Summary
Burada, en az hasara neden olan ve parabiontlar için ölümcül olmayan bir kaudal ven enjeksiyonu ile iki parabiontun ortak kan dolaşımının başarılı bir şekilde kurulmasını saptamak için yeni bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Parabiyoz, vücudun boylamsal ekseni boyunca iki paralel hayvanı cerrahi olarak birleştirmek için deneysel bir yöntemdir. Parabionlarda kan kimeraizminin başarılı bir şekilde kurulmasını, kaudal ven enjeksiyonu ile tespit etmek için bir protokol sayılmak üzere bir protokol sayılmiyoruz. Parabiyotik fareler inşa edildi. Glikoz donör fareye kuyruk damarı ile enjekte edildi ve kan şekeri seviyesinin dalgalanması her iki farede de farklı zaman noktalarında kan gdolüter kullanılarak ölçüldü. Sonuçlarımız, glukoz enjeksiyonundan sonra donör farelerdeki kan şekeri seviyesinin 1 dk sonra keskin bir şekilde arttığını ve sonrasında yavaş yavaş azaldığını göstermiştir. Bu arada, alıcı farelerin kan şekeri seviyesi enjeksiyondan sonra 15 dk zirveye ulaştı. Benzer sonuçlar, glikoz için pozitif kontrol olarak kullanılan Evans mavisi ile elde edildi. Kan şekeri düzeylerindeki senkron dalgalanma, iki fare arasındaki kan akışının başarılı bir şekilde belirlendiğini gösterir.
Introduction
Parabiyoz, iki canlı organizmanın cerrahi olarak biraraya gelerek ortak dolaşım sistemi1ile tek bir fizyolojik sistem olarak geliştiği bir modelleme yöntemidir. Bu modeller, tek bir bireyin ürettiği maddelerin ortak dolaşım sistemi aracılığıyla her iki hayvan üzerinde aynı anda hareket edebildiği avantajı sayesinde fizyolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Parabiyotik deneyler Paul Bert2tarafından öncülük edildi 1800'lerin ortalarından bu yana, parabiyotik modeller oluşturmak için yöntemler standart hale gelmiştir. Ancak, kan kimerizminin başarılı kurulmasını doğrulamak için basit ve uygun bir yöntem eksik olmuştur. Bu çapraz dolaşım başarıyla bir mikroplaka okuyucu ile her iki parabionts kanevans mavi emiciliği ölçümü takip parabionts birinde% 0.5 Evans mavi boya enjekte intraperitoneally enjekte tarafından değerlendirilebilir bildirilmiştir3. Başka bir yöntem cd45.1+içeren belirli bir fare cinsi gerektirir - ve CD45.2+etiketli monositler her parabiont. Hücre sitometrisi daha sonra dalak veya kan dan monositler iki belirteçlerin sıklığını ölçerek kan kimerizm belirlemek için kullanılır4. Ancak, bu yöntemler genellikle hayvanlar için öldürücü veya hantal, ve parabiyotik modellerin hızlı ve güvenilir doğrulama için güvenli ve basit bir yöntem son derece arzu edilir. Bu çalışmada, parabiyozun fare modelinde doğrulanan yeni bir yöntem oluşturduk. Kuyruk damarından alınan kan örneklerindeki glikoz konsantrasyonu bir glucometer kullanılarak ölçülür ve donör ve alıcı farelerdeki glikoz seviyesinin değişim şekli dolaşım kimerizminin bir göstergesi olarak kabul edilir. Bu yönteme "glikoz dalgalanma yöntemi" adını verdik. Bu doğrulama yönteminin uygulanması farelerle sınırlı değildir, ancak glikoz metabolizmasının ciddi disregülasyonu olanlar dışında çeşitli patolojik modellere genişletilebilir. Prosedür basit, zaman kazandırır ve güvenlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar la ilgili tüm prosedürler ve bakımı Harbin Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Yöntem için gerekli araç ve gereçler Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir.
1. Malzeme ve hayvanların hazırlanması
- Standart bir laboratuvar hayvan tedarikçisinden 20 g-25 g arasında ağırlıkla C57BL/6 erkek fareler sipariş imredin.
- Fareleri 12 saat ışıklık bir döngü içinde barındırın: 24−26 °C'de 12 saat karanlık, su ve gıdaya reklam libitum erişimi ile.
2. Parabiyoz
- 0.1 mL/10 g. konsantrasyonunda 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezi kin gevşemesi, yavaş ve istikrarlı nefes alma, cilt stimülasyon refleks kaybı ve kornea refleks ortadan kalkması ile belirtildiği gibi uygun anestezi doğrulayın.
- Kuru gözleri önlemek için bir Q-ucu ile oftalmik merhem uygulayın.
