания уровня глюкозы в крови свидетельствуют о том, что кровоток между двумя мышами был успешно установлен.
Introduction
Парабиоз является методом моделирования, в котором два живых организма соединяются хирургическим путем и развиваются как единая физиологическая система с общей системой кровообращения1. Такие модели широко используются для изучения физиологии, что объясняется тем преимуществом, что вещества, производимые одним человеком, могут действовать на обоих животных одновременно через общую систему кровообращения. С середины 1800-х годов, когда парабиотические эксперименты были впервые Пол Берт2, методы для построения парабиотических моделей стали стандартизированы. Однако простого и удобного метода проверки успешного создания кровного химеризма не хватает. Было сообщено, что перекрестный оборот может быть успешно оцененин интраперитонеально инъекционных 0,5% Эванс синий краситель в одном из парабионтов следуют измерения абсорбции Эванс синий в крови обоих парабионтов с микроплитой читателя3. Другой метод требует определенной породы мышей, которая содержит CD45.1-и CD45.2-помеченные моноциты в каждом парабионте. Клеточная цитометрия затем используется для определения химеризма крови путем измерения частоты двух маркеров в моноцитах из селезенки или крови4. Тем не менее, эти методы часто являются смертельными или громоздкими для животных, и безопасный и простой метод для быстрой и надежной проверки парабиотических моделей является весьма желательным. В этом исследовании мы создали новый метод для этой цели, который был проверен в мышиной модели парабиоза. Концентрация глюкозы в образцах крови, взятых из хвостовой вены, измеряется с помощью глюкометра, а модель изменений уровня глюкозы у мышей-доноров и реципиентов считается признаком циркуляции химеризма. Мы назвали этот метод «методом колебаний глюкозы». Применение этого метода проверки не ограничивается мышами, но может быть распространено на различные патологические модели, за исключением тех, с серьезнымдисрегрецией метаболизма глюкозы. Процедура проста, экономия времени и безопасна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с животными и их уходом, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Харбинского медицинского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты и оборудование, необходимые для метода,перечислены в таблице материалов.
1. Подготовка материалов и животных
- Закажите C57BL/6 мышей мужского пола весом от 20 г-25 г у стандартного поставщика лабораторных животных.
- Дом мышей в цикле 12 ч света: 12 ч темноты при 24'26 C с ad libitum доступ к воде и пище.
2. Парабиоз
- Анестезия мышей путем интраперитонеальной инъекции 20 г/л 2,2,2-трибромоэтанола в концентрации 0,1 мл/10 г. Подтвердите правильное обезболивание, о чем свидетельствует расслабление мышц, медленное и устойчивое дыхание, потеря рефлектора стимуляции кожи и исчезновение рефлектора роговицы.
- Нанесите офтальмологическую мазь с помощью наконечника, чтобы предотвратить сухость глаз.
- Выполните процедуру парабиоза, как ранее описано5.
- Поместите мышей в положение лежа. Тщательно побрить левую сторону одной мыши и правую сторону другой мыши, начиная примерно на 1 см выше локтя до 1 см ниже колена с электрической бритвой. Используйте крем для депилатория, чтобы полностью очистить мех на бритой коже.
- Протрите бритые участки с йодофоном. Поместите мышей на подогрев омытой подушечки, покрытую стерильной подушечкой.
- Создавайте продольные разрезы кожи, начиная с 0,5 см выше локтя до 0,5 см ниже коленного сустава, используя с помощью острых ножниц на бритой стороне каждого животного.
- Отсоедините кожу от подкожной фасции осторожно после разреза.
- Соедините олекранон и колено парабионта с 3-0 шов.
- Шов побрился на коже с непрерывным 5-0 швом.
- Вводят 0,5 мл 0,9% NaCl подкожно каждой мыши для предотвращения обезвоживания.
- Вводят трамадол (10 мг/25 г/день) к каждой мыши, чтобы облегчить боль.
3. Проверка циркуляции химеризма
- Метод колебаний глюкозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте успешное построение циркуляции химеризма между парабионтами с помощью метода колебаний глюкозы (без голодания) на 10-й день после операции на парабиозе.- Анестезия парабионтов путем интраперитонеальной инъекции 20 г/л 2,2,2-трибромоэтанола для каждой мыши в концентрации 0,1 мл/10 г.
- Исправить донора мышей в венозной визуально-мыши хвост фиксатор.
- Натрите хвостовые вены на фланге хвоста одного из парабионтов ватным тампоном, пропитанным 70–75% алкоголя, чтобы очистить хвост и раскидывать кровеносные сосуды.
- Держите 1,0 мл шприца, содержащего глюкозу в правой руке и держать иглу параллельно вены (менее 15 " ).
- Вставьте иглу в положении примерно 2'4 см от кончика хвоста.
