Summary
Her beskriver vi en ny metode for å oppdage vellykket etablering av delt blodsirkulasjon av to parabionter gjennom en caudal veneinjeksjon av glukose, noe som forårsaker minimal skade og er ikke dødelig for parabiontene.
Abstract
Parabiose er en eksperimentell metode for kirurgisk å kombinere to parallelle dyr langs kroppens langsgående akse. Vi presenterer en protokoll for å oppdage vellykket etablering av blodchimerisme i parabionter ved en caudal vene injeksjon av glukose. Parabiotiske mus ble konstruert. Glukose ble injisert i donormusen gjennom halevenen, og svingningene i blodsukkernivået ble målt hos begge musene ved hjelp av et blodglukometer på forskjellige tidspunkter. Våre resultater viste at etter glukoseinjeksjon økte blodsukkernivået hos donormus kraftig etter 1 min og reduserte sakte deretter. I mellomtiden nådde blodsukkernivået til mottakermusene 15 min etter injeksjon. Lignende resultater ble oppnådd med Evans blå, brukt som en positiv kontroll for glukose. De synkrone svingningene i blodsukkernivået indikerer at blodstrømmen mellom de to musene ble etablert med hell.
Introduction
Parabiose er en modelleringsmetode der to levende organismer er sammenkoblet kirurgisk og utvikler seg som et enkelt fysiologisk system med et delt sirkulasjonssystem1. Slike modeller har blitt mye brukt til å studere fysiologi på grunn av fordelen at stoffene som produseres av en enkelt person, kan virke på begge dyrene samtidig via det delte sirkulasjonssystemet. Siden midten av 1800-tallet da parabiotiske eksperimenter ble pionerer av Paul Bert2,har metodene for å konstruere parabiotiske modeller blitt standardisert. Men en enkel og praktisk metode for å verifisere vellykket etablering av blodchimerisme har manglet. Det har blitt rapportert at krysssirkulasjon kan vurderes med hell ved intraperitonealt injeksjon 0,5% Evans blå farge i en av parabiontene etterfulgt av måling av absorbans av Evans blå i blodet av begge parabionter med en mikroplateleser3. En annen metode krever en bestemt muserase som inneholder CD45.1+- og CD45.2+-merket monocytter i hver parabiont. Cellecytometri brukes deretter til å bestemme blodchimerisme ved å måle frekvensen av de to markørene i monocytter fra milt eller blod4. Imidlertid er disse metodene ofte dødelige eller tungvinte for dyrene, og en trygg og enkel metode for rask og pålitelig verifisering av parasittiske modeller er svært ønskelig. I denne studien etablerte vi en ny metode for dette formålet, som ble validert i en musemodell av parabiose. Glukosekonsentrasjon i blodprøver trukket fra en halevene måles ved hjelp av et glukometer, og mønsteret av endringer av glukosenivå hos donor- og mottakermus regnes som en indikasjon på sirkulasjonschimerisme. Vi kalte denne metoden "glukosesvingningsmetoden". Anvendelsen av denne valideringsmetoden er ikke begrenset til mus, men kan utvides til ulike patologiske modeller unntatt for de med alvorlig dysregulering av glukosemetabolismen. Prosedyren er enkel, tidsbesparende og trygg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverte dyr og deres omsorg ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Harbin Medical University.
MERK: Verktøyene og utstyret som kreves for metoden, er oppført i materialtabellen.
1. Utarbeidelse av materialer og dyr
- Bestill C57BL/6 hannmus med vekt mellom 20 g-25 g fra en standard laboratoriedyreleverandør.
- Hus musene i en syklus på 12 timer lys: 12 h mørke ved 24-26 °C med ad libitum tilgang til vann og mat.
2. Parabiosis (andre)
- Bedøve musene ved intraperitoneal injeksjon av 20 g/ L 2,2,2-tribromoetanol ved en konsentrasjon på 0,1 ml/ 10 g. Bekreft riktig bedøvelighet som indikert av muskelavslapning, langsom og jevn pusting, tap av hudstimuleringsrefleks og forsvinning av hornhinnerefleks.
- Påfør oftalmisk salve med en Q-spiss for å forhindre tørre øyne.
- Utfør parabioseprosedyren som tidligere beskrevet5.
