Summary
Decellularized ekstracellulære Matrix (dECM) kan gi egnede microenvironmental signaler for å recapitulate de iboende funksjonene til målet vev i en konstruert konstruere. Denne artikkelen kaster protokollene for decellularization av bukspyttkjertelen vev, evaluering av bukspyttkjertelen vev-avledet dECM bioink, og generering av 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner ved hjelp av en bioprinting teknikk.
Abstract
Transplantasjon av bukspyttkjertelen holmer er en lovende behandling for pasienter som lider av type 1 diabetes ledsaget av hypoglykemi og sekundære komplikasjoner. Imidlertid har Holme transplantasjon fortsatt flere begrensninger som lav levedyktighet av transplanterte holmer på grunn av dårlig Holme engraftment og fiendtlige miljøer. I tillegg har insulin-produserende celler differensiert fra humant Pluripotent stamceller begrenset evne til å skille ut tilstrekkelige hormoner som kan regulere blodsukkeret; Derfor, forbedre modning av dyrking celler med riktig microenvironmental signaler er sterkt nødvendig. I denne artikkelen, vi belyse protokoller for å utarbeide en bukspyttkjertel vev-avledet decellularized ekstracellulære matrise (pdECM) bioink å gi en gunstig mikromiljøet som kan øke glukose følsomhet av bukspyttkjertelen holmer, etterfulgt av beskriver prosessene for å generere 3D bukspyttkjertel vev konstruksjoner ved hjelp av en microextrusion-basert bioprinting teknikk.
Introduction
Nylig, bukspyttkjertel Holme transplantasjon har vært betraktet som en lovende behandling for pasienter med type 1 diabetes. Den relative sikkerhet og minimale invasiveness av prosedyren er store fordeler ved denne behandlingen1. Men det har flere begrensninger som lav suksess rate av isolere holmer og bivirkninger av immunsuppressiv narkotika. Videre synker antall engrafted holmer jevnt etter transplantasjon på grunn av fiendtlig miljø2. Ulike biokompatible materialer som alginat, kollagen, Poly (melkes-co-glykolsyre acid) (PLGA) eller polyetylen-glykol (PEG) har blitt brukt til bukspyttkjertelen Holme transplantasjon for å overvinne disse vanskelighetene.
3D celle utskrift teknologi fremstår i vev engineering på grunn av sitt store potensial og høy ytelse. Unødvendig å si, bioinks er kjent som viktige komponenter for å gi en passende mikromiljøet og muliggjør forbedring av cellulære prosesser i trykt vev konstruksjoner. Et betydelig antall skjær-tynning hydrogeler som fibrin, alginat, og kollagen er mye brukt som bioinks. Men disse materialene viser en mangel på strukturelle, kjemiske, biologiske og mekaniske kompleksitet i forhold til ekstracellulære matrise (ECM) i native tissue3. Microenvironmental signaler som samspillet mellom holmer og ECM er viktige signaler for å forbedre funksjonen av holmer. Decellularized ECM (dECM) kan gjenskape den vevs spesifikke sammensetningen av ulike ECM-komponenter, inkludert kollagen, glykosaminoglykaner (GAGs) og glykoproteiner. For eksempel, primær holmer som beholder sin perifere ECMs (f. eks, type I, III, IV, V, og VI kollagen, laminin, og fibronektin) viser lav apoptose og bedre insulinfølsomhet, og dermed indikerer at vev-spesifikke celle-matrise interaksjoner er viktig for å forbedre deres evne til å fungere på samme måte som originale vev4.
I denne utredningen belyse vi protokoller for å utarbeide bukspyttkjertel vev-avledet decellularized ekstracellulære matrise (pdECM) bioink for å gi gunstige microenvironmental stikkord for å øke aktiviteten og funksjonene til bukspyttkjertelen holmer, etterfulgt av prosessene for å generere 3D bukspyttkjertel vev konstruksjoner ved hjelp av en microextrusion-basert bioprinting teknikk (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Svin bukspyttkjertelen vev ble samlet inn fra et lokalt slakteri. Animal eksperimenter ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Asan Medical Center, Seoul, Korea.
