Summary
Hücre dışı matriks (dECM) tasarlanmış bir yapıda hedef dokuların doğal işlevlerini yeniden özetlemek için uygun mikroçevresel ipuçları sağlayabilir. Bu makalede pankreas dokusunun desellülsizasyonu için protokoller açıklanmıştır, pankreas dokusu kaynaklı dECM bioink decm dECM değerlendirilmesi, ve 3D pankreas dokusu üretimi bir biyobaskı tekniği kullanılarak inşa eder.
Abstract
Pankreas adacıklarının nakli hipoglisemi ve sekonder komplikasyonlar eşliğinde tip 1 diyabet muzdarip hastalar için umut verici bir tedaviyöntemidir. Ancak, adacık nakli nin kötü adacık engraftment ve düşmanca ortamlar nedeniyle nakledilen adacıkların düşük canlılığı gibi çeşitli sınırlamalar hala vardır. Buna ek olarak, insan pluripotent kök hücrelerinden farklı insülin üreten hücreler kan şekeri seviyesini düzenleyen yeterli hormonsssalgılamak için sınırlı yeteneği var; bu nedenle, uygun mikroçevresel ipuçları ile hücreleri kültürleme tarafından olgunlaşma iyileştirilmesi kuvvetle gereklidir. Bu makalede, pankreas adacıklarının glikoz duyarlılığını artırabilecek yararlı bir mikroortam sağlamak için pankreas dokusu ndan elde edilen hücre dışı matriks (pdECM) biyoink hazırlanması için protokolleri açıklar, ardından 3D pankreas dokusu oluşturma süreçleri mikroekstrüzyon tabanlı biyobaskı tekniği kullanılarak oluşturur.
Introduction
Son zamanlarda, pankreas adacık nakli tip 1 diyabetli hastalar için umut verici bir tedavi olarak kabul edilmiştir. Göreceli güvenlik ve prosedürün minimal invazivlik bu tedavinin büyük avantajları vardır1. Ancak, izole adacıkların düşük başarı oranı ve immünsupresif ilaçların yan etkileri gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Ayrıca, engrafted adacık ların sayısı sürekli olarak ekim sonrası düşmancaçevre2 nedeniyle azalır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için pankreas adacık transplantasyonuna aljinat, kollajen, poli (laktik-koglikolik asit) (PLGA) veya polietilen glikol (PEG) gibi çeşitli biyouyumlu malzemeler uygulanmıştır.
3D hücre baskı teknolojisi, büyük potansiyeli ve yüksek performansı nedeniyle doku mühendisliğinde gelişmektedir. Söylemeye gerek yok, bioinks uygun bir mikroortam sağlamak ve basılı doku yapıları hücresel süreçlerin iyileştirilmesi sağlayan önemli bileşenleri olarak bilinir. Fibrin, aljinat ve kollajen gibi makas inceltme hidrojelleri önemli sayıda yaygın bioinks olarak kullanılır. Ancak, bu malzemeler in doğal dokuda ekstrasellüler matris (ECM) ile karşılaştırıldığında yapısal, kimyasal, biyolojik ve mekanik karmaşıklık eksikliği göstermektedir3. Adacıklar ve ECM arasındaki etkileşimler gibi mikroçevresel ipuçları adacıkların işlevini artırmak için önemli sinyallerdir. Hücreli ECM (dECM) kollajen, glikozaminoglikanlar (GAGs) ve glikoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli ECM bileşenlerinin dokuya özgü bileşimini yeniden oluşturabilir. Örneğin, periferik AK'larını koruyan birincil adacıklar (örneğin, tip I, III, IV, V ve VI kollajen, laminin ve fibronektin) düşük apoptoz ve daha iyi insülin hassasiyeti sergilerler, böylece dokuya özgü hücre-matriks etkileşimlerinin orijinal doku4'ebenzer şekilde çalışma yeteneklerini artırmak için önemli olduğunu gösterirler.