- Daha önce açıklandığı gibi parabiyoz prosedürügerçekleştirin 5.
- Fareleri supine pozisyonuna getirin. Bir farenin sol tarafını ve diğer farenin sağ tarafını dirsekten yaklaşık 1 cm yukarıdan başlayarak diz den 1 cm aşağıya elektrikli tıraş ile iyice tıraş edin. Tıraşlı ciltteki kürkü tamamen temizlemek için tüy dökücü krem kullanın.
- Traş edilen alanları iyodophor ile silin. Fareleri steril bir pedle kaplı ısıtmalı bir pedüzerine yerleştirin.
- Her hayvanın traşlı tarafında keskin bir makas kullanarak dirseğin 0,5 cm yukarısından diz ekleminin 0,5 cm altına kadar uzunlamasına deri kesileri oluşturun.
- Kesiği hafifçe takiben deriyi deriden deriden subkutan fasyadan ayırın.
- Parabiontun olecranon ve diz bağlantısını 3-0'lık bir dikişle bağlayın.
- Sürekli 5-0 dikiş ile tıraş lı cildi dikin.
- Dehidratasyonu önlemek için her fareye 0,5 mL %0,9 NaCl deri altı enjekte edin.
- Ağrıyı dindirmek için her fareye tramadol (10 mg/25 g/gün) enjekte edin.
3. Dolaşım kimerizminin doğrulanması
- Glikoz dalgalanma yöntemi
NOT: Parabiyoz cerrahisinden sonraki 10.- 0.1 mL/10 g konsantrasyonu ile her fareye 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyon ile parabiontize.
- Venöz görsel fare kuyruk fiksatöründeki donör fareleri düzeltin.
- Kaudal damarları parabiontun kuyruğundan birinin kan kanadında, kuyruğunu temizlemek ve kan damarlarını temizlemek için %70−75 alkolle ıslatılmış bir pamuk topuyla ovun.
- Sağ elde glikoz içeren 1,0 mL'lik bir şırınga tutun ve iğneyi damara paralel tutun (15°'den az).
- İğneyi kuyruk ucundan yaklaşık 2−4 cm uzaklıkta bir pozisyona yerleştirin.
- 10 s içinde donöre 100 μL (1,2 g/kg) glikoz enjekte edin.
NOT: Donör terimi, kuyruk damarından glikoz enjeksiyonu alan parabiont anlamına gelir. Alıcı doğrudan glikoz almaz diğer parabiont olduğunu. - Iodophor ile ttemiz. Bir makas ile donör ve alıcı farelerin tonlarını kesin ve glikoz enjeksiyonu sonra farklı zaman noktalarında kan bir damla toplamak (1 dk, 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 30 dk, 40 dk, 50 dk, ve 60 dk). Daha fazla zarar görmesini önlemek için her toplama zaman noktasında kan pıhtısı çıkarın.
NOT: Toplanan kanın hacmi bir test için 10-25 ul, toplamda 90-225 ul idi. - Glikoz düzeyi tespiti için kanı glucometer test şeritlerinin ortasına damlatın.
- Olumlu bir kontrol3olarak Evan mavi Counterstain kullanın.
- Donör fareye %0,5 Evan'ın mavi Counterstain intraperitoneally enjekte edin.
- 2 saat sonra, 0.2 mL/10 g konsantrasyonu ile her fareye 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyon ile parabiontlar ötenazi ve kardiyak delinme ile her iki parabionttan kan toplamak.
- 15 dakika boyunca 916 x g kan örneklerini santrifüj edin.
- Supernatant serum toplayın.
- Serumu 1:50'de %0.9 NaCl ile seyreltin.
- Seyreltilmiş serum örneklerinin emiciliğini 620 nm'de spektrofotometre ile ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altı donör farede, kan şekeri seviyesi kuyruk damarından 100 μL (1,2 g/kg) glukoz enjeksiyonundan sonra ortalama 1 dakika 26,5 mol/L'ye (%173 artış) yükseldi ve daha sonra kademeli olarak 60 dk'da 13,3 μmol/L'ye düştü. Alıcı farelerde, enjeksiyon dan sonra kan şekeri yavaş yavaş artmış ve 15 dk ile ilk tepe seviyeye ulaşmıştır (%47 artış, 12.2 μmol/L). Yukarıdaki sonuçlara göre, dolaşım kimerizmi standardı şu şekilde belirlenmiştir: 1) glukoz enjeksiyonundan sonra 1 dakika içinde donör farelerde kan şekeri düzeyinde keskin bir artış (en az %100 artış veya >20 μmol/L) ve 2) enjeksiyondan sonra alıcı farelerde kan şekeri düzeyinde önemli bir artış 15 dakika (en az %37 artış)(Şekil 1).