1. vev decellularization
- Klargjør løsningene for decellularization.
Merk: 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) som brukes i alle løsninger preparater er fortynnet ved å legge destillert vann til 10x PBS.- For 1% Triton-X 100-oppløsning kan du oppløse 100 mL på 100% Triton-X 100 oppløsning i 900 mL av 1x PBS ved hjelp av en magnetisk rør linje med omrøring ved 150 RPM for 6 t. lag 400 mL 1% Triton-X 100-løsning med 40 mL 10% Triton-X 100-løsning og 360 mL 1x PBS forberedt like før bruk.
Merk: 10% Triton-X 100-oppløsning kan oppbevares ved romtemperatur inntil nødvendig. - For 0,1% peredikksyre bli yre oppløsning, fortynne 8,5 mL på 4,7% peredikksyre bli syre i 22,8 mL av 70% etanol med 368,7 mL destillert vann like før bruk.
- For 1% Triton-X 100-oppløsning kan du oppløse 100 mL på 100% Triton-X 100 oppløsning i 900 mL av 1x PBS ved hjelp av en magnetisk rør linje med omrøring ved 150 RPM for 6 t. lag 400 mL 1% Triton-X 100-løsning med 40 mL 10% Triton-X 100-løsning og 360 mL 1x PBS forberedt like før bruk.
- Fjern det perifere vevet i bukspyttkjertelen og skjær vevet før decellularization.
- Vask resected svin bukspyttkjertelen med rennende vann fra springen og fjerne perifere vev ved hjelp sterilisert saks.
- Overfør bukspyttkjertelen til en plastpose med tang og Frys ved-80 ° c i 1 time for å bidra til å skjære bukspyttkjertelen effektivt for neste trinn.
- Skjær frosne bukspyttkjertelen i 1 mm tykke biter ved hjelp av et rivjern.
- Overføring 50 g av skiver vev i en 500 mL plastbeholder.
Merk: en plastbeholder med lokk anbefales her for å beskytte vev mot forurensning og hindre injeksjons fordampning.
- Behandling med reagenser.
Merk: hele decellularization prosessen skal utføres ved 4 ° c på en digital orbital shaker ved 150 RPM. I alle decellularization trinn, fysisk avløsning bruker tang er nødvendig for å hindre skiver av bukspyttkjertel fra stikker sammen. Det er nødvendig å vaske beholderen med destillert vann for å fjerne rester av reagensene helt i beholderen.- Før noen reagens behandling, vask 50 g skiver bukspyttkjertel med 300 mL destillert vann ved hjelp av en shaker.
- Rør vevet kontinuerlig ved 150 RPM til det skyet vannet forsvinner (etter ca 12 h). Bytt ut destillert vann hver 2 h.
Merk: endring av destillert vann hver time er anbefalt for effektivitet for å fjerne det skyet vannet raskere. - Kast vannet og behandle 50 g av vev med 400 mL 1% Triton-X 100 i 1x PBS løsning for 84 h. Oppdater løsningen hver 12 h.
Merk: på dette punktet, vil mengden av vev reduseres fordi mobilnettet komponentene begynner å bli fjernet. - Behandle med 400 mL isopropanol (IPA) for 2 t for å fjerne gjenværende fett fra bukspyttkjertelen.
Merk: det er normalt at vevet blir tøft på grunn av fjerning av fett i denne prosessen. - Etter 2 timer, Fjern IPA og vask vevet med 400 mL 1x PBS for 24 h. Oppdater 1x PBS hver 12 h.
- For å sterilisere decellularized vev, kast den forrige løsningen og behandle med 400 mL 0,1% peredikksyre bli syre i 4% etanol for 2 t.