Bu yazıda, pankreas adacıklarının aktivitesini ve işlevlerini artırmak için yararlı mikroçevresel ipuçları sağlamak için pankreas dokusu kaynaklı hücre dışı matriks (pdECM) bioink hazırlanması için protokolleri açıklamak, bir mikroeksistasyon tabanlı biyobaskı tekniği kullanarak 3D pankreas dokusu yapıları oluşturmak için süreçler takip(Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Domuz eti pankreas dokuları yerel bir mezbaha dan toplandı. Hayvan deneyleri Asan Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı, Seul, Kore.
1. Doku decellularization
- Hücre dışılaştırma için çözümler hazırlayın.
NOT: Tüm çözelti preparatlarında kullanılan 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 10x PBS'ye distile su eklenerek seyreltilir.- %1 Triton-X 100 çözümü için, 100 mL 100 mL 100 mL 1x PBS 1x 1x 150 rpm'de karıştırma çubuğu kullanarak 100 mL 100 mL çözündür. PBS kullanımdan hemen önce hazırlanır.
NOT: %10 Triton-X 100 çözeltisi ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında saklanabilir. - %0,1 perasetik asit çözeltisi için, 8,5 mL perasetik asitten %4,7'lik perasetik asidi 22,8 mL'lik 70 mL etanol ve 368,7 mL distile su kullanmadan hemen önce seyreltin.
- %1 Triton-X 100 çözümü için, 100 mL 100 mL 100 mL 1x PBS 1x 1x 150 rpm'de karıştırma çubuğu kullanarak 100 mL 100 mL çözündür. PBS kullanımdan hemen önce hazırlanır.
- Pankreasın periferik dokuları çıkarın ve decellularization önce doku dilim.
- Rezeke domuz pankreasını akan musluk suyuyla yıkayın ve sterilize makas kullanarak periferik dokuları çıkarın.
- Forseps ile plastik bir torbaya pankreas aktarın ve bir sonraki adım için etkili bir şekilde pankreas kesmeye yardımcı olmak için 1 saat için -80 °C dondurun.
- Dondurulmuş pankreası bir rende kullanarak 1 mm kalınlığında parçalar halinde dilimleyin.
- Dilimlenmiş dokunun 50 g'ını 500 mL plastik bir kap içine aktarın.
NOT: Burada, dokuları kontaminasyondan korumak ve çözelti buharlaşmasını önlemek için kapaklı plastik bir kap önerilir.
- Reaktiflerle tedavi.
NOT: Tüm hücre dışılaştırma işlemi 150 rpm'de dijital orbital shaker üzerinde 4 °C'de yapılmalıdır. Tüm decellularization adımlarda, fiziksel müfreze kullanarak forceps birlikte yapışmasını pankreas dilimleri önlemek için gereklidir. Konteynerin distile su ile yıkanması, artık reaktiflerin tamamen kapta çıkarılması için gereklidir.- Herhangi bir reaktif işlemeden önce, bir shaker kullanarak distile su 300 mL ile dilimlenmiş pankreas 50 g yıkayın.
- Bulutlu su kaybolana kadar (yaklaşık 12 saat sonra) 150 rpm sürekli doku karıştırın. Damıtılmış suyu her 2 saatte bir değiştirin.
NOT: Bulutlu suyun daha hızlı temizlenmesi için her saat demıtılmış suyun değiştirilmesi tavsiye edilir. - Suyu atın ve 50 g mendilin 400 mL'si ile 1x PBS çözeltisinde %1 Triton-X 100 ile 84 saat boyunca çözeltiyi yenileyin.
NOT: Bu noktada, hücresel bileşenler çıkarılmaya başladığından doku miktarı azalır. - Pankreastan kalan yağ kaldırmak için 2 saat için isopropanol 400 mL ile tedavi edin .
NOT: Bu süreçte yağ ın alınması nedeniyle dokunun sertleşmesi normaldir. - 2 saat sonra IPA'yı çıkarın ve 24 saat boyunca 400 mL 1x PBS ile dokuyı yıkayın.
- Hücredışı dokuyu sterilize etmek için önceki çözeltiyi atın ve 400 mL%0.1 perasetik asit ile 2 saat boyunca %4 etanolde tedavi edin.
- Artık deterjanı çıkarmak için, 6 saat boyunca 400 mL 1x PBS ile dokuyu yıkayın.
- Dejeneratize edilmiş dokuları 50 mL'lik konik bir tüpte forceps ile toplayın.