- Впрыските донору 100 кл. глюкозы (1,2 г/кг) в течение 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Термин донор относится к парабионт, который получает инъекцию глюкозы через хвост вены. Получателем является другой парабионт, который не получает глюкозу напрямую. - Очистите носы с помощью йодофора. Отрежьте ножницами носовые части ног донора и реципиента и соберите каплю крови в разное время после инъекции глюкозы (1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин, 50 мин и 60 мин). Удалите сгусток крови в каждом моменте сбора времени, чтобы избежать большего ущерба.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем собранной крови составил 10-25 ул для одного теста, и 90-225 ул в общей сложности. - Капать кровь в центр глюкометра тест-полоски для обнаружения уровня глюкозы.
- Используйте синий counterstain Эвана в качестве положительного контроля3.
- Впрыските 200 л синего противозатоста Эвана в донорскую мышь.
- 2 ч спустя, эвтаназии парабионтов путем интраперитонеальной инъекции 20 г / l 2,2,2-трибромотанола для каждой мыши в концентрации 0,2 мл/10 г, и собирать кровь из обоих парабионтов путем пробива.
- Центрифуг и образцы крови на 916 х г в течение 15 мин.
- Соберите сыворотку от супернатанта.
- Разбавить сыворотку с 0,9% NaCl в 1:50.
- Измерьте абсорбцию разбавленных образцов сыворотки на уровне 620 нм с помощью спектрофотометра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
У шести мышей-доноров уровень глюкозы в крови резко повысился до 26,5 мкм/л (173% при увеличении) в среднем на 1 мин после инъекции 100 кЛ глюкозы (1,2 г/кг) через хвостовую вену, а затем постепенно снижался до 13,3 мкм/л при 60 мин. У мышей-реципиентов уровень глюкозы в крови медленно увеличивался после инъекции и достиг первого пикового уровня на уровне 15 мин (увеличение на 47%, 12,2 моль/л). На основе вышеуказанных результатов, стандарт для циркуляции химеризма был установлен следующим образом: 1) резкое увеличение уровня глюкозы в крови (минимум 100% увеличение или йgt;20 моль /L) у мышей-доноров в течение 1 мин после инъекции глюкозы, и 2) значительное увеличение уровня глюкозы в крови у мышей-реципиента 15 мин после инъекции (минимум 37% увеличение) (Рисунок 1 Рисунок ).
Концентрация синего красителя Эванса в сыворотке парабионов также свидетельствует об успешном построении циркуляционного химеризма(рисунок 2). Мы усыпили парабионты после измерения уровня глюкозы в крови с помощью 5 мл 2,2,2-трибромоэтанола (20 г/л). Подкожные сосудистые соединения между парабионтами были четко соблюдены(рисунок 3).
Дополнительная диаграмма 1 показывает, что у мышей-доноров было значительное повышение уровня глюкозы в крови на 1 минуту после инъекции глюкозы, в то время как уровень глюкозы в крови мышей-реципиентов не был повышен, что показало, что циркуляция химеризма в парабионатах не была успешно установлена через 1 день после операции по парабиозу. Аналогичным образом, уровень оПр крови у мышей-реципиентов не был столь же повышен, как у мышей-доноров(Дополнительная диаграмма 2).
Основываясь на результатах метода колебаний глюкозы, мы обнаружили, что две пары парабионтов не установили химеризм крови через 15 дней после операции по парабиозу. Как показано в дополнительной таблице 1, два мышей-реципиента не имели повышенного уровня глюкозы в крови в течение 60 минут после инъекции глюкозы в донорских мышей. Концентрация крови синий Эванс в двух получателей также не был повышен(Дополнительная таблица 2), который показал, что метод колебания глюкозы был столь же чувствительным, как синий метод Эванс.
Кроме того, чтобы оценить влияние инъекционной глюкозы на метаболизм инсулина, мы обнаружили уровень инсулина в крови 1 ч и 3 ч после инъекции 100 кЛ глюкозы (1,2 г/кг) у мышей(Дополнительная диаграмма 3). Уровень инсулина в крови был удивительно снижен 1 ч после инъекции глюкозы из-за быстрого повышения глюкозы и восстановился до нормального уровня в 3 ч. Эти результаты показали, что влияние глюкозы, которую мы вводили на метаболизм инсулина, было восстановительным.
Рисунок 1: Изменения уровня глюкозы в крови у парабионтов после инъекции глюкозы через каудальную вену. (A) Уровень глюкозы в крови у мышей-доноров. (B) Уровень глюкозы в крови мышей-реципиентов (n No 6). Данные представлены в виде среднего значения: SEM. p qlt; 0,05, з-п злт; 0,01, «p» (0.001 против 0 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Рисунок 2: Концентрация синего цвета Эванса в образцах сыворотки парабионтов, измеренная считывателем микроплит. Данные представлены в виде среднего значения- SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Поколение подкожных вазогангов в соединенной коже между парабионтами. Слева: Представительное изображение мышей парабиоз. Справа: Репрезентативное изображение подкожного вазоганглиона между парабионтами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Уровень глюкозы в крови парабионтов был протестирован через 1 день после операции по парабиозу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 2: Концентрация синего Эванса измеряется микроплитой в сыворотке парабионтов через 1 день после операции по парабиозу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 3: Концентрация инсулина в сыворотке мышей после инъекции глюкозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| 0 мин. | 5 мин. | 15 мин. | 20 мин. | 40 мин. | 60 мин. | |
| Донор-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Получатель-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Донор-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Получатель-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Дополнительная таблица 1: Уровень глюкозы в крови (змол/л) у парабионтов через 15 дней после операции по парабиозу.
