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Developmental Biology

अलग कैनोरहैबडिटिस एलिगेंस भ्रूण ब्लास्टोमेरेस और चिपकने वाला पॉलीस्टीरिन मोतियों के साथ स्थानिक सेल संपर्क पैटर्न के विट्रो पुनर्गठन में

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

बहुकोशिकीय प्रणालियों की ऊतक जटिलताओं ने बाह्युलर संकेतों और व्यक्तिगत सेलुलर व्यवहार के बीच कारण संबंध की पहचान को चकित कर दिया। यहां, हम सी एलिगेंस भ्रूण ब्लास्टोमेरेस और चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग करके संपर्क-निर्भर संकेतों और विभाजन कुल्हाड़ियों के बीच सीधे लिंक का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

बहुकोशिकीय प्रणालियों में, व्यक्तिगत कोशिकाएं पड़ोसी कोशिकाओं और पर्यावरण से आने वाले विभिन्न भौतिक और रासायनिक संकेतों से घिरी हुई हैं। यह ऊतक जटिलता बाह्य संकेतों और सेलुलर गतिशीलता के बीच कारण लिंक की पहचान को चकित करती है। एक सिंथेटिक पुनर्गठित बहुकोशिकीय प्रणाली शोधकर्ताओं को दूसरों को नष्ट करते हुए एक विशिष्ट क्यू के लिए परीक्षण करने में सक्षम बनाकर इस समस्या पर काबू पा देती है । यहां, हम अलग-थलग कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस ब्लास्टोमेरे और चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों के साथ सेल संपर्क पैटर्न का पुनर्गठन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रक्रियाओं में एगशेल हटाने, सेल-सेल आसंजन को बाधित करके ब्लास्टोमेरे अलगाव, चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों की तैयारी और सेल-सेल या सेल-मनका संपर्क का पुनर्गठन शामिल है। अंत में, हम इस विधि के आवेदन को सेलुलर डिवीजन कुल्हाड़ियों के अभिविन्यास की जांच करने के लिए प्रस्तुत करते हैं जो भ्रूण के विकास में स्थानिक सेलुलर पैटर्निंग और सेल भाग्य विनिर्देश के नियमन में योगदान देता है। यह मजबूत, प्रजनन योग्य और बहुमुखी इन विट्रो विधि स्थानिक कोशिका संपर्क पैटर्न और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बीच प्रत्यक्ष संबंधों के अध्ययन को सक्षम बनाती है।

Introduction

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बहुकोशिकीय विकास के दौरान, अलग-अलग कोशिकाओं के सेलुलर व्यवहार (उदाहरण के लिए, विभाजन धुरी) विभिन्न रासायनिक और भौतिक संकेतों द्वारा निर्दिष्ट किए जाते हैं। यह समझने के लिए कि व्यक्तिगत कोशिका इस जानकारी की व्याख्या कैसे करती है, और वे बहुकोशिकीय असेंबली को एक आकस्मिक संपत्ति के रूप में कैसे विनियमित करते हैं, यह मॉर्फोजेनेसिस अध्ययन ों के अंतिम लक्ष्यों में से एक है। मॉडल ऑर्गेज्म सी एलिगेंस ने कोशिका ध्रुवीकरण1,सेल डिवीजन पैटर्निंग1,सेल भाग्य निर्णय2और न्यूरोनल वायरिंग3 और ऑर्गेनोजेनेसिस4,5जैसे ऊतक-पैमाने के नियमों जैसे मॉर्फोजेनेसिस के सेलुलर स्तर के नियमन की समझ में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। हालांकि विभिन्न आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं, ऊतक इंजीनियरिंग विधियां सीमित हैं।

सी एलिगेंस अध्ययन में सबसे सफल ऊतक इंजीनियरिंग विधि शास्त्रीय ब्लास्टोमेरे अलगाव6है; के रूप में सी elegans भ्रूण एक अंडे और एक स्थायित्व बाधा7से घिरा हुआ है, उनके हटाने इस विधि की मुख्य प्रक्रियाओं में से एक है । हालांकि यह ब्लास्टोमेरे अलगाव विधि एक सरलीकृत तरीके से सेल-सेल संपर्क के पुनर्गठन को सक्षम बनाती है, यह अवांछित संकेतों के उन्मूलन के लिए अनुमति नहीं देती है; सेल संपर्क अभी भी दोनों यांत्रिक (जैसे, आसंजन) और रासायनिक संकेतों बन गया है, जिससे हमारे लिए पूरी तरह से क्यू और सेलुलर व्यवहार के बीच कारण संबंध का विश्लेषण करने की क्षमता सीमित ।

