Summary
Aqui descrevemos um novo método de detecção de estabelecimento bem sucedido de circulação sanguínea compartilhada de dois parabiontes através de uma injeção de veia caudal de glicose, o que causa danos mínimos e não é fatal para os parabiontes.
Abstract
A parabiose é um método experimental para combinar cirurgicamente dois animais paralelos ao longo do eixo longitudinal do corpo. Apresentamos um protocolo para detectar o estabelecimento bem sucedido de chimerismo sanguíneo em parabiontes por uma injeção de glicose na veia caudal. Foram construídos camundongos parabióticos. A glicose foi injetada no camundongo doador através da veia traseira, e a flutuação do nível de glicose no sangue foi medida em ambos os camundongos usando um glucometer de sangue em diferentes pontos de tempo. Nossos resultados mostraram que após a injeção de glicose, o nível de glicose no sangue em camundongos doadores aumentou acentuadamente após 1 min e diminuiu lentamente depois disso. Enquanto isso, o nível de glicose no sangue dos camundongos receptores atingiu 15 min após a injeção. Resultados semelhantes foram obtidos com o azul Evans, usado como um controle positivo para a glicose. A flutuação síncrona dos níveis de glicose no sangue indica que o fluxo sanguíneo entre os dois camundongos foi estabelecido com sucesso.
Introduction
A parabiose é um método de modelagem no qual dois organismos vivos são unidos cirurgicamente e se desenvolvem como um único sistema fisiológico com um sistema circulatório compartilhado1. Tais modelos têm sido amplamente utilizados para estudar fisiologia devido à vantagem de que as substâncias produzidas por um único indivíduo podem atuar em ambos os animais ao mesmo tempo através do sistema circulatório compartilhado. Desde meados da década de 1800, quando experimentos parabióticos foram pioneiros por Paul Bert2, os métodos para a construção de modelos parabióticos tornaram-se padronizados. No entanto, um método simples e conveniente para verificar o estabelecimento bem sucedido do chimerismo sanguíneo está faltando. Foi relatado que a circulação cruzada pode ser avaliada com sucesso por injetar intraperitoneicamente 0,5% de tinta azul Evans em um dos parabiontes seguido pela medição da absorção do azul Evans no sangue de ambos os parabiontes com um leitor de microplaca3. Outro método requer uma raça específica do mouse que contém CD45.1+- e monocitos rotulados por CD45.2+em cada parabionte. A citometria celular é então usada para determinar o chimerismo sanguíneo medindo a frequência dos dois marcadores em monocitos do baço ou sangue4. No entanto, esses métodos são muitas vezes letais ou complicados para os animais, e um método seguro e simples para verificação rápida e confiável de modelos parabióticos é altamente desejável. Neste estudo, estabelecemos um novo método para esse fim, que foi validado em um modelo de parabiose de camundongos. A concentração de glicose em amostras de sangue retiradas de uma veia traseira é medida usando um glucometer, e o padrão de mudanças do nível de glicose em camundongos doadores e receptores é considerado uma indicação de chimerismo de circulação. Nomeamos este método de "método de flutuação de glicose". A aplicação deste método de validação não se limita aos camundongos, mas pode ser estendida a diversos modelos patológicos, exceto aqueles com grave disregulação do metabolismo da glicose. O procedimento é simples, economizando tempo e seguro.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais e seus cuidados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica harbin.
NOTA: As ferramentas e equipamentos necessários para o método estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais e animais
- Peça C57BL/6 camundongos machos com peso entre 20 g-25 g de um fornecedor animal de laboratório padrão.
- Abrigar os ratos em um ciclo de 12h de luz: 12h de escuridão a 24-26 °C com acesso a délibitum à água e à comida.
2. Parabiose
- Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-2-tribromoetanol a uma concentração de 0,1 mL/10 g. Confirme a anestesia adequada, como indicado pelo relaxamento muscular, respiração lenta e constante, perda de reflexo da estimulação da pele e desaparecimento do reflexo córnea.
- Aplique pomada oftalma com uma ponta Q para evitar olhos secos.
- Realizar o procedimento de parabiose como descrito anteriormente5.