- For å fjerne rester av vaskemiddel, vask vevet med 400 mL 1x PBS for 6 h. Oppdater løsningen hver 2 h.
- Samle decellularized vev i en 50 mL konisk rør med tang.
- Frys prøven ved-80 ° c for 1 h. dekk det koniske røret med en lofri serviett i stedet for lokket og fest med et gummistrikk for effektiv lyophilization.
- Lyophilize det decellularized vevet ved-50 ° c for 4 d.
Merk: for trinn 1,3, 1 g av ikke-decellularized vev bør også fryse-tørket under de samme forholdene.
2. vurdering av decellularized vev
Merk: for å evaluere restbeløpet av dsDNA, glykosaminoglykaner (GAGs), og kollagen i decellularized vev sammenlignet med innfødt vev, minst 1 g av hver av de ikke-decellularized vev (innfødt vev) og decellularized vev er nødvendig for en gruppe med vurdering. Mengden av dsDNA, GAGs, og kollagen kan beregnes basert på den tørre vekten av vevet.
- Forbered løsninger for biokjemiske analyser.
- Forbered Papain løsning for prøve fordøyelsen.
Merk: mengden av buffer som skal gjøres kan justeres i henhold til antall prøver.- Oppløsning 119 mg 0,1 M natrium fosfat (enbasisk), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA, og 8,8 mg 5 mM cystein-HCl i 10 mL autoklaveres vann.
- Juster pH-verdien i løsningen til 6,5 ved å legge til 10 M NaOH-løsning.
- Tilsett 125 μL av 10 mg/mL Papain lagerløsning til ovenstående løsning og Vortex, slik at hvert element blandes jevnt.
- Klargjør løsninger for dimethyl-metylen blå (DMMB)-analyse.
- For å gjøre DMMB fargestoff, oppløse 8 mg 1, 9-dimethyl-metylen blå sinkklorid dobbel salt, 1,52 g Glycine, og 1,185 g av NaCl i 500 mL autoklaveres vann. Juster pH til 3 ved å legge 0,5 M HCl løsning under måling av endring av pH ved hjelp av en benk-Top pH meter. Deretter filtrerer dette gjennom et 500 mL flaske topp vakuum filter.
- Lag 15 μL av 10 mg/mL Chondroitin sulfat en løsning for standard.
- Forbered løsninger for hydroksyprolin analysen.
- For chloramine arbeids løsning, oppløse 2,4 g natrium acetate, 1 g sitronsyre, og 0,68 g natriumhydroksid i 24 mL destillert vann og tilsett 240 μL av isbre eddiksyre, 10 μL av toluen, og 6 mL IPA.
Merk: oppløse alle pulver i løsningen ved hjelp av en Vortex mikser. Chloramine arbeids løsning kan oppbevares ved 4 ° c i inntil tre måneder. - For chloramine T-løsning, oppløses 0,35 g chloramine T i 20 mL chloramine arbeids løsning og tilsett 2,5 mL IPA. Vortex å blande alle komponenter.
Merk: Forbered umiddelbart før bruk. - For P-DAB-løsning, Legg 3,75 g P-DAB i 6,5 mL perklorsyreblank syre og 15 mL IPA; vikle den i aluminiumsfolie.
Merk: Forbered umiddelbart før bruk.
- For chloramine arbeids løsning, oppløse 2,4 g natrium acetate, 1 g sitronsyre, og 0,68 g natriumhydroksid i 24 mL destillert vann og tilsett 240 μL av isbre eddiksyre, 10 μL av toluen, og 6 mL IPA.
- Forbered Papain løsning for prøve fordøyelsen.
- Tilsett 1 mL Papain oppløsning til 10 mg lyofilisert vev i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube og Vortex røret for å bedre fordøye prøven.