- Plasser musene i supine posisjon. Barber venstre side av den ene musen og høyre side av den andre musen starter på ca 1 cm over albuen til 1 cm under kneet med en elektrisk barbermaskin. Bruk hårfjerningskrem for å fjerne pelsen helt på den barberte huden.
- Tørk av de barberte områdene med iodophor. Plasser musene på en oppvarmet pute dekket av en steril pute.
- Lag langsgående hudsnitt fra 0, 5 cm over albuen til 0,5 cm under kneleddet ved hjelp av en par skarpe saks på hvert dyrs barberte side.
- Løsne huden fra den subkutane fasciaen forsiktig etter snittet.
- Koble olecranon og kneet til parabionten med en 3-0 sutur.
- Sutur den barberte huden med en kontinuerlig 5-0 sutur.
- Injiser 0,5 ml 0,9 % NaCl subkutant til hver mus for å forhindre dehydrering.
- Injiser tramadol (10 mg/25 g/dag) intramuskulært til hver mus for å lindre smerte.
3. Validering av sirkulasjonchimerisme
- Metode for glukosesvingninger
MERK: Kontroller vellykket bygging av sirkulasjonschimerisme mellom parabionter ved hjelp av glukosesvingningsmetoden (ingen faste) den tiende dagen etter parabiosekirurgi.- Bedøve parabiontene ved intraperitoneal injeksjon av 20 g/l 2,2,2-tribromoetanol til hver mus ved en konsentrasjon på 0,1 ml/10 g.
- Fest donormusene i en Venous visuell mus hale fixator.
- Gni caudal venene i flanken av en av parabiont halen med en bomullsdott gjennomvåt i 70-75% alkohol for å rense halen og utvide blodårene.
- Hold en 1,0 ml sprøyte som inneholder glukose i høyre hånd og hold kanylen parallelt med venen (mindre enn 15°).
- Sett nålen i en posisjon ca. 2–4 cm fra halespissen.
- Injiser 100 μL glukose (1,2 g/kg) i donoren innen 10 s.
MERK: Begrepet donor refererer til parabionten som mottar glukoseinjeksjongjennom halevenen. Mottakeren er den andre parabionten, som ikke mottar glukose direkte. - Rengjør tærne med iodophor. Klipp av tærne til donor og mottaker mus med en saks og samle en dråpe blod på forskjellige tidspunkter etter injeksjon av glukose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 50 min, og 60 min). Fjern blodproppen ved hvert innsamlingstidspunkt for å unngå mer skade.
MERK: Volumet av innsamlet blod var 10-25 ul for en test, og 90-225 ul totalt. - Drypp blodet inn i midten av glukometer teststrimler for glukosenivådeteksjon.
- Bruk Evans blå motflekk som en positiv kontroll3.
- Injiser 200 μL 0,5% Evans blå motflekk intraperitonealt inn i donormusen.
- 2 t senere, euthanize parabiontene ved intraperitoneal injeksjon av 20 g / L 2,2,2-tribromoetanol til hver mus ved en konsentrasjon på 0,2 ml / 10 g, og samle blod fra begge parabionter ved hjertepunktering.
- Sentrifuge blodprøvene ved 916 x g i 15 min.
- Samle serum fra supernatanten.
- Fortynn serumet med 0,9 % NaCl ved 1:50.
- Mål absorbansen av de fortynnede serumprøvene ved 620 nm med spektrostometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hos seks donormus økte blodsukkernivået kraftig til 26,5 μmol/l (173 % økning) i gjennomsnitt 1 min etter injeksjon en 100 μL glukose (1,2 g/kg) gjennom halevenen og deretter gradvis redusert til 13,3 μmol/l ved 60 min. Hos mottakermus økte blodsukkeret langsomt etter injeksjon og nådde det første toppnivået ved 15 min (47 % økning, 12,2 μmol/l). Basert på resultatene ovenfor ble standarden for sirkulasjonschimerisme satt som følger: 1) en kraftig økning i blodsukkernivået (minimum 100 % økning eller >20 μmol/l) hos donormus innen 1 min etter glukoseinjeksjon, og 2) en signifikant økning i blodsukkernivået hos mottakermus 15 min etter injeksjon (minimum 37 % økning) (Figur 1).