- Coloque os ratos na posição supina. Raspe completamente o lado esquerdo de um rato e o lado direito do outro mouse começando a aproximadamente 1 cm acima do cotovelo a 1 cm abaixo do joelho com uma barbeador elétrica. Use creme depilatório para limpar totalmente a pele na pele raspada.
- Limpe as áreas raspadas com iodophor. Coloque os ratos em uma almofada aquecida coberta por uma almofada estéril.
- Crie incisões longitudinal de pele a partir de 0,5 cm acima do cotovelo para 0,5 cm abaixo da articulação do joelho usando um par de tesouras afiadas no lado raspado de cada animal.
- Desative a pele da fáscia subcutânea gentilmente após a incisão.
- Conecte o olecranon e o joelho do parabionte com uma sutura 3-0.
- Sutura a pele raspada com uma sutura contínua 5-0.
- Injete 0,5 mL de 0,9% naCl subcutâneamente em cada mouse para evitar desidratação.
- Injete tramadol (10 mg/25 g/dia) intramuscularmente a cada rato para aliviar a dor.
3. Validação do chimerismo de circulação
- Método de flutuação da glicose
NOTA: Verifique a construção bem sucedida do chimerismo de circulação entre parabiontes usando o método de flutuação da glicose (sem jejum) no 10º dia após a cirurgia de parabiose.- Anestesiar os parabiontes por injeção intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-2-tribromoetanol a cada camundongo com concentração de 0,1 mL/10 g.
- Conserte os ratos doadores em um fixador de cauda de rato visual venoso.
- Esfregue as veias caudais no flanco de uma das caudas do parabionte com uma bola de algodão encharcada em 70-75% de álcool para limpar a cauda e dilatar os vasos sanguíneos.
- Segure uma seringa de 1,0 mL contendo glicose na mão direita e mantenha a agulha paralela à veia (menos de 15°).
- Insira a agulha em uma posição de aproximadamente 2-4 cm da ponta da cauda.
- Injete 100 μL de glicose (1,2 g/kg) no doador dentro de 10 s.
NOTA: O termo doador refere-se ao parabionte que recebe a injeção de glicose através da veia traseira. O beneficiário é o outro parabionte, que não recebe glicose diretamente. - Limpe os dedos dos dedos com iodophor. Corte os dedos dos camundongos doadores e receptores com uma tesoura e colete uma gota de sangue em diferentes pontos de tempo após a injeção de glicose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min e 60 min). Remova o coágulo sanguíneo em cada ponto de coleta para evitar mais danos.
NOTA: O volume de sangue coletado foi de 10-25 ul para um teste, e 90-225 ul no total. - Escorra o sangue para o centro das tiras de teste de gliccometer para detecção do nível de glicose.
- Use o Contrastain azul de Evan como um controle positivo3.
- Injete 200 μL de 0,5% o Contrastain azul de Evan intraperitonely no mouse doador.
- 2 h depois, eutanize os parabiontes por injeção intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a cada camundongo com uma concentração de 0,2 mL/10 g, e coletar sangue de ambos os parabiontes por punção cardíaca.
- Centrífuga as amostras de sangue em 916 x g por 15 min.
- Colete soro do supernatante.
- Diluir o soro com 0,9% de NaCl às 1:50.
- Meça a absorção das amostras de soro diluídas em 620 nm com espectrofofômetro.
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Representative Results
Em seis camundongos doadores, os níveis de glicose no sangue aumentaram acentuadamente para 26,5 μmol/L (aumento de 173%) em uma média de 1 min após a injeção de 100 μL de glicose (1,2 g/kg) através da veia traseira e, em seguida, gradualmente diminuíram para 13,3 μmol/L a 60 min. Em camundongos receptores, a glicemia aumentou lentamente após a injeção e atingiu o primeiro pico de nível de 15 min (aumento de 47%, 12,2 μmol/L). Com base nos resultados acima, o padrão de quimerismo de circulação foi definido da seguinte forma: 1) um aumento acentuado no nível de glicose no sangue (um aumento mínimo de 100% ou >20 μmol/L) em camundongos doadores dentro de 1 min após injeção de glicose, e 2) um aumento significativo no nível de glicose no sangue em camundongos receptores 15 min após injeção (um aumento mínimo de 37%) (Figura 1).
