अलग कैनोरहैबडिटिस एलिगेंस भ्रूण ब्लास्टोमेरेस और चिपकने वाला पॉलीस्टीरिन मोतियों के साथ स्थानिक सेल संपर्क पैटर्न के विट्रो पुनर्गठन में
Summary
बहुकोशिकीय प्रणालियों की ऊतक जटिलताओं ने बाह्युलर संकेतों और व्यक्तिगत सेलुलर व्यवहार के बीच कारण संबंध की पहचान को चकित कर दिया। यहां, हम सी एलिगेंस भ्रूण ब्लास्टोमेरेस और चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग करके संपर्क-निर्भर संकेतों और विभाजन कुल्हाड़ियों के बीच सीधे लिंक का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
बहुकोशिकीय प्रणालियों में, व्यक्तिगत कोशिकाएं पड़ोसी कोशिकाओं और पर्यावरण से आने वाले विभिन्न भौतिक और रासायनिक संकेतों से घिरी हुई हैं। यह ऊतक जटिलता बाह्य संकेतों और सेलुलर गतिशीलता के बीच कारण लिंक की पहचान को चकित करती है। एक सिंथेटिक पुनर्गठित बहुकोशिकीय प्रणाली शोधकर्ताओं को दूसरों को नष्ट करते हुए एक विशिष्ट क्यू के लिए परीक्षण करने में सक्षम बनाकर इस समस्या पर काबू पा देती है । यहां, हम अलग-थलग कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस ब्लास्टोमेरे और चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों के साथ सेल संपर्क पैटर्न का पुनर्गठन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रक्रियाओं में एगशेल हटाने, सेल-सेल आसंजन को बाधित करके ब्लास्टोमेरे अलगाव, चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों की तैयारी और सेल-सेल या सेल-मनका संपर्क का पुनर्गठन शामिल है। अंत में, हम इस विधि के आवेदन को सेलुलर डिवीजन कुल्हाड़ियों के अभिविन्यास की जांच करने के लिए प्रस्तुत करते हैं जो भ्रूण के विकास में स्थानिक सेलुलर पैटर्निंग और सेल भाग्य विनिर्देश के नियमन में योगदान देता है। यह मजबूत, प्रजनन योग्य और बहुमुखी इन विट्रो विधि स्थानिक कोशिका संपर्क पैटर्न और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बीच प्रत्यक्ष संबंधों के अध्ययन को सक्षम बनाती है।
Introduction
बहुकोशिकीय विकास के दौरान, अलग-अलग कोशिकाओं के सेलुलर व्यवहार (उदाहरण के लिए, विभाजन धुरी) विभिन्न रासायनिक और भौतिक संकेतों द्वारा निर्दिष्ट किए जाते हैं। यह समझने के लिए कि व्यक्तिगत कोशिका इस जानकारी की व्याख्या कैसे करती है, और वे बहुकोशिकीय असेंबली को एक आकस्मिक संपत्ति के रूप में कैसे विनियमित करते हैं, यह मॉर्फोजेनेसिस अध्ययन ों के अंतिम लक्ष्यों में से एक है। मॉडल ऑर्गेज्म सी एलिगेंस ने कोशिका ध्रुवीकरण1,सेल डिवीजन पैटर्निंग1,सेल भाग्य निर्णय2और न्यूरोनल वायरिंग3 और ऑर्गेनोजेनेसिस4,5जैसे ऊतक-पैमाने के नियमों जैसे मॉर्फोजेनेसिस के सेलुलर स्तर के नियमन की समझ में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। हालांकि विभिन्न आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं, ऊतक इंजीनियरिंग विधियां सीमित हैं।
सी एलिगेंस अध्ययन में सबसे सफल ऊतक इंजीनियरिंग विधि शास्त्रीय ब्लास्टोमेरे अलगाव6है; के रूप में सी elegans भ्रूण एक अंडे और एक स्थायित्व बाधा7से घिरा हुआ है, उनके हटाने इस विधि की मुख्य प्रक्रियाओं में से एक है । हालांकि यह ब्लास्टोमेरे अलगाव विधि एक सरलीकृत तरीके से सेल-सेल संपर्क के पुनर्गठन को सक्षम बनाती है, यह अवांछित संकेतों के उन्मूलन के लिए अनुमति नहीं देती है; सेल संपर्क अभी भी दोनों यांत्रिक (जैसे, आसंजन) और रासायनिक संकेतों बन गया है, जिससे हमारे लिए पूरी तरह से क्यू और सेलुलर व्यवहार के बीच कारण संबंध का विश्लेषण करने की क्षमता सीमित ।
इस पेपर में प्रस्तुत विधि कार्बोसिलेट संशोधित पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग करती है जो किसी भी अमीन-प्रतिक्रियाशील अणुओं को बांध सकती है जिसमें प्रोटीन के रूप में लिगांड शामिल हैं। विशेष रूप से, हमने कोशिका के लिए नेत्रहीन ट्रैक करने योग्य और चिपकने वाले दोनों मोतियों को बनाने के लिए एक लिगाड के रूप में रोडामाइन रेड-एक्स के एक अमीन-प्रतिक्रियाशील रूप का उपयोग किया। मनका सतह और लिगामेंट अणु के प्राथमिक अमीन समूहों के कार्बोसिल समूहों को पानी में घुलनशील कार्बोडिमिड 1-एथिल-3-(डिमेथिलामिनोप्रोपिल) कार्बोडिमाइड (ईडैक)8,9के साथ मिलकर किया जाता है। प्राप्त चिपकने वाले मोती सेलुलर गतिशीलता10पर यांत्रिक क्यू के प्रभाव के लिए अनुमति देते हैं। हमने सेल डिवीजन ओरिएंटेशन10के लिए आवश्यक यांत्रिक संकेतों की पहचान करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सरलीकृत सेल संपर्क पैटर्न का पुनर्गठन शोधकर्ताओं को मॉर्फोजेनेसिस के विभिन्न पहलुओं में विशिष्ट सेल संपर्क पैटर्न की भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए जाने देगा। हमने इस तकनीक का उपयोग यह दिखाने के लि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सलाह के लिए जेम्स प्रिस और ब्रूस बोवरमैन को धन्यवाद देते हैं और सी एलिगेंस उपभेदों, डॉन मोएर्मैन, कोटा मिज़ुमोटो और लाइफ साइंसेज इंस्टीट्यूट इमेजिंग कोर फैसिलिटी को उपकरण और रिएजेंट्स साझा करने के लिए, एओआई हिरोयासु, लिसा फर्नांडो, मिन जेईई किम सी एलिगेंस के रखरखाव और हमारी पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए प्रदान करते हैं। हमारे काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), (RGPIN-2019-04442) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
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