इस पेपर में प्रस्तुत विधि कार्बोसिलेट संशोधित पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग करती है जो किसी भी अमीन-प्रतिक्रियाशील अणुओं को बांध सकती है जिसमें प्रोटीन के रूप में लिगांड शामिल हैं। विशेष रूप से, हमने कोशिका के लिए नेत्रहीन ट्रैक करने योग्य और चिपकने वाले दोनों मोतियों को बनाने के लिए एक लिगाड के रूप में रोडामाइन रेड-एक्स के एक अमीन-प्रतिक्रियाशील रूप का उपयोग किया। मनका सतह और लिगामेंट अणु के प्राथमिक अमीन समूहों के कार्बोसिल समूहों को पानी में घुलनशील कार्बोडिमिड 1-एथिल-3-(डिमेथिलामिनोप्रोपिल) कार्बोडिमाइड (ईडैक)8,9के साथ मिलकर किया जाता है। प्राप्त चिपकने वाले मोती सेलुलर गतिशीलता10पर यांत्रिक क्यू के प्रभाव के लिए अनुमति देते हैं। हमने सेल डिवीजन ओरिएंटेशन10के लिए आवश्यक यांत्रिक संकेतों की पहचान करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है ।

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Protocol

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1. चिपकने वाला पॉलीस्टीरिन बीड की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में सेप्टिक तकनीक की आवश्यकता नहीं है।

  1. 1.5 मिलीग्राम माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में 10 मिलीग्राम कार्बोसिलेट संशोधित पॉलीस्टीरिन मोतियों का वजन करें।
  2. मोतियों को धोने के लिए, ट्यूब में 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेनेसल्फोनिक एसिड (एमईएस) बफर का 1 mL जोड़ें। चूंकि एमईएस बफर में फॉस्फेट और एसीटेट नहीं होता है, जो कार्बोडिमाइड की प्रतिक्रियाको कम कर सकता है, इसलिए प्रोटीन युग्मन प्रतिक्रिया में उपयोग करना उपयुक्त है। मोतियों को मिलाने के लिए ट्यूब को भंवर करें।
  3. एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र के माध्यम से 2,000 x ग्राम पर 60 एस के लिए ट्यूब स्पिन।
  4. बफर को ध्यान से बाहर निकालकर अधिनेत को त्यागें।
  5. 1.2-1.4 चरणों का पालन करके एमईएस बफर के 1 mL के साथ फिर से मोतियों को धोएं।
  6. सतह कारबॉक्साइल समूहों को सक्रिय करने के लिए ट्यूब में 10 मिलीग्राम ईडैक युक्त एमईएस बफर का 1 मिलील जोड़ें। मोतियों को मिलाने के लिए ट्यूब को भंवर करें।
  7. कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए ट्यूब को घुमाएं और इनक्यूबेट करें।
  8. 2,000 x ग्रामपर 60 एस के लिए मोतियों को नीचे स्पिन करें।
  9. बफर को ध्यान से बाहर निकालकर अधिनेत को त्यागें।
  10. मोतियों को धोने के लिए, ट्यूब में फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) का 1 मिलील जोड़ें। मोतियों को मिलाने के लिए ट्यूब को भंवर करें।
  11. 2,000 x ग्रामपर 60 एस के लिए ट्यूब नीचे स्पिन।
  12. बफर को ध्यान से बाहर निकालकर अधिनेत को त्यागें।
  13. 1.10-1.12 चरणों का पालन करके पीबीएस के 1 mL के साथ फिर से मोतियों को धोएं।
  14. रोडामिन की अंतिम एकाग्रता छवि वाले तनाव पर निर्भर करेगी। 0.65 एम रोडामिन रेड-एक्स स्टॉक समाधान से 1-, 10-, 100-, 100-और रोडामिन रेड-एक्स की 1000 गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें।
  15. प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने ट्यूब में मोतियों के 20 μL पिपेट ।
  16. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए ट्यूब को घुमाएं और इनक्यूबेट करें।
  17. 1.10-1.12 चरणों को दोहराकर पीबीएस के 1 mL के साथ दो बार मोतियों को धोएं।
  18. पीबीएस का 1 एमएल ट्यूब में डालें और इसे 6 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप के नीचे मोतियों की फ्लोरेसेंस तीव्रता की जांच करें। रोडामिन रेड-एक्स सुसिनीडिल एस्टर की उचित एकाग्रता इमेजिंग स्थितियों(चित्र ा 1)पर निर्भर है।
    नोट: रोडाइन रेड-एक्स उपचार के बिना मोती कोशिका का पालन नहीं करते हैं। रोडामिन रेड-एक्स फ्लोरेसेंस मार्कर के साथ-साथ चिपकने वाला अणु के रूप में कार्य करता है। सकारात्मक रूप से आवेशित रोडामिन रेड-एक्स और नकारात्मक रूप से चार्ज प्लाज्मा झिल्ली के बीच इलेक्ट्रो स्थिर बातचीत आसंजन का एक ख्यात कारण है।

2. मुंह पिपेट की विधानसभा

  1. कट वाइड (6.35 मिमी आंतरिक व्यास) और संकीर्ण (3.175 मिमी आंतरिक व्यास) टायगन ट्यूब क्रमशः लगभग 25 सेमी और 40 सेमी लंबाई में(चित्रा 2)तक काटें।
  2. टाइगन ट्यूबों को पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) फिल्टर (0.2 माइक्रोन पोर आकार)(चित्रा 2)से जोड़ें।
  3. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एस्पिरेटर ट्यूब को अलग करें और क्रमशः संकीर्ण और व्यापक टायगन ट्यूबों के अंत तक अपने केशिका धारक और मुखपत्र संलग्न करें(चित्रा 2)।
    नोट: PTFE फिल्टर मुंह पिपेट के माध्यम से हाइपोक्लोराइट समाधान के धुएं के साँस लेना रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