A concentração de tinta azul Evans no soro de parabiontes também indicou a construção bem sucedida do chimerismo de circulação(Figura 2). Nós eutanásiamos os parabiontes após a medição da glicemia utilizando 5 mL de 2,2,2-tribromoetanol (20 g/L). As junções vasculares subcutâneas entre os parabiontes foram claramente observadas(Figura 3).
A Figura Complementar 1 mostra que os camundongos doadores tiveram um aumento significativo do nível de glicose no sangue 1 min após a injeção de glicose, enquanto o nível de glicemia dos camundongos receptores não foi elevado, o que demonstrou que o chimerismo de circulação em parabiontes não foi estabelecido com sucesso 1 dia após a cirurgia de parabiose. Da mesma forma, o nível de OD de sangue em camundongos receptores não foi tão elevado quanto o dos camundongos doadores (Figura Suplementar 2).
Com base nos resultados do método de flutuação da glicose, descobrimos que dois pares de parabiontes não estabeleceram o chimerismo sanguíneo 15 dias após a cirurgia de parabiose. Como mostrado na Tabela Complementar 1,os dois camundongos receptores não tinham um aumento do nível de glicose no sangue dentro de 60 minutos após a injeção de glicose nos camundongos doadores. A concentração sanguínea de Evans azul nos dois receptores também não foi elevada (Tabela Suplementar 2), que demonstrou que o método de flutuação da glicose era tão sensível quanto o método azul Evans.
Além disso, para avaliar a influência da glicose injetada no metabolismo da insulina, detectamos a insulina sanguínea nível 1 h e 3h após injeção de 100 μL de glicose (1,2 g/kg) em camundongos (Figura Suplementar 3). O nível de insulina sanguínea foi notavelmente reduzido 1h após a injeção de glicose por causa do aumento rápido da glicose e recuperou-se para níveis normais em 3 h. Esses resultados demonstraram que os efeitos da glicose que injetamos no metabolismo da insulina eram restaurados.
Figura 1: Alterações no nível de glicose no sangue em parabiontes após injeção de glicose através da veia caudal. (A)Nível de glicose no sangue de camundongos doadores. (B) Nível de glicemia de camundongos receptores (n = 6). Os dados são apresentados como a média ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. 0 min. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: A concentração de evans azul em amostras soro de parabiontes medidos por um leitor de microplacas. Os dados são apresentados como média ± SEM. ***p < 0,001 (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Geração de vasoganglions subcutâneos na pele conectada entre os parabiontes. Esquerda: Imagem representativa dos ratos parabiose. Certo: Uma imagem representativa do vasoganglion subcutâneo entre os parabiontes. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 1: O nível de glicose no sangue dos parabiontes foi testado 1 dia após a cirurgia de parabiose. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 2: A concentração de azul Evans medida pelo leitor de microplacas no soro dos parabiontes 1 dia após a cirurgia de parabiose. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 3: A concentração de insulina no soro dos camundongos após a injeção de glicose. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| 0 min. | 5 min. | 15 min. | 20 min. | 40 min. | 60 min. | |
| Doador-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Destinatário-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Doador-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Destinatário-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Tabela Complementar 1: Nível de glicose no sangue (μmol/L) em parabiontes 15 dias após a cirurgia de parabiose.
| Controle-1 | Doador-1 | Destinatário-1 | Controle-2 | Doador-2 | Destinatário-2 | |
| Valor de OD | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Tabela Suplementar 2: Concentração sanguínea de azul Evans (valor de OD) em parabiontes 15 dias após a cirurgia de parabiose.
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Discussion
A parabiose refere-se à técnica cirúrgica de conectar dois animais vivos para estabelecer um sistema vascular comum por meioexperimental6,7,8. A vantagem deste modelo é que as substâncias produzidas por um único indivíduo podem atuar em ambos os animais ao mesmo tempo. Assim, o modelo de parabiose pode ser usado para explorar o papel de uma substância ou fator em uma doença relacionada, produzindo muitas conclusões significativas e inovadoras. Diante de seu grande valor de aplicação, o modelo trouxe uma melhor compreensão das doenças do sistema cardiovascular8,9,10,11,12,13,distúrbios do sistema nervoso14,15, transplante de órgãos16, e diabetes17,18.