- Numuneyi -80 °C'de 1 saat boyunca dondurun. Konik tüpü kapak yerine tüy bırakmayan bir mendille kapatın ve verimli bir şekilde linofizasyon için bir lastik bantla düzeltin.
- -50 °C'de 4 d için hücreli dokuyu lyophilize.
NOT: 1.3. adım için, hücre dışı olmayan doku1 g de aynı koşullar altında dondurularak kurutulmalıdır.
2. Hücre dışı dokuların değerlendirilmesi
NOT: DsDNA, glikozaminoglikan (GAGs) ve kollajen in decellularized doku doğal doku ile karşılaştırıldığında kalıntı miktarını değerlendirmek için, dejeneratif olmayan doku (yerli doku) ve desellüler doku her biri en az 1 g gereklidir bir değerlendirme toplu. DSDNA, GAGs ve kollajen miktarı dokunun kuru ağırlığına göre hesaplanabilir.
- Biyokimyasal tahliller için çözümler hazırlayın.
- Örnek sindirim için papain çözeltisi hazırlayın.
NOT: Yapılacak arabellek miktarı örnek sayısına göre ayarlanabilir.- Çözün 119 mg 0.1 M sodyum fosfat (monobazik), 18.6 mg 0.5 mM Na2-EDTA, ve 8.8 mg 5 mM sistein-HCl 10 mL otoklavlı su.
- 10 M NaOH çözeltisi ekleyerek çözeltinin pH'ını 6,5'e ayarlayın.
- Yukarıdaki çözeltiye ve girdaba 125 mg/mL papain stok çözeltisi ekleyerek her bir elementin eşit şekilde karışmasını bekleyin.
- Dimetil-metilen mavisi (DMMB) teşbibi için çözümler hazırlayın.
- DMMB boya yapmak için, 1,9-dimethyl-metilen mavi çinko klorür çift tuz 8 mg çözünür, glisin 1.52 g, ve NaCl 1.185 g 500 otoklavlı su mL. Tezgah üstü pH metre kullanarak pH değişimini ölçerken 0,5 M HCl çözeltisi ekleyerek pH'ı 3'e ayarlayın. Ardından, bunu 500 mL'lik şişe üstü vakum filtresine filtreleyin.
- 15 μL 10 mg/mL kondroitin sülfat Standart için bir çözelti yapın.
- Hidroksiproline titretisi için çözümler hazırlayın.
- Kloramin çalışma çözeltisi için, 2,4 g sodyum asetat, 1 g sitrik asit ve 0,68 g sodyum hidroksiti 24 mL distile suda çözün ve 240 μL buzul asetik asit, 10 μL toluen ve 6 mL IPA ekleyin.
NOT: Girdap mikseri kullanarak tüm tozları çözelti halinde çözün. Kloramin çalışma çözeltisi 4 °C'de üç aya kadar saklanabilir. - Kloramin T çözeltisi için, 0,35 g kloramin T'yi 20 mL kloramin çalışma çözeltisinde çözünve 2,5 mL IPA ekleyin. Girdap tüm bileşenleri karıştırmak için.
NOT: Kullanmadan hemen önce hazırlayın. - P-DAB çözeltisi için, 6,5 mL perklorik asit ve 15 mL IPA içine 3,75 g P-DAB koyun; alüminyum folyo sarın.
NOT: Kullanmadan hemen önce hazırlayın.
- Kloramin çalışma çözeltisi için, 2,4 g sodyum asetat, 1 g sitrik asit ve 0,68 g sodyum hidroksiti 24 mL distile suda çözün ve 240 μL buzul asetik asit, 10 μL toluen ve 6 mL IPA ekleyin.
- Örnek sindirim için papain çözeltisi hazırlayın.
- 1.5 mL mikrosantrifüj tüp ve daha iyi örnek sindirmek için tüp girdap lyophilized doku 10 mg papain çözeltisi 1 mL ekleyin.
- 1,5 mL mikrosentrifüj tüpünü kauçuk bir rafa yerleştirin ve numuneleri 60 °C'de 16 saat boyunca 300 mL su içeren 500 mL'lik bir kabın içine sindirin.