Parabionitlerin serumundaki Evans mavi boya konsantrasyonu da dolaşım kimerizminin başarılı bir şekilde inşa sını göstermiştir (Şekil 2). Kan şekeri ölçümü nden sonra parabionları 2,2,2-tribromoetanol (20 g/L) 5 mL kullanarak ötenazi yaptık. Parabiontlar arasındaki deri altı vasküler kavşaklar açıkça gözlenmiştir (Şekil 3).
Ek Şekil 1, donör farelerin glukoz enjeksiyonundan 1 dk sonra önemli bir kan şekeri seviyesinin arttığını, alıcı farelerin kan şekeri seviyesinin yüksek olmadığını, parabionitlerde dolaşım kiremitliğinin parabiyozis cerrahisinden 1 gün sonra başarılı bir şekilde kurulmadığını göstermektedir. Benzer şekilde, alıcı farelerdeki kan OD düzeyi donör farelerinki kadar yüksek değildi (Ek Şekil 2).
Glukoz dalgalanması yönteminin sonuçlarına dayanarak, parabiyoz cerrahisinden 15 gün sonra iki çift parabiontun kan kimerizmini oluşturmadığını bulduk. Ek Tablo 1'degösterildiği gibi, iki alıcı faredonör farelere glukoz enjeksiyonundan sonra 60 dakika içinde kan şekeri seviyesinin artmadı. İki alıcıda Evans mavisinin kan konsantrasyonu da yükselmiyordu(Ek Tablo 2),glikoz dalgalanma yönteminin Evans mavisi yöntemi kadar hassas olduğunu gösterdi.
Ayrıca, enjekte edilen glikozun insülin metabolizması üzerindeki etkisini değerlendirmek için, farelerde 100 μL glukoz (1.2 g/kg) enjeksiyonundan sonra kan insülin düzeyi 1 h ve 3 h saptandı(Ek Şekil 3). Hızlı bir şekilde artan glikoz nedeniyle kan insülin düzeyi belirgin 1 saat azaldı ve normal düzeylere 3 saat kurtarıldı. Bu sonuçlar, enjekte ettiğimiz glikozun insülin metabolizması üzerindeki etkilerinin onalabildiğini göstermiştir.
Şekil 1: Kaudal ven yoluyla glikoz enjeksiyonu sonrası parabiontlarda kan şekeri düzeyinin değişimi. (A) Donör farelerin kan şekeri düzeyi. (B) Alıcı farelerin kan şekeri düzeyi (n = 6). Veriler ortalama ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 0 dk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir mikroplaka okuyucu tarafından ölçülen parabiontların serum örneklerinde Evans mavisi konsantrasyonu. Veriler ortalama ± SEM. ***p < 0.001 (n = 6) olarak sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Parabiontlar arasında bağlı deride deri altı vazoganglionüretimi. Sol: Parabiyoz farelerin temsili görüntüsü. Sağ: Parabiontlar arasındaki deri altı vazogangliliğin temsili bir görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Parabiyoz cerrahisinden 1 gün sonra parabionitlerin kan şekeri düzeyi test edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Parabiyoz cerrahisinden 1 gün sonra parabionitlerin serumunda mikroplaka okuyucu tarafından ölçülen Evans mavisi konsantrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Glikoz enjeksiyonundan sonra farelerin serumundaki insülin konsantrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 0 dk | 5 dk | 15 dk | 20 dk | 40 dk | 60 dk | |
| Donör-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Alıcı-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Donör-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Alıcı-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Ek Tablo 1: Parabiyoz cerrahisinden 15 gün sonra parabionlarda kan şekeri düzeyi (μmol/L).
| Kontrol-1 | Donör-1 | Alıcı-1 | Kontrol-2 | Donör-2 | Alıcı-2 | |
| OD değeri | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Ek Tablo 2: Parabiyoz cerrahisinden 15 gün sonra parabionlarda Evans mavisinin kan konsantrasyonu (OD değeri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiyoz deneysel yollarla ortak bir vasküler sistem kurmak için iki canlı hayvan bağlayan cerrahi tekniği ifade eder6,7,8. Bu modelin avantajı, tek bir birey tarafından üretilen maddelerin her iki hayvanüzerinde aynı anda hareket edebiliyor olmasıdır. Böylece, parabiyoz modeli birçok anlamlı ve yenilikçi sonuçlar üreten, ilgili bir hastalık bir madde veya faktör rolünü keşfetmek için kullanılabilir. Onun büyük uygulama değeri görünümünde, model kardiyovasküler sistem hastalıklarınındaha iyi anlaşılması hakkında getirdi 8,9,10,11,12,13, sinir sistemi bozuklukları14,15, organ nakli16, ve diyabet17,18.