Konsentrasjonen av Evans blå farge i serum et parabionter indikerte også vellykket konstruksjon av sirkulasjonschimerisme (Figur 2). Vi euthanized parabionts etter blodsukkermåling ved hjelp av 5 ml 2,2,2-tribromoetanol (20 g / L). De subkutane vaskulære veikryssene mellom parabiontene ble tydelig observert (figur 3).
Supplerende figur 1 viser at donormusene hadde en betydelig økning i blodsukkernivået 1 min etter glukoseinjeksjon, mens blodsukkernivået til mottakermusene ikke ble forhøyet, noe som viste at sirkulasjonschimerismen hos parabionter ikke ble etablert 1 dag etter parabiosekirurgi. På samme måte var ikke od-nivået i blodet i mottakermus så forhøyet som donormus (tilleggstall figur 2).
Basert på resultatene fra glukosesvingningsmetoden fant vi at to par parabionter ikke etablerte blodchimerisme 15 dager etter parabiosekirurgi. Som vist i supplerende tabell 1,hadde de to mottakermusene ikke et økt blodsukkernivå innen 60 minutter etter glukoseinjeksjon i donormusene. Blodkonsentrasjonen av Evans blå i de to mottakerne ble heller ikke forhøyet (Supplerende tabell 2), som viste at glukosesvingningsmetoden var like følsom som Evans blå metode.
Videre, for å evaluere påvirkning av injisert glukose på insulinmetabolismen, oppdaget vi blodinsulinnivået 1 t og 3 timer etter injeksjon av 100 μL glukose (1,2 g/kg) hos mus (Tilleggstall figur 3). Blodinsulinnivået ble bemerkelsesverdig redusert 1 time etter glukoseinjeksjon på grunn av raskt økt glukose og gjenopprettet til normale nivåer ved 3 timer. Disse resultatene viste at effekten av glukose vi injiserte på insulinmetabolismen var gjenopprettelig.
Figur 1: Endringer av blodsukkernivå i parabionter etter injeksjon av glukose gjennom caudalvenen. (A) Blodsukkernivået til donormus. (B) Blodsukkernivået til mottakermus (n = 6). Dataene presenteres som gjennomsnittet ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. 0 min. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Konsentrasjonen av Evans blå i serumprøver av parabionter målt av en mikroplateleser. Dataene presenteres som gjennomsnittet ± SEM. ***p < 0,001 (n = 6). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Generasjon subkutane vasoganglioner i tilkoblet hud mellom parabiontene. Venstre: Representativt bilde av parabiosemusene. Ikke sant: Et representativt bilde av den subkutane vasoganglionen mellom parabiontene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tillegg skr. 1: Blodsukkernivået av parabionter ble testet 1 dag etter parabiosekirurgi. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tillegg Skr.2: Konsentrasjonen av Evans blå målt ved mikroplateleser i serumet av parabiontene 1 dag etter parabiosekirurgi. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tillegg Figur 3: Konsentrasjonen av insulin i musenes serum etter glukoseinjeksjon. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| 0 min. | 5 min. | 15 min. | 20 min. | 40 min. | 60 min. | |
| Donor-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Mottaker-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Donor-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Mottaker-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Tillegg tabell 1: Blodsukkernivå (μmol/L) i parabionter 15 dager etter parabiosekirurgi.
| Kontroll-1 | Donor-1 | Mottaker-1 | Kontroll-2 | Donor-2 | Mottaker-2 | |
| OD-verdi | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Tillegg tabell 2: Blodkonsentrasjon av Evans blå (OD verdi) i parabionter 15 dager etter parabiose kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiose refererer til kirurgisk teknikk for å koble to levende dyr til å etablere et vanlig vaskulært system ved eksperimentelle midler6,7,8. Fordelen med denne modellen er at stoffene som produseres av en enkelt person, kan handle på begge dyrene samtidig. Dermed kan parabiosemodellen brukes til å utforske rollen som et stoff eller en faktor i en relatert sykdom, noe som gir mange meningsfulle og innovative konklusjoner. I lys av sin store applikasjonsverdi, modellen har brakt om en bedre forståelse av kardiovaskulære systemsykdommer8,9,10,11,12,13, nervesystemet lidelser14,15, organtransplantasjon16, og diabetes17,18.