- 20 dk için 9.500 x g santrifüj, supernatant toplamak ve yeni bir tüp içine aktarın.
- Hücreleşmiş dokudaki artık DNA ve ana proteinleri ölçün.
- Sindirilmiş numunenin 1 μL'sini spektrometreye yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre dsDNA miktarını ölçün.
NOT: Deneyci, numuneyi kirletmemek için saçlarını arkaya bağlamalı ve maske takmalıdır.
- Sindirilmiş numunenin 1 μL'sini spektrometreye yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre dsDNA miktarını ölçün.
- Hücredışı dokuda kalan GAG miktarını ölçmek için bir DMMB testi gerçekleştirin.
- Standartları yapmak için 1 μL kondroitin sülfat A çözeltisi ve 499 μL 1x PBS'yi karıştırın. Kondroitin sülfatı seyreltin 0, 4, 8, 12, 16 ve 20 μg/mL konsantrasyonlarda distile su ile bir çözelti.
- Standart ve sindirilmiş numunelerin her konsantrasyonunun 50°L'lik kısmını 96 kuyulu bir tabağa yükleyin.
- Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 200 μL DMMB boya ekleyin.
- Hemen bir mikroplaka okuyucu üzerinde 525 nm de emici okuyun.
- Kollajen miktarını ölçmek için bir hidroksiproline testi gerçekleştirin.
- Hidroksiprolin testini yapmak için, 120 °C'de 16 saat boyunca eşit hcl hacimlerde 250 μL sindirilmiş numuneyi kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri soğutmak için oda sıcaklığındaki artıkları 3 saat kurulayın ve numuneleri 1 mL 1x PBS'de yeniden çözün.
- 4 °C'de 10 dk için 2.400 x g santrifüj.
- Standart olarak 100 μg/mL hidroksiprolin çözeltisi hazırlayın.
- Standart bir çözelti için 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL konsantrasyonda distile suile hidroksiprolin çözeltisi.
- 50 μL numune ve standart çözeltinin üçe trilycatelerini 96 kuyulu bir tabağa yükleyin.
- 50 μL Kloramin T çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- 50 μL p-DAB çözeltisi ekleyin ve 60 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Aliquot karanlık bir odada. Eklemeden sonra, alüminyum folyo ile plaka sarın. - 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Soğuduktan sonra, bir mikroplaka okuyucu üzerinde 540 nm emici ölçün.
3. Bioink hazırlama
NOT: pdECM tozu -80 °C'de en az bir yıl saklanabilir. pH ayarı yapılmadan önce sindirilmiş pdECM çözeltisi -20 °C'de bir ay saklanabilir. Kullanmadan önce, dondurulmuş pdECM çözeltisi örneğini bir gecede 4 °C'de eritin. PH ayarlı pdECM çözeltisi 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir. Sindirilmiş pdECM çözeltisi en az birkaç gün 4 °C'de saklanabilir ancak 1 haftayı geçmemelidir.
- Pepsin ile dondurulmuş pdECM sindirin.
- Bioink etkili sindirim için, bir harç ve havaneli kullanarak sıvı azot ile lyophilized pdECM pulverize.
- 50 mL konik tüpte pdECM tozunun 200 mg'ını toplayın ve pepsin'in 20 mg'ını ve 0,5 M asetik asitin 8,4 mL'sini ekleyin (son konsantrasyon 2 w/v%).
- Manyetik karıştırma çubuğunu 50 mL konik tüpe yerleştirin ve 300 rpm'de 96 saat karıştırın.
- Sindirilmiş pdECM çözeltisinin pH'ını ayarlayın.
NOT: PH ayarı öncesi jelleşmeyi önlemek için bu işlem buz üzerinde yapılmalıdır.- Parçaların optimum sindirimini elde etmek için buz üzerinde pozitif yer değiştirme pipeti kullanarak 40 μm hücreli süzgeç kullanarak pdECM çözeltisindeki sindirilmemiş parçacıkları filtreleyin.
- NaOH kullanmadan önce 10x PBS ve girdap 1 mL ekleyin.
- pH gösterge şeritleri ile pH kontrol 10 M NaOH ile 7 pH ayarlayın.