3. भ्रूण ब्लास्टोमेरे का अलगाव

नोट: ब्लीचिंग समाधान के साथ कट और संपर्क से बचने के लिए दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहनें।

  1. एक माइक्रोकेपिलरी (क्षमता; 10 μL) के प्रत्येक छोर को दाएं और बाएं हाथ से पकड़ें।
  2. तनाव लागू करने के लिए माइक्रोकेपिलरी को दोनों सिरों की ओर खींचें और केशिका के केंद्र को एक बर्नर पर लाएं ताकि दो हाथ से खींचे गए केशिकाओं(चित्रा 3ए)बनाया जा सके।
  3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे संदंश के साथ हाथ से खींचे गए केशिकाओं के सुझावों को ट्रिम करें और खींचे गए केशिका को मुंह पाइपिंग उपकरण(चित्रा 2)में संलग्न करें। दो प्रकार के पिपेट तैयार करें। पिपेटके लिए टिप खोलने के आकार लगभग 2x और 1x भ्रूण हस्तांतरण और अंडे हटाने के लिए सी एलिगन्स भ्रूण (30 μm) की छोटी धुरी लंबाई, क्रमशः चित्रा 3बी-डीहोना चाहिए ।
  4. एक मल्टीवेल स्लाइड(चित्रा 4ए;नीचे) की एक अच्छी तरह से अंडे नमक समाधान के पिपेट 45 μL।
  5. एक अच्छी तरह से अंडे नमक समाधान युक्त पर 5-10 वयस्क सी elegans प्लेस ।
  6. जल्दी सी elegans भ्रूण प्राप्त करने के लिए, सी elegans शरीर के दाईं और बाईं ओर दो सुई स्थिति और एक दूसरे के पिछले सुई फिसलने(चित्र4ए;ऊपरी योजनाबद्ध) द्वारा टुकड़ों में वयस्कों में कटौती ।
  7. अंडे नमक समाधान(चित्रा 4बी)युक्त कुएं के बगल में एक अच्छी तरह से हाइपोक्लोराइट समाधान के पिपेट 45 μL।
  8. बाद के तीन कुओं पर शेल्टन के विकास माध्यम के पिपेट 45 μL अच्छी तरह से युक्त हाइपोक्लोराइट समाधान(चित्रा 4बी)के बगल में।
  9. स्थानांतरण 1-सेल चरण और जल्दी 2-कोशिका चरण भ्रूण भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ मुंह पाइपिंग द्वारा हाइपोक्लोराइट समाधान में(चित्रा 4बी)
  10. 40-55 एस के लिए प्रतीक्षा करें।
  11. भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार केशिका(चित्रा 4बी)के साथ मुंह पाइपिंग द्वारा शेल्टन के विकास माध्यम में हाइपोक्लोराइट समाधान से भ्रूण को स्थानांतरित करके भ्रूण को धोएं।
  12. भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार केशिका(चित्रा 4बी)के साथ मुंह पाइपिंग द्वारा शेल्टन के विकास माध्यम के एक नए कुएं में भ्रूण को स्थानांतरित करके भ्रूण को फिर से धोएं।
  13. भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ मुंह पाइपिंग द्वारा शेल्टन के विकास माध्यम के एक नए कुएं में धोया भ्रूण हस्तांतरण । अंडे हटाने के लिए हाथ से तैयार केशिका का उपयोग करके, पाइपिंग(चित्रा 4सी;मध्य योजनाबद्ध) को ध्यान से दोहराएं। यदि अंडे के लिए सफलतापूर्वक हटा दिया जाता है, भ्रूण कोशिकाओं को और अधिक गोलाकार हो जाएगा(चित्र4सी;सही) ।
  14. अंडे के लिए हाथ से तैयार केशिका(चित्रा 4डी)के साथ धीरे और लगातार पाइपिंग द्वारा 2-सेल चरण भ्रूण ब्लास्टोमेरेस को अलग करें।

4. ब्लास्टोमेरे और बीड के साथ संपर्क पैटर्न का पुनर्गठन

नोट: एक बीड से एक सेल के विसोशन से बचने के लिए और समय पर छवि अधिग्रहण की सुविधा के लिए इमेजिंग माइक्रोस्कोप के तहत काम करते हैं ।