| Управление-1 | Донор-1 | Получатель-1 | Управление-2 | Донор-2 | Получатель-2 | |
| Значение OD | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Дополнительная таблица 2: Концентрация крови Эванс синий (OD значение) в парабионты 15 дней после операции парабиоз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Парабиоз относится к хирургической технике соединения двух живых животных для создания общей сосудистой системы экспериментальными средствами6,7,8. Преимущество этой модели заключается в том, что вещества, производимые одним человеком, могут действовать на обоих животных одновременно. Таким образом, модель парабиоза может быть использована для изучения роли вещества или фактора в связанном с ним заболевании, производя много значимых и новаторских выводов. Ввиду своей большой ценности применения, модель привела к лучшему пониманию заболеваний сердечно-сосудистой системы8,9,10,11,12,13, расстройства нервной системы14,15, трансплантации органов16, и диабет17,18.
Однако проверка успешного создания циркуляционного химеризма является первым и определяющим шагом для исследований с парабиозом. Текущие исследования сообщили некоторые методы для обнаружения циркуляции химеризма. Loffredo et al.4 сообщили, что химеризм крови был подтвержден в парабиотических парах путем измерения смешанной частоты моноцитов в селезенке с различными помеченными маркерами у донора (CD45.1)и реципиента (CD45.2)мышей. В этом методе для парабиоза использовались специфические мыши с CD45.1- или CD45.2- помеченные моноцитами для каждого парабиона. Клеточная цитометрия была необходима для определения химеризма крови путем измерения интеграции отмеченных клеток крови. Кроме того, Marta et al.3 оценили перекрестный оборот интраперитоноинъекционно инъекционным 200 л синего красителя Эванса в одном из парабионтов. Кровь из обоих парабионтов была собрана 2 ч позже путем сердечного прокола. Кровавый химеризм был определен повышенной концентрацией синего цвета Эванса у мышей-реципиентов, которая была протестирована считывателем микроплит. Хотя эти стратегии позволяют нам определить химеризм крови, Есть еще много ограничений, которые не могут быть проигнорированы. Во-первых, для смертельных методов, химеризм крови может быть подтвержден только при исполнении. Однако, по нашему методу, установление химеризма крови может быть проверено в любое время после операции на парабиозе. Парабионты с неудачным установленным кровообращением химеризма могут быть исключены для дальнейшего изучения заранее, чтобы уменьшить ненужную нагрузку. Действительно, используя наш метод колебаний глюкозы мы смогли выделить мышей с неудачной конструкцией крови химеризма в некоторых парабионтов, которые могут быть из-за недостаточного времени парабиоза, нестабильные манипуляции хирургии, задержки заживления ран, или отключены ткани тела, вызванные животных борется. В таких обстоятельствах, отказ крови химеризма был также подтвержден с помощью метода Эванс синий. Эти результаты показывают, что метод колебаний глюкозы был столь же эффективен, как синий метод Эванса(Дополнительный рисунок 1 и Дополнительная рисунок 2, Дополнительная таблица 1 и Дополнительная таблица 2). Во-вторых, используемые в настоящее время методы проверки являются чрезмерно трудоемкими и трудными, в отличие от этого нового метода, который является простым и эффективным.
В настоящем исследовании мы успешно протестировали на циркуляцию химеризма у парабиотических мышей методом колебаний глюкозы. Мышей обезобезвивали для инъекций глюкозы и измерений уровня глюкозы в крови, что облегчило их манипуляцию. Мы вводили 100 кл глюкозы (1,2 г/кг) через хвостовую вену мышей в течение 10 с. В этих условиях наблюдалось регулярное колебание уровня глюкозы в крови у доноров и мышей-реципиентов. Важно отметить, что количество глюкозы, которое мы использовали, как правило, застойно поднять уровень глюкозы в крови в определенном диапазоне. Кроме того, результаты показали, что уровень инсулина в крови восстановился до нормального диапазона 3 ч после инъекции глюкозы(Дополнительная цифра 3), предполагая, что количество глюкозы вводят в мышей было минимальное влияние на метаболизм инсулина. Кроме того, дозировка глюкозы, которую мы дали донору, была ниже, чем та, которая использовалась для теста на толерантность к глюкозе мышей (для GTT, 2 г/кг глюкозы интраперитонеально вводится мышам, что составляет примерно 1,6 г/кг через инъекцию каудальной вены19,20,21),что означает, что дозировка глюкозы для метода флуктуации не вызовет. В заключение, метод, который мы использовали, является эффективным, безвредным и экономии времени. Тем не менее, это может быть ограничено диабетических мышей в парабиоз, которые по-прежнему нуждаются в дальнейших экспериментах для подтверждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом науки о природе Китая (81570399 и 817737335), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая - Научно-исследовательским проектом модернизации традиционной китайской медицины (2017YFC1702003) и Хэй Лонг Цзян Выдающийся молодежный научный фонд (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