NOT: Girdap her zaman NaOH eklenir böylece bioink iyice diğer reaktifler ile karıştırılır.
4. Reolojik analiz
- Deneysel kurulum
- Reolojik özellikleri değerlendirmek için pdECM bioink%1.5 (w/v) hazırlayın.
- Bir reometrenin hız kontrollü modunda 20 mm koni plaka geometrisi (2° açı ile 20 mm koni çapı) kurutucu modunu kurun.
- PDECM bioink viskozite, jelleşme kinetik ve dinamik modülü ölçmek için yüklü yazılım (TRIOS) deneysel dizileri oluşturun.
- Viskozite: pdECM bioink'i plakaya yerleştirin. PDECM bioink'in karmaşık viskozitesini (Pa·s) 1ila 1.000 s-1'e kadar artan bir kesme hızı altında 15 °C sabit sıcaklıkta ölçün.
- Jelasyon kinetiği: pdECM bioink'i plakaya yerleştirin. PDECM bioink'in depolama ve kayıp modüllerini 4-37 °C'de 5 °C/dk (zaman süpürme modu) artımlı artış hızıyla ölçerek karmaşık modülü (G*) hesaplayın.
- Dinamik modül: PdECM bioink'i ölçümden önce 60 dk boyunca 37 °C'de plakaüzerine yerleştirin. PdECM bioink'in frekansa bağlı depolama modülünü (G') ve kayıp modülünü (G'') 0,1-100 rad/s aralığında %2 gerilme de ölçün.
5. Pankreas dokusunun 3D hücre baskı adacık kullanılarak inşa eder
- İzole adacıkların hazırlanması
- Bir önceki çalışmada açıklanan protokollere göre birincil adacıkları bir sıçandan yalıtmak5.
- Yalıtılmış isletten enkaz ve ölü hücreleri ayırmak için hücre süspansiyonundan 70 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Çapı 70 μm'den küçük olan adacıklar ölü veya anormal olarak kabul edilir.
- RPMI-1640 orta izole adacıklar askıya ve petri kabına yerleştirin. Biyogüvenlik kabininde mikroskop (4x objektif lens) altında P200 hacimli pipet kullanarak çapı 300 μm'den büyük adacıkları çıkarın.
- pdECM bioink içine adacık kapsülleme
- pH ayarlı pdECM bioink ve izole adacık hazırlayın.
NOT: pH ayarı yapılmadan önce jelleşmeyi önlemek için bu işlem buz üzerinde yapılmalıdır. - PdECM bioink'i ve askıya alınan ortamı adacıklarla (oran 3:1) pozitif bir deplasman pipeti kullanarak tek düze karıştırılıncaya kadar hafifçe karıştırın.
NOT: PDECM bioink son konsantrasyonu 1.5% ve pdECM bioink hücre yoğunluğu 3.000 IEQ / mL olduğunu.
- pH ayarlı pdECM bioink ve izole adacık hazırlayın.
- Pankreas dokusu nun 3Boyutlu hücre baskısı yapır
- Sterilize şırınga ve 22 G nozul hazırlayın.
NOT: Bu gösterge, çapı 100-250 m olan adacıkların basımı için seçilmiştir. - Şırıngaya adacık yüklü pdECM bioink yükleyin.
- Bioink'i en iyi baskı durumuna göre (besleme hızı: 150 mm/dak; pnömatik basınç: 15 kPa) 18 °C'de kafes şeklinde yazdırın.
- Bioink çapraz bağlantı için, 30 dakika için kuvöz baskılı yapı yerleştirin.
- RPMI-1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / mL penisilin ve 100 U/ mL streptomisin ile birlikte olan adacık kültür medya içine basılı yapı batırın.
- Sterilize şırınga ve 22 G nozul hazırlayın.
6. Desenli yapı ile pankreas yapı3D hücre baskı
- Bioink iki tip hazırlanması
- Birden fazla bioink kullanarak baskı çok yönlülüğünü doğrulamak için, pdECM bioinks iki set hazırlamak ve her pdECM bioink içine% 0.4 Trypan Blue ve Rose Bengal çözeltisi ekleyerek onları leke 1:20, sırasıyla.