  1. उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का निरीक्षण करने के लिए, चित्रा 5में एक इमेजिंग चैंबर तैयार करें।
    1. एक कवरस्लिप धारक(चित्रा 5ए)पर एक कवरस्लिप रखें।
    2. इसे स्थिर करने के लिए कवरस्लिप के किनारों को टेप करें। टेप के साथ पक्ष 'बैक' साइड है(चित्रा 5ए, बी)।
    3. कवरस्लिप धारक को 'फ्रंट' साइड पर फ्लिप करें और हाइड्रोफोबिक पेन(चित्रा 5सी)के साथ कवरस्लिप पर एक सर्कल बनाएं।
      नोट: किसी भी गिलास नीचे पकवान भी काम करता है, बशर्ते भ्रूण मुंह पिपेट द्वारा जोड़ तोड़ रहे हैं ।
  2. हाइड्रोफोबिक मार्कर(चित्रा 5डी)द्वारा तैयार सर्कल के भीतर शेल्टन के विकास माध्यम जोड़ें ।
  3. इक्का-दुक्का ब्लास्टोमेरे को इमेजिंग चैंबर में ट्रांसफर करें।
  4. भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार केशिका का उपयोग करके रासायनिक रूप से कार्यात्मक मोतियों की एक छोटी मात्रा को बांटें।
  5. हाथ से तैयार केशिका में उड़ाने से पॉलीस्टीरिन मोतियों की स्थिति को नियंत्रित करें जब तक कि मनका अलग-थलग ब्लास्टोमेरे को नहीं देता।
  6. मध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए एक कवरस्लिप माउंट करें(चित्रा 5ई)। लाइव इमेजिंग करें।

5. महत्वपूर्ण अभिकर्मकों की तैयारी

  1. अंडा नमक समाधान (10 mL): डीएच2ओ के 9525 माइक्रोन के साथ 5 एम एनसीएल के 235 माइक्रोन और 2 एम केसीएल के 240 माइक्रोन को मिलाएं।
  2. हाइपोक्लोराइट समाधान (10 मिलीएल): क्लोरॉक्स के 7.5 मिलील (लगभग 7.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट युक्त) को 10 एन नाओएच के 2.5 मिलील (सोडियम हाइपोक्लोराइट की अंतिम एकाग्रता लगभग 5.625% है) को मिलाएं।
    नोट: हालांकि कई प्रकाशित तरीकों ने चिटिनस अंडे के गोले को पचाने के लिए चिटिनाज़ का उपयोग किया है, हमने हाइपोक्लोराइट समाधान11का उपयोग करके एक विधि अपनाई है। चितिनेस गतिविधियों के बैच-टू-बैच विविधताओं से बचकर, हमारा मानना है कि यह विधि अधिक प्रजनन योग्य और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है।
  3. 0.81 एमएम इनुलिन सॉल्यूशन (40 mL)
    1. डीएच2ओ के 40 मीटर के लिए Inulin के 0.2 ग्राम जोड़ें।
    2. ऑटोक्लेव भंग करने के लिए।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए रहता है।
  4. 0.5 एमईएस बफर (500 मीटर)
    1. आसुत पानी (डीएच2ओ) के 400 मिलीग्राम में एमईएस के 48.81 ग्राम भंग करें।
    2. पीएच को 6.0 तक समायोजित करें।
    3. कुल मात्रा को डीएच2ओ के साथ 500 मीटर तक लाएं।
  5. पीबीएस समाधान (1 एल)
    1. 10 गुना पीबीएस समाधान बनाने के लिए, डीएच2ओ के 1 एल में पीबीएस प्रीमिक्स पाउडर के 1 पैकेज को भंग करें।
    2. डीएच2ओ के 900 मीटर के साथ 10 गुना पीबीएस समाधान के 100 मीटर गठबंधन।
  6. 5% पॉलीविनाइलपिरापोलिडोन (पीवीपी) समाधान (4 एल)
    1. बाँझ स्थितियों के तहत, ड्रोसोफिला श्नाइडर के माध्यम के 4 mL में पीवीपी के 0.2 ग्राम को भंग करें।
      नोट: हमेशा ऊतक संस्कृति (टीसी) हुड में श्नाइडर के मध्यम स्टॉक को खोलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए रखें।
  7. 0.65 एमएम रोडामिन रेड-एक्स स्टॉक सॉल्यूशन (2 मिलीएल)
    1. 1 मिलीग्राम रोडामिन रेड-एक्स का वजन।
    2. भंग करने के लिए डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) के 2 mL जोड़ें।
    3. अलीकोट और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  8. शेल्टन का विकास माध्यम (एसजीएम) (10.25 मिलीग्राम)
    1. बाँझ स्थितियों के तहत, ड्रोसोफिला श्नाइडर के माध्यम के 8 mL, पीवीपी समाधान के 1 mL, इनुलिन समाधान के 1 mL, बेसल मीडियम ईगल (बीएमई) विटामिन के 1 mL, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 माइक्रोन और लिपिड के 100 माइक्रोन को एक साथ केंद्रित करें।
    2. अलीकोट एसजीएम के 325 माइक्रोट्यूब 1.5 मिलीग्राम माइक्रोट्यूब में।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 महीने के लिए रखें।
    3. ब्लास्टोमेरे अलगाव के दिन, एसजीएम (500 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए) में भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 175 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर FBS स्टोर और उपयोग से पहले यह गल। एफबीएस को गर्मी से मारने की जरूरत नहीं है।