Imidlertid er verifisering av vellykket etablering av sirkulasjonchimerisme det første og avgjørende trinnfor studier med parabiose. Nåværende studier har rapportert noen metoder for å oppdage sirkulasjonchimerism. Loffredo et al.4 rapporterte at blodchimerisme ble bekreftet i parabiotiske par ved å måle blandet frekvens av monocytter i milten med forskjellige merkede markører i donor (CD45.1+ )og mottaker (CD45.2+) mus. I denne metoden ble spesifikke mus med CD45.1+- eller CD45.2+-merket monocytter for hver parabiont brukt til parabiose. Cellecytometri var nødvendig for å bestemme blodchimerisme ved å måle integreringen av de merkede blodcellene. I tillegg vurderte Marta et al.3 krysssirkulasjon ved intraperitoneistisk injeksjon 200 μL 0,5% Evans blå farge i en av parabiontene. Blod fra begge parabiontene ble samlet 2 timer senere ved hjertepunktering. Blodchimerisme ble bestemt av en økt Evans blå konsentrasjon i mottakermusene, som ble testet av en mikroplateleser. Selv om disse strategiene tillater oss å bestemme blodchimerisme, er det fortsatt mange begrensninger som ikke kan ignoreres. For det første, for dødelige metoder, kan blodchimerismen bare bekreftes ved henrettelse. Men i vår metode kan etableringen av blodchimerisme testes når som helst etter parabiosekirurgi. Parabionter med mislykket etablert sirkulasjonschimerisme kan utelukkes for videre studier på forhånd for å redusere unødvendig arbeidsbelastning. Faktisk, ved hjelp av vår glukosesvingningsmetode var vi i stand til å plukke ut musene med mislykket konstruksjon av blodchimerisme i visse parabionter, som kan skyldes utilstrekkelig tid for parabiose, ustabil kirurgi manipulasjon, forsinket sårheling, eller frakoblet kroppsvev forårsaket av dyr sliter. Under slike omstendigheter ble svikt i blodchimerisme også bekreftet ved hjelp av Evans blå metode. Disse resultatene indikerer at glukosesvingningsmetoden var like effektiv som Evans blå metode (Tilleggstall figur 1 og tilleggstall figur 2, tilleggstabell 1 og tilleggstabell 2). For det andre er de brukte valideringsmetodene svært tidkrevende og vanskelige, i motsetning til denne nye metoden, som er enkel og effektiv.
I den nåværende studien testet vi vellykket for sirkulasjonchimerisme hos parabiotiske mus ved glukosesvingningsmetoden. Musene ble bedøvet for glukoseinjeksjon og blodsukkernivåmålinger, noe som gjorde manipulasjonen enklere. Vi injiserte 100 μL glukose (1,2 g/kg) gjennom halvenen til musene innen 10 s. Under disse forholdene ble det observert regelmessige svingninger i blodsukkernivået hos donor- og mottakermus. Viktigere, mengden glukose vi brukte tendens til å stabilt heve blodsukkernivået innenfor et bestemt område. Videre viste resultatene at blodinsulinnivået gjenopprettet til normal området 3 timer etter glukoseinjeksjon (Tilleggsinjeksjon ( Tilleggstall figur 3), noe som tyder på at mengden glukose injisert i musene hadde minimaleffekter på insulinmetabolismen. I tillegg var dosen av glukose vi ga til donoren lavere enn den som brukes til glukosetoleransetesten av mus (for GTT, 2 g/kg glukose er intraperitonalt injisert til musene, tilsvarende ca. 1,6 g/kg gjennom caudal veneinjeksjon19,20,21), noe som betyr at doseringen av glukose for glukosesvingningsmetoden ikke ville forårsake hyperglykemi og andre skadelige endringer. Til slutt er metoden vi brukte effektiv, ufarlig og tidsbesparende. Det kan imidlertid være begrenset til diabetiske mus i parabiose, som fortsatt trenger ytterligere eksperimenter for bekreftelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Nature Science Foundation of China (81570399 og 81773735), National Key Research and Development Program of China - Traditional Chinese Medicine Modernization Research project (2017YFC1702003) og Hei Long Jiang Outstanding Youth Science Fund (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