No entanto, a verificação do estabelecimento bem sucedido do chimerismo de circulação é o primeiro e determinante passo para estudos com parabiose. Estudos atuais relataram alguns métodos para detectar o chimerismo de circulação. Loffredo et al.4 relataram que o chimerismo sanguíneo foi confirmado em pares parabióticos medindo a frequência mista de monocitos no baço com diferentes marcadores rotulados no doador (CD45.1+) e receptor (CD45.2++ ) ratos. Neste método, foram utilizados camundongos específicos com CD45.1+- ou CD45.2+monocitos rotulados para cada parabionte. A citometria celular foi necessária para determinar o chimerismo sanguíneo medindo a integração das células sanguíneas marcadas. Além disso, Marta et al.3 avaliaram a circulação cruzada injetando intraperitoneicamente 200 μL de 0,5% de tinta azul Evans em um dos parabiontes. Sangue de ambos os parabiontes foi coletado 2h depois por punção cardíaca. O chimerismo sanguíneo foi determinado por um aumento da concentração azul evans nos camundongos receptores, que foi testado por um leitor de microplacas. Embora essas estratégias nos permitam determinar o chimerismo sanguíneo, ainda há muitas limitações que não podem ser ignoradas. Primeiro, para métodos letais, o chimerismo sanguíneo só pode ser confirmado na execução. No entanto, em nosso método, o estabelecimento do chimerismo sanguíneo pode ser testado a qualquer momento após a cirurgia de parabiose. Parabiontes com chimerismo de circulação estabelecido mal sucedido podem ser excluídos para novos estudos com antecedência para reduzir a carga de trabalho desnecessária. De fato, usando nosso método de flutuação de glicose, fomos capazes de escolher os camundongos com construção mal sucedida de chimerismo sanguíneo em certos parabiontes, o que pode ser devido ao tempo insuficiente de parabiose, manipulação de cirurgia instável, cicatrização tardia da ferida ou tecido corporal desconectado causado pela luta animal. Em tais circunstâncias, a falha do chimerismo sanguíneo também foi confirmada usando o método azul Evans. Esses resultados indicam que o método de flutuação da glicose foi tão eficaz quanto o método azul Evans (Figura Complementar 1 e Figura Suplementar 2, Tabela Complementar 1 e Tabela Suplementar 2). Em segundo lugar, os métodos de validação atualmente utilizados são excessivamente demorados e difíceis, ao contrário desse novo método, que é simples e eficaz.
No presente estudo, testamos com sucesso o chimerismo de circulação em camundongos parabióticos pelo método de flutuação da glicose. Os camundongos foram anestesiados para a injeção de glicose e medidas de nível de glicose, o que facilitou sua manipulação. Injetamos 100 μL de glicose (1,2 g/kg) através da veia traseira dos camundongos dentro de 10 s. Nessas condições, observou-se uma flutuação regular dos níveis de glicemia em camundongos doadores e receptores. É importante ressaltar que a quantidade de glicose que usamos tendia a elevar o nível de glicose no sangue dentro de uma certa faixa. Além disso, os resultados mostraram que o nível de insulina sanguínea se recuperou para a faixa normal 3h após a injeção de glicose (Figura 3 Suplementar),sugerindo que a quantidade de glicose injetada nos camundongos tinha efeitos mínimos no metabolismo da insulina. Além disso, a dosagem de glicose que demos ao doador foi menor do que a utilizada para o teste de tolerância à glicose de camundongos (para o GTT, 2 g/kg de glicose é injetada intraperitoneicamente aos camundongos, igualando aproximadamente 1,6 g/kg através da injeção de veia caudal19,20,21), o que significa que a dosagem de glicose para o método de flutuação da glicose não causaria hiperglicemia e outras alterações danos. Em conclusão, o método que usamos é eficaz, inofensivo e economia de tempo. No entanto, pode ser limitado a camundongos diabéticos em parabiose, que ainda precisam de mais experimentos para confirmação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Natureza da China (81570399 e 81773735), pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China - Tradicional Projeto de Pesquisa em Modernização da Medicina Chinesa (2017YFC1702003) e Hei Long Jiang Excelente Fundo de Ciência da Juventude (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
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