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Representative Results

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मोतियों की तैयारी के लिए, हमने जीएफपी-मायोसिन II और एमचेरी-हिस्टोन(चित्रा 1ए-डी)को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक तनाव के लिए रोडामिन रेड-एक्स सुसिनीमिडिल एस्टर की इष्टतम राशि निर्धारित की। हमने सेल चक्र प्रगति के मार्कर के रूप में एमचेरी टैग हिस्टोन का उपयोग किया। क्योंकि रोडाइन रेड-एक्स और एमचेरी दोनों को 561 एनएम लेजर द्वारा प्रकाशित किया जाएगा, रोडामिन रेड-एक्स सिग्नल की इष्टतम तीव्रता सेल और मनका के एक साथ इमेजिंग की अनुमति देने के लिए हिस्टोन के बराबर है। उदाहरण के लिए, मनका से फ्लोरेसेंस सिग्नल 0.005 μg/mL रोडामिन रेड-एक्स succinimidyl ester के साथ इलाज भी मनका कल्पना करने के लिए कमजोर था(चित्रा 1ए)। दूसरी ओर, 5 μg/mL रोडाइन रेड-एक्स succinimidyl ester के साथ इलाज मोतियों से फ्लोरेसेंस संकेत भी छवि mCherry-histone(चित्रा 1डी)के लिए मजबूत था । हमने निर्धारित किया है कि ०.५ μg/mL Rhodamine लाल एक्स succinimidyl ester इस विशेष ट्रांसजेनिक तनाव के लिए इष्टतम है(चित्रा 1सी)

ब्लास्टोमेरे अलगाव चित्र4में दिखाई गई प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था । सफल प्रयोगों के लिए निम्नलिखित बिंदुओं का समाधान किया जाना चाहिए। 1) कुएं में मीडिया समय के साथ वाष्पित हो जाता है और चिपचिपा हो जाता है; यह भ्रूण कांच केशिका और अन्य भ्रूण से चिपके रहने का कारण बनता है, इसलिए ताजा मीडिया के साथ एक नई अच्छी तरह से उपयोग करने की आवश्यकता होती है। 2) हाइपोक्लोराइट समाधान में, भ्रूण सतह पर तैरते हैं। इसलिए, माइक्रोस्कोप के आवर्धन को कम करें और भ्रूण के स्थानांतरित होने में आसानी के लिए बूंद की सतह पर ध्यान केंद्रित करें। 3) हाइपोक्लोराइट समाधान की प्रभावशीलता अलग हो सकती है। इसलिए, हाइपोक्लोराइट समाधान में खर्च भ्रूण की अवधि हाइपोक्लोराइट समाधान के प्रत्येक नए बैच के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। 4) पिपेट में उड़ाने के लिए उपयोग की जाने वाली ताकत को कम करने के लिए संभव के रूप में भ्रूण के करीब मुंह पिपेट रखें, लेकिन यह भी बंद नहीं है कि भ्रूण को चूसा जाए (मोती संलग्न करते समय यह भी सच है)। 5) अंडे निकालने के बाद, भ्रूण बहुत नाजुक हो जाते हैं। इसलिए, मुंह पिपेट पर लगाए गए बलों को भ्रूण को फटने से रोकने के लिए थोड़ा कम करने की आवश्यकता होती है। 6) मुंह पिपेट के लंबे समय तक उपयोग PTFE फिल्टर गीला हो सकता है, और 7) 2-सेल चरण भ्रूण ही अलग किया जाना चाहिए जब नाभिक स्पष्ट रूप से गठन किया गया है(चित्रा 4सी,छोड़ दिया योजनागत) । बरकरार भ्रूण में कोशिकाओं की तुलना में(चित्रा 4ए;सही), अंडे के बिना भ्रूण में कोशिकाओं राउंडर देखो(चित्रा 4सी;सही) । इसके अतिरिक्त, ब्लास्टोमेरे अलगाव के बाद, ब्लास्टोमेरेस का आकार गोलाकार हो जाता है(चित्र4डी;दाएं)।

सेल डिवीजन अभिविन्यास पर शारीरिक संपर्क-निर्भर क्यू के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए, हमने 2-सेल चरण से अलग एबी ब्लास्टोमेरेस के लिए रोडामिन रेड-एक्स लेपित मोतियों को संलग्न किया और लाइव-इमेजिंग(चित्रा 6, चित्रा 7)का प्रदर्शन किया। रोडामिन रेड-एक्स उपचार के बिना मनका ने ब्लास्टोमेरेस का पालन नहीं किया, जिससे यह सुझाव दिया गया कि रोडामिन रेड-एक्स फ्लोरेसेंस मार्कर और चिपकने वाले अणु दोनों के रूप में कार्य करता है। सेल डिवीजन अभिविन्यास के विश्लेषण के लिए, हमने इमेजजे12 (चित्र 6ए;वाई-एक्सिस के आसपास झुकाव) के "3डी प्रोजेक्ट" फ़ंक्शन का उपयोग करके समय-चूक छवि को 3डी खंगाला है। माइटोटिक स्पिंडल (स्पिंडल प्लेन) वाले विमान को निर्धारित करने के लिए, हमने सबसे पहले एक विमान की पहचान की जहां दो सेंट्रोसोम खड़ी गठबंधन थे(चित्र6बी;110°): इस विमान के ± 90 डिग्री कोण वाला विमान धुरी विमान(चित्रा 6बी;-20°) है। इसके बाद, हमने साइटोकिनेसिस(चित्रा 6सी)के बाद सेल-बीड संपर्क इंटरफेस (संपर्क अभिविन्यास) के सापेक्ष धुरी (स्पिंडल ओरिएंटेशन) के कोण को मापा है। जब दोनों बेटी कोशिकाओं को माड से जुड़े थे, एक लाइन है कि दोनों संपर्क साइटों गुजरता एक संपर्क अभिविन्यास के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