NOT: pH ayarı yapılmadan önce jelleşmeyi önlemek için bu işlem buz üzerinde yapılmalıdır. - PdECM bioink'i ve askıya alınan ortamı adacıklarla (oran 3:1) pozitif bir deplasman pipeti kullanarak tek düze karıştırılıncaya kadar hafifçe karıştırın.
NOT: PDECM bioink son konsantrasyonu 1.5% ve pdECM bioink hücre yoğunluğu 3.000 IEQ / mL olduğunu.
- Birden fazla bioink kullanarak baskı çok yönlülüğünü doğrulamak için, pdECM bioinks iki set hazırlamak ve her pdECM bioink içine% 0.4 Trypan Blue ve Rose Bengal çözeltisi ekleyerek onları leke 1:20, sırasıyla.
- Çok malzeme tabanlı pankreas dokusu nun 3Boyutlu hücre baskısı yapır
- Sterilşine şırıngalar ve 25 G nozul hazırlayın.
- Her bioink (mavi ve kırmızı) iki farklı şırınga, sırasıyla yük.
- Bioink'i optimize baskı durumuna (besleme hızı: 150 mm/dak; pnömatik basınç: 15 kPa) 18 °C'de mavi ve kırmızı dan oluşan alternatif çizgilere sahip bir kafes şeklinde yazdırın.
- Bioink çapraz bağlantı için, 30 dakika için kuvöz baskılı yapı yerleştirin.
- RPMI-1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / mL penisilin ve 100 U/ mL streptomisin ile birlikte olan adacık kültür medya içine basılı yapı batırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pankreas dokularının hücredışılaştırılması
3Boyutlu biyobaskılı doku yapısında adacıkların işlevselliğini artırmak için pankreas dokusuna özgü mikroortamlar sağlamak için pdECM bioink hazırlama sürecini geliştirdik(Şekil 2A). Desellülerizasyon işleminden sonra dsDNA'nın %97.3'ü çıkarılmış ve kollajen ve GAG gibi temsili ECM bileşenleri sırasıyla yerli pankreas dokusuna göre %1278.1 ve %96.9'da kalmıştır (Şekil 2B).
Bioink hazırlama
PdECM'yi baskı işleminde uygulamak için pdECM tozu pepsin ile zayıf asit içinde çözündü ve 10 M NaOH çözeltisi kullanılarak nötralize edildi. Sindirilmiş pdECM çözeltisi daha sonra bir hücre kültürü orta veya 1x PBS ile karıştırma yoluyla seyreltilmiş olabilir. Bu çalışmada daha ileri çalışma için %1.5 nihai konsantrasyonda pdECM bioink hazırladık. PDECM bioink, oda sıcaklığına yerleştirildiğinde bir çözelti fazı korumuş ve 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkadan sonra anında jel fazına dönüştürülmüştür. pdECM bioink'in adacıklar üzerindeki etkisini araştırmak için izole adacıklar pdECM, aljinat ve kollajen bioinklerde %1.5 konsantrasyonda kapsüllendi. Glukoz uyarılmış insülin sekresyonu testi nin sonucu pdECM bioink adacıkları gösterdi (yaklaşık 3.174) deneysel gruplar arasında en yüksek indeks temsil, adacık kapsülleme için yaygın olarak uygulanan hidrojeller üzerinde daha yüksek işlevsellik gösteren5.
Romatolojik analiz
Yazdırılabilir biyomalzeme düşünüldüğünde viskozite kritik özelliklerinden biridir. Çeşitli dECM bioinks6,7,8yazdırmak için 1 ila 1.000 Hz arasında değişen bir frekansta pdECM bioink viskozite ölçülen 15 °C . PDECM bioink kesme-inceltme davranışı gösterdi ve değeri yaklaşık 10 Pa·s 1/s kesme hızında, pdECM bioink bir meme yoluyla ekstrüzyon için uygun reolojik özelliklere sahip olduğunu gösteren(Şekil 3A). 4 ila 37 °C arasında değişen bir sıcaklıktaki jelasyon kinetiği pdECM bioink'in fizyolojik olarak ilgili sıcaklıklarda jelleşme davranışını göstermiştir. Karmaşık modül sıcaklık 15 °C'ye ulaştığında artmaya başladı ve sıcaklık 37 °C'de korunduğunda hızla arttı, bu da pdECM bioink 'in sol-jel geçişini gösteriyor(Şekil 3B). PDECM bioink'in dinamik G' ve G"leri, baskı işleminden sonra stabilitesini sağlamak için fizyolojik olarak ilgili sıcaklıklarda incelenmiş ve bu da frekans süpürme koşulu altında istikrarlı bir modüle sahip olmakla sonuçlanmıştır(Şekil 3C).