Ancak, dolaşım kimerizminin başarılı kurulmasının doğrulanması parabiyozlu çalışmalar için ilk ve belirleyici adımdır. Mevcut çalışmalar dolaşım kimerizm tespit etmek için bazı yöntemler bildirilmiştir. Loffredo ve ark.4 kan kimerizm donör farklı etiketli işaretleri ile dalak monositlerin karışık frekansı ölçülerek parabiyotik çiftlerde doğrulandıve alıcı (CD45.2+) fareler bildirdi. Bu yöntemde parabiyoz için CD45.1+veya CD45.2+etiketli monositler ile spesifik fareler kullanıldı. İşaretli kan hücrelerinin entegrasyonunu ölçerek kan kimerizmini belirlemek için hücre sitometrisine ihtiyaç vardı. Buna ek olarak, Marta ve ark.3 intraperitoneally 200 μL enjekte ederek çapraz dolaşım değerlendirildi 0.5% Evans mavi boya parabionts birine. Her iki parabionitin kanı 2 saat sonra kardiyak delinme ile alındı. Kan kimerizmi alıcı farelerde artan Evans mavi konsantrasyonu tarafından belirlendi, hangi bir mikroplaka okuyucu tarafından test edildi. Bu stratejiler bize kan kimerizmbelirlemek için izin rağmen, hala göz ardı edilemez birçok sınırlamalar vardır. İlk olarak, ölümcül yöntemler için, kan kimerizm sadece infaz teyit edilebilir. Ancak yöntemimizde kan kimerizminin kurulması parabiyoz cerrahisi sonrası her zaman test edilebilir. Başarısız kurulan dolaşım kimerizmi ile Parabionts gereksiz iş yükünü azaltmak için önceden daha fazla çalışma için dışlanabilir. Gerçekten de, glikoz dalgalanma yöntemini kullanarak bazı parabionlarda kan kimeraizminin başarısız yapısına sahip fareleri seçebildik, bu da parabiyoz, kararsız cerrahi manipülasyon, gecikmiş yara iyileşmesi veya hayvan mücadelesinin neden olduğu vücut dokusunun kopması nedeniyle olabilir. Bu gibi durumlarda, kan kimerizm yetmezliği de Evans mavi yöntemi kullanılarak doğrulandı. Bu sonuçlar, glukoz dalgalanma yönteminin Evans mavisi yöntemi kadar etkili olduğunu göstermektedir (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2, Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2). İkinci olarak, şu anda kullanılan doğrulama yöntemleri, basit ve etkili olan bu yeni yöntemin aksine, aşırı zaman alıcı ve zordur.
Bu çalışmada, parabiyotik farelerde dolaşım kimerizmini glukoz dalgalanması yöntemi ile başarıyla test ettik. Fareler glikoz enjeksiyonu ve kan şekeri seviyesi ölçümleri için anestezi edildi, bu da onların manipülasyonu daha kolay hale getirdi. 10 s içindeki farelerin kuyruk damarına 100 μL (1.2 g/kg) glikoz enjekte ettik. Bu şartlar altında donör ve alıcı farelerde kan şekeri düzeylerinde düzenli bir dalgalanma gözlenmiştir. Daha da önemlisi, kullandığımız glikoz miktarı belirli bir aralıkta kan şekeri seviyesini stably yükseltmek eğilimindedir. Ayrıca, sonuçlar kan insülin düzeyi normal aralığına geri döndü gösterdi 3 glukoz enjeksiyonu sonra h h(Ek Şekil 3),farelere enjekte glikoz miktarı insülin metabolizması üzerinde minimal etkileri olduğunu düşündürmektedir. Buna ek olarak, donöre verdiğimiz glikozun dozu farelerin glikoz tolerans testiiçin kullanılandan daha düşüktü (GTT için, 2 g/kg glikoz farelere intraperitoneal enjekte edilir, kaudal ven enjeksiyonu ile yaklaşık 1.6 g/kg'a eşittir19,20,21), bu da glikoz dalgalanma yöntemi için glikoz dozunun hiperglisemi ye ve diğer zararlı değişikliklere neden olmayacağını zelderdi. Sonuç olarak, kullandığımız yöntem etkili, zararsız ve zaman kazandırır. Ancak, parabiyoz diyabetik fareler ile sınırlı olabilir, hala onay için daha fazla deney gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81570399 ve 81773735), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı - Geleneksel Çin Tıbbı Modernizasyon Araştırma projesi (2017YFC1702003) ve Hei Long Jiang tarafından desteklenmiştir. Üstün Gençlik Bilim Fonu (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