हमारे पिछले अध्ययन में, हमने मनका-प्रेरित एबी सेल डिवीजन ओरिएंटेशन10के दौरान एक एनिसोट्रोपिक सेल सरफेस मायोसिन प्रवाह की पहचान की है। हालांकि, ओरिएंटेड डिवीजन के दौरान सेल की चाल के रूप में इंट्रासेलर मायोसिन प्रवाह को मापना मुश्किल है। ऐसा करने के लिए, पहले हमने इमेजिंग प्लेन (xy प्लेन)(चित्रा 7)के अनुरूप धुरी के साथ नमूनों का चयन किया है। दूसरा, जेड-स्टैक अधिकतम प्रक्षेपण विधि(चित्रा 7)का उपयोग करके अनुमानित किया गया था। तीसरा, सेल आंदोलनों को कठोर शरीर विकल्प (चित्र 7बी)के साथ इमेजजे के उपपिक्सेल पंजीकरण एल्गोरिदम स्टैक रेग प्लग-इन13 का उपयोग करके ठीक किया गयाथा। छवियों के पंजीकरण से, सेल की स्थिति स्थिर थी(चित्रा 7बी)। अंत में, इमेजजे के मैनुअल ट्रैकिंग प्लग-इन का उपयोग करके, मायोसिन फोसी को ट्रैक किया गया(चित्रा 7सी)। समन्वय जानकारी के अनुसार, विभाजन धुरी के साथ मायोसिन के वेग, और इसके लिए महावर लंबवत साइटोकिनेसिस शुरुआत के बाद 50 एस के भीतर गणना की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: रोडाइन रेड-एक्स एकाग्रता का निर्धारण। (ए-डी) जीएफपी-मायोसिन (ग्रीन) और एमचेरी-हिस्टोन (मजेंटा) व्यक्त करने वाले भ्रूणों को रोडामिन रेड-एक्स (मजेंटा) की विभिन्न सांद्रता के साथ बंधे मोतियों के निकट रखा गया था। एमचेरी और रोडामिन रेड-एक्स की सिग्नल तीव्रता सफेद बिंदीदार लाइनों (नीचे रेखांकन) के साथ प्लॉट की जाती है। मोतियों और हिस्टोन संकेतों का स्पष्ट रूप से ०.५ μg/mL रोडाइन रेड-एक्स के साथ इलाज मोतियों के लिए पता चला । स्केल बार 10 माइक्रोन दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मुंह पिपेट की विधानसभा। मुंह पिपेट को पीटीएफई फिल्टर (3) के साथ संकीर्ण (1) और चौड़े (2) टायगन ट्यूबों को जोड़कर इकट्ठा किया जाता है। संकीर्ण और चौड़ी टाइगन ट्यूब के अंत में, केशिका धारक (4) और मुंह का टुकड़ा (5) क्रमशः संलग्न थे। केशिका धारक में हाथ से तैयार ग्लास केशिका (6) डाला जा सकता है। स्केल बार 50 मिमी है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: Blastomere अलगाव। (A)कांच केशिका की हाथ खींच। (ख)भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार कांच केशिका । (ग)अंडे हटाने के लिए हाथ से तैयार कांच केशिका। (D)शकरिक्स अंडे हटाने के लिए केशिका खोलने के उचित आकार को दिखाते हैं। तीर भ्रूण का संकेत देते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन दिखाते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ब्लास्टोमेरे अलगाव कार्यप्रवाह। (A)भ्रूण प्राप्त करने के लिए अंडे के नमक बफर में वयस्क सी एलिगेंस का विच्छेदन। तस्वीरें अंडे हटाने से पहले 2-सेल और 4-सेल चरण भ्रूण दिखाती हैं। (ख)हाइपोक्लोराइट उपचार और धुलाई। (ग)योजनाबद्ध अंडे हटाने के लिए उचित समय को दर्शाती है । तस्वीर अंडे के नरक हटाने के बाद एक 4 सेल चरण भ्रूण से पता चलता है । (D)ब्लास्टोमेरे अलगाव। तस्वीर एक अलग 2 सेल चरण भ्रूण से पता चलता है । सी और डी में तीर के आकार पाइपिंग के दौरान आवश्यक सापेक्ष बलों का संकेत देते हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन दिखाते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इमेजिंग चैंबर की विधानसभा । (A)कवरस्लिप धारक को कवरस्लिप संलग्न करना। (ख)एक कवरस्लिप धारक की छवियां । विधानसभा से पहले और बाद में कवरस्लिप धारक को क्रमशः बाएं और दाएं संकेत दिया जाता है। (ग)हाइड्रोफोबिक पेन के माध्यम से खींचा गया एक चक्र। (डी)शेल्टन के विकास माध्यम और सर्कल के भीतर नमूना के अलावा । (ई)वाष्पीकरण से बचने के लिए एक कवरस्लिप बढ़ते हुए। स्केल बार 50 मिमी दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: सेल डिवीजन अभिविन्यास का विश्लेषण। (A)सेल डिवीजन ओरिएंटेशन विश्लेषण का एक आरेख। (ख)धुरी विमान का निर्धारण । बाईं छवियां एक नमूने का एक उदाहरण दिखाती हैं। 3डी खंगाला 4-डी फिल्मों को वाई-एक्सिस के आसपास घुमाया गया ताकि विमान को निर्धारित किया जा सके जिसमें दो सेंट्रोसोम खड़ी संरेखित होते हैं (सही छवि; दाएं ऊपरी योजनाबद्ध) । इस उदाहरण में, धुरी विमान 110 ° (मध्य छवि; सही नीचे योजनाबद्ध) का ± 90 ° है। (ग)सेल-बीड संपर्क के सापेक्ष धुरी अभिविन्यास का मापन। स्पिंडल प्लेन की छवियों का उपयोग करना, साइटोकिनेसिस के बाद स्पिंडल ओरिएंटेशन दो सेंट्रोसोम (सही योजनाबद्ध में नारंगी बिंदीदार लाइनों) और सेल संपर्क (नीली बिंदीदार लाइनों) को जोड़ने वाली लाइनों के बीच कोण के आधार पर निर्धारित किया गया था। जब दोनों बेटी कोशिकाओं मोती से जुड़े थे, सेल मनका संपर्क अभिविन्यास लाइन है कि दोनों संपर्क साइटों गुजरता था । ग्रीन मायोसिन और सेंट्रोसोम है, मजेंटा हिस्टोन और मोतियों का है। स्केल बार 10 μm हैं । टाइम्स मिनट और सेकंड हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: मायोसिन प्रवाह का विश्लेषण। (A)मायोसिन प्रवाह विश्लेषण का एक आरेख। (ख)सेल डिवीजन ओरिएंटेशन का सुधार । इंट्रासेलर मायोसिन फ्लो डायनेमिक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए, इमेजजे प्लगइन स्टैक रेग(कठोर शरीर विकल्प) का उपयोग करके विभाजित सेल के रोटेशन को ठीक किया गया था। ऊपरी और नीचे छवियां स्टैक रेग प्रसंस्करण से पहले और बाद में होती हैं। सही अधिकांश छवियां समय श्रृंखला के लौकिक रंग कोड दिखाती हैं। (ग)मायोसिन फोसी की ट्रैकिंग। स्टैक रेग द्वारा संसाधित छवियों का उपयोग करके, इमेजजे मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन द्वारा व्यक्तिगत मायोसिन फोसी आंदोलनों को ट्रैक किया गया था। डिवीजन एक्सिस और इसके लिए लंबवत धुरी को क्रमशः एक्स और वाई (दाएं योजनाबद्ध) के रूप में परिभाषित किया गया था। एक्स और वाई एक्सिस (वीएक्स और वीई) में मायोसिन प्रवाह वेग समन्वय जानकारी के अनुसार मापा गया था। स्केल बार 10 μm हैं । टाइम्स मिनट और सेकंड हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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सरलीकृत सेल संपर्क पैटर्न का पुनर्गठन शोधकर्ताओं को मॉर्फोजेनेसिस के विभिन्न पहलुओं में विशिष्ट सेल संपर्क पैटर्न की भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए जाने देगा। हमने इस तकनीक का उपयोग यह दिखाने के लिए किया है कि सेल डिवीजन धुरी चिपकने वाले मोतियों के साथ शारीरिक संपर्क द्वारा नियंत्रित होती है10। चूंकि डिवीजन एक्सिस स्पेसिफिकेशन14,स्टेम सेल डिवीजन15,16और टिश्यू होमोस्टोसिस15,16में योगदान देकर बहुकोशिकीय विकास के लिए महत्वपूर्ण है, इस विधि को पशु ऊतक गठन के एक नए तंत्र को रोशन करने में सक्षम होना चाहिए।