3B hücre yazdırma
3D hücre yüklü pankreas dokusu yapıları mikroekstrüzyon tabanlı baskı işlemi kullanılarak imal edildi. Çapı 150 μm9olan mükemmel küresel bir adaletin doku hacmine karşılık gelen en az 3.000 Adacık eşdeğeri (IEQ) içeren bir yapı inşa etmek için, 10 mm x 10 mm x 3 mm(Şekil 4A)boyutunda bir yapı tasarladık. 100-250 μm çapında büyük hücresel kümeler olan adacıkların saklanması için pankreas adacıklarının basılması için proses parametreleri ve koşulları seçilmiştir(Şekil 4B). Çok başlı baskı sistemi kullanılarak, mavi ve kırmızı alternatif çizgilere sahip kafesin şekli gibi çeşitli 3D yapılar, geliştirilen pdECM(Şekil 4C)kullanılarak, doku benzeri bir düzenlemede iki veya daha fazla canlı hücre türünü uyumlu hale getirmek için 3D biyobaskı amacıyla pdECM'nin çok yönlülüğünü gösteren imal edilmiştir.
Şekil 1: Desellülerleşmiş pankreas dokusunun gelişimi şeması, pdECM bioink değerlendirilmesi ve 3D pankreas dokusu yapılışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücreselleştirme sürecinin temsili görüntüleri ve pdECM biyokimyasal karakterizasyonu. (A) Domuz pankreas dokusunun desellülerizasyon genel bakış. (B) Yerli doku ve pdECM biyokimyasal tahlil sonuçları. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Telif Hakkı (2019) Kraliyet Kimya Derneği5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: pdECM biyoink reolojik analizi. (A) Makas inceltme davranışı sergileyen pdECM ve kollajen biyoinklerin viskozitesi. (B) Sıcaklık değişimi sırasında pdECM ve kollajen bioinklerin gelasyon kinetiği. (C) Çapraz bağlı pdECM ve kollajen bioinks kompleks modülü. Telif Hakkı (2019) Royal Society of Chemistry5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 3D pankreas dokusu yapıları için hücre yüklü pdECM bioink 3D hücre baskı. (A) 3D pankreas dokusunun boyutları yapılar. (B) Pankreas adacık yüklü ve (C) multimaterial tabanlı 3D pankreas dokusu yapıları. Telif Hakkı (2019) Royal Society of Chemistry5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, pdECM bioinks gelişimi ve 3D hücre baskı teknikleri kullanılarak 3D pankreas dokusu yapıları imalatı açıklanmıştır. 3D mühendislik doku yapısında hedef dokunun mikro ortamını özetlemek için bioink seçimi çok önemlidir. Bir önceki çalışmada, dokuya özgü dECM bioinks kök hücre farklılaşması ve çoğalması teşvik etmek için yararlı olduğunu doğruladı10. Sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında, dECM dokuya özgü kompozisyon ve mimarisi nedeniyle hücre açısından elverişli bir ortam olarak hizmet verebilir11. Bu nedenle, decellularization süreci ciddi dECM ana bileşenlerin yüksek tutma için düşünülmelidir.