सेल डिवीजन अभिविन्यास के अलावा, इस विधि में यांत्रिक संकेतों और सेल भाग्य के बीच संबंधों का परीक्षण करने के लिए एक मंच होने की क्षमता है। पिछले अध्ययनों में बताया गया है कि यांत्रिक क्यू सेल भाग्य विनिर्देश को नियंत्रित करता है। मानव मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाएं न्यूरॉन, आदिपोसाइट, कंकाल मांसपेशी कोशिका और ऑस्टियोब्लास्ट में अंतर करती हैं जब विभिन्न कठोरता17के साथ सब्सट्रेट में सुसंस्कृत होती हैं। सब्सट्रेट अकड़न के जवाब में, ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटर हां से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) और TAZ (PDZ-बाध्यकारी आकृति के साथ ट्रांसक्रिप्शनल सह-सक्रिय) कोशिका भाग्य विनिर्देश18को विनियमित करने के लिए नाभिक में स्थानांतरित हो जाएगा । चिपकने वाले मोतियों के संपर्क में सेल दीर्घकालिक रूप से खेती करके, इस पेपर में प्रस्तुत विधि सेल भाग्य विनिर्देश पर यांत्रिक संकेतों की भूमिका का परीक्षण करने के लिए भी उपयोगी होनी चाहिए।

इस विधि में वीवो में देखे गए कुछ यांत्रिक संकेतों को फिर से दोहराने में सीमाएं हैं। सी एलिगेंसमें, चिटिनस अंडे और परगम्यता बाधा एक शारीरिक बाधा के रूप में काम करती है। हालांकि अंडे के नरक को हटाने से सामान्य विकास प्रभावित नहीं होता है, अंडे के नरक और परगम्यता बाधा दोनों को हटाने से असामान्य पैटर्न गठन19होता है। अंडे के नरक और स्थायित्व बाधा के अभाव में, कोशिका आकार अधिक गोलाकार हो जाता है, यह सुझाव देता है कि कोशिकाओं और सेल-एगशेल के बीच दबाव कोशिका विरूपण और पैटर्निंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दरअसल, सेल डिवीजन ओरिएंटेशन20को विनियमित करने के लिए सेल सेल निचोड़ बलों का प्रस्ताव किया गया है । ऊतकों के बीच शारीरिक विवश और ख्यात दबाव के बिना, हम उम्मीद करते हैं कि यह विधि वीवो सेल संपर्क क्षेत्र में भी पुनर्कांफ़ नहीं हो सकती है। चूंकि सेल संपर्क क्षेत्र को नॉच सिग्नलिंग21को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, इसलिए इस सीमा पर आगे विचार करने की आवश्यकता है जब कुछ यांत्रिक या रासायनिक क्यू इस इन विट्रो विधि का उपयोग करके काम नहीं करता है।

हमने अब तक हमारे हाथों10में अलग एबी, पी 1, ईएमएस, पी 2, एबीए, एबीपी कोशिकाओं (6 सेल चरणों तक की कोशिकाओं) के सेल डिवीजन अभिविन्यास का परीक्षण किया है, लेकिन जहां तक व्यक्तिगत सेल को अलग किया जा सकता है, विधि को बाद के विकास पर लागू किया जा सकता है। हाल ही में एकल कोशिका अनुक्रमण अध्ययन ने लार्वा कोशिका22को अलग करने के लिए कृमि शरीर के प्रोनसे पाचन का उपयोग किया है । इसलिए, संभावित रूप से एक बाद में चरण भ्रूण कोशिकाओं और लार्वा कोशिकाओं को अलग करने के लिए pronase उपचार का उपयोग कर सकते हैं।

इस अध्ययन में, हमने यांत्रिक क्यू और सेल डिवीजन अभिविन्यास के बीच बातचीत का उदाहरण दिखाया, लेकिन सेल-सेल संचार को रासायनिक संकेतों जैसे कि WNt23,पायदान24,आसंजन युग्मित रिसेप्टर्स25 और इतने पर मध्यस्थों द्वारा मध्यस्थता भी की जाती है। महत्वपूर्ण बात, यहां प्रस्तुत मोतियों की तैयारी विधि किसी भी प्रोटीन के साथ मोती जोड़े जा सकती है, जिससे रासायनिक संकेतों के पुनर्गठन की अनुमति मिल सकती है। पिछले अध्ययनों में भी सेफलोस मनका26 और प्रोटीन-एक चुंबकीय मनका27 Wnt प्रोटीन के साथ लेपित करने के लिए Wnt पर निर्भर विकास प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया है । हालांकि, ये मोती कारबॉक्सिलेट संशोधित पॉलीस्टीरिन मोतियों की तुलना में विभिन्न आकारों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। इसलिए, भविष्य के अनुसंधान एक मंच के रूप में प्रस्तुत विधि का उपयोग करने के लिए दोनों अधिक tunable शिष्टाचार में रासायनिक और शारीरिक संकेतों की भूमिका का परीक्षण कर सकते हैं । एक साथ लिया, यह विधि शोधकर्ताओं के लिए अनुकूल है, जो सेलुलर व्यवहार और प्रतिक्रियाओं का अध्ययन कर रहे हैं जो स्थानिक कोशिका संपर्क पैटर्न से परिणाम देते हैं और अन्य सेलुलर संकेतों को खत्म करना चाहते हैं।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम सलाह के लिए जेम्स प्रिस और ब्रूस बोवरमैन को धन्यवाद देते हैं और सी एलिगेंस उपभेदों, डॉन मोएर्मैन, कोटा मिज़ुमोटो और लाइफ साइंसेज इंस्टीट्यूट इमेजिंग कोर फैसिलिटी को उपकरण और रिएजेंट्स साझा करने के लिए, एओआई हिरोयासु, लिसा फर्नांडो, मिन जेईई किम सी एलिगेंस के रखरखाव और हमारी पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए प्रदान करते हैं। हमारे काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), (RGPIN-2019-04442) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

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References

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अलग <em>कैनोरहैबडिटिस एलिगेंस</em> भ्रूण ब्लास्टोमेरेस और चिपकने वाला पॉलीस्टीरिन मोतियों के साथ स्थानिक सेल संपर्क पैटर्न के विट्रो पुनर्गठन में
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Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

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