Pankreas dokusunun decellularization için farklı deterjanların seçimi kalıntı ECM bileşeni değişir12. Desellülerizasyon sürecinde, sodyum dodecyl sülfat (SDS) kullanımının ECM proteinlerinin kaybını etkileyebileceğini fark ettik13. Böylece, Trion-X 100 veya 3-[(3-cholamidopropyl) dimetil-lammonio(CHAPS) gibi diğerlerine göre nispeten sert özelliklere sahip birçok temizlik ve desellülerizasyon prosesanında kullanılan iyonik bir yüzeyaktif madde olan SDS çözeltisinin tedavisi için adımı ortadan kaldırarak önceki protokolümüzü değiştirdik. Bu protokolde, GAG'ları ve kolajnöz proteinleri korurken hücresel bileşenleri etkin bir şekilde çıkarabilen SDS çözeltisi yerine 84 saat için %1 Triton-X 100 solüsyonu kullandık. Buna ek olarak, biz IPA ile tedavi ederek artık lipidlerin kaldırılması da pdECM bioink crosslinking indüklemek için çok önemli bir süreç olduğunu kaydetti ve daha önce yayınlanan bir makale4olarak aynı bağlamda anlaşılabilir . Hücredışı dokunun sterilizasyonuiçin perasetik asit solüsyonu ile tedavi de uygulandı. Buna ek olarak, desellüler dokuda kalan deterjan ve kimyasalların çıkarılması inflamatuar konak yanıtını önlemek için önemli bir adımdır. Ancak bu konuyu bu protokolde tartışmadık. Hücredışılaştırma sonunda bir sanitizasyon işlemi içeren protokoller decellularized malzemenin biyouyumluluğu artıracaktır. Ayrıca, deterjan ve kimyasalların tamamen ortadan kaldırılmasını sağlamak için değerlendirme kriterleri için standartlar göz önünde bulundurulmalıdır.
PdECM bioink'in pepsin ile sindirimi, kollajen proteindeki telopeptid bölgesinin bölünmesi ile asidik çözeltideki pdECM tozunun homojen bir şekilde karıştırılması için yapıldı. pH ayarlama işleminde pdECM bioink'inbuzüzerinde tutulması jelleşmenin korunması için çok önemlidir. Daha sonra, dECM tabanlı bioinks ana avantajlarından biri olan 37 °C'de kuluçka yadarak bir jel durumuna girebilen fiziksel olarak çapraz bağlanabilir pdECM pre-jel bioinks üretebiliriz. pdECM bioink uygun konsantrasyon seçimi de önemlidir10. İdeal bir bioink pnömatik basınç ve sıcaklık değişimi gibi baskı işlemi sırasında meydana gelen dış hasarhücreleri korumak gerekir. Uygulanan kesme kuvvetinin hücrelere zarar verebileceği ve basılı yapılarda hücre canlılığını azaltabileceği bilinmektedir10. Ayrıca, biyoink konsantrasyonlarını artırmak hücre ölümü neden olabilir5. Buna karşılık, bioink düşük konsantrasyonları baskı sırasında kötü yazdırılabilirlik ve şekil-sadakat anlamına gelir düşük viskozite neden olur. Bioink viskozitesini kontrol etmek ve konsantrasyonunu optimize etmek gereklidir.
Şu anda, araştırmacılar aktif 3D doku yapıları14,15,16baskı için doku kaynaklı bioinks çeşitli gelişimini inceliyorlar. Bu çalışmaların sonuçları bioink hücreler için dokuya özgü mikroortamlar sağlayabilir göstermektedir. Bu benzersiz koşullar kök hücrelerin farklılaşmasını veya olgunlaşmasını ve hücrelerin çoğalmasını teşvik edebilir. Ayrıca, çok başlı donanımlı 3D hücre baskı sistemi kullanarak aynı anda yüksek hassasiyetle bioinks birden fazla türde yazdırmak mümkün kılar. Bu teknik kullanılarak, belirli bir desenile bir yapı üretilebilir, böylece tasarım çok yönlülük gösteren. Buna ek olarak, her biyoink içine hücrelerin farklı türde kapsüllemek için doğal hücre düzeni taklit etmek mümkündür17. Bu desenli yapılar vaskülarizasyon veya ko-kültür etkisi indüksiyon hücre-hücre etkileşimleri geliştirerek kullanılabilir, hangi belirli hücrelerin uzun vadeli hayatta kalma önemli faktörler olabilir18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Bu araştırma, Kore hükümeti (MSIT) (2017M3A9C6032067) ve "BİT Eşzamanlılık Yaratıcı Programı" (IITP-2019-1-00783) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme programı tarafından desteklenmiştir. IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation) tarafından denetlenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M.