- Plasser 1,5 mL mikrosentrifugen slange i en gummi rack og fordøye prøvene i et 500 mL beger som inneholder 300 mL vann ved 60 ° c i 16 timer.
- Sentrifuger på 9 500 x g i 20 min, samle supernatanten, og overføre den til et nytt rør.
- Kvantifisere det resterende DNA og store proteiner i decellularized vev.
- Legg 1 μL av fordøyd prøven inn i spektrometer og mål mengden dsDNA i henhold til produsentens anvisninger.
Merk: eksperimentator skal knytte håret tilbake og bære en maske for å unngå forurensende prøven.
- Legg 1 μL av fordøyd prøven inn i spektrometer og mål mengden dsDNA i henhold til produsentens anvisninger.
- Utfør en DMMB analysen for å kvantifisere mengden av GAGs som forblir i decellularized vev.
- Bland 1 μL av Chondroitin sulfat en løsning og 499 μL av 1x PBS å lage standarder. Fortynne Chondroitin sulfat en løsning med destillert vann ved konsentrasjoner av 0, 4, 8, 12, 16 og 20 μg/mL.
- Last triplicates på 50 μL av hver konsentrasjon av standard og fordøyd prøver i en 96-brønn plate.
- Tilsett 200 μL av DMMB fargestoff i hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Umiddelbart lese absorbansen på 525 NM på en mikroplate leser.
- Utfør en hydroksyprolin analysen å kvantifisere mengden av kollagen.
- For å gjennomføre en hydroksyprolin analyse, ruge 250 μL av fordøyd prøve med like volumer av HCl ved 120 ° c i 16 timer.
- Tørk rester ved romtemperatur i 3 timer for å avkjøle prøvene og deretter oppløse prøvene i 1 mL 1x PBS.
- Sentrifuger på 2 400 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Klargjør 100 μg/mL hydroksyprolin oppløsning som standard.
- Fortynne hydroksyprolin løsning med destillert vann ved en konsentrasjon på 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL for en standard løsning.
- Last triplicates på 50 μL av prøver og standard løsning i en 96-brønn plate.
- Tilsett 50 μL av chloramine T-oppløsning, og ruge deretter i 20 min ved romtemperatur.
- Tilsett 50 μL av p-DAB-oppløsning og ruge i 30 min ved 60 ° c.
Merk: Alikvot i et mørkt rom. Etter tilsetning, vikle platen med aluminiumsfolie. - Ruge ved romtemperatur i 30 min.
- Etter avkjøling måler du absorbansen ved 540 NM på en mikroplate-leser.
3. Bioink forberedelse
Merk: pdECM pulver kan oppbevares stabilt ved-80 ° c i minst ett år. Før pH-justering kan den fordøyd pdECM-løsningen oppbevares ved-20 ° c i en måned. Før bruk, tine prøven av frossen pdECM løsning ved 4 ° c over natten. Den pH-justerte pdECM-løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil en uke. Den fordøyd pdECM løsningen kan lagres ved 4 ° c i minst et par dager, men bør ikke overstige 1 uke.
- Fordøye fryse-tørket pdECM med pepsin.
- For effektiv fordøyelse av bioink, lyofilisert pdECM med flytende nitrogen ved hjelp av en mørtel og morter.
- Samle 200 mg av pdECM pulver i 50 mL konisk rør og tilsett 20 mg pepsin og 8,4 mL av den 0,5 M eddiksyre (endelig konsentrasjon er 2 w/v%).
- Plasser den magnetiske rør linjen i 50 mL konisk rør og rør på 300 RPM for 96 h.
- Juster pH i fordøyd pdECM løsning.
Merk: for å unngå gelation før pH-justering, bør denne prosessen utføres på isen.- Filtrer ut de ufordøyd partiklene i pdECM-løsningen ved hjelp av en celle sil i 40 μm ved hjelp av en positiv Forskyvnings pipette på isen for å oppnå optimal fordøyelse av deler.
- Tilsett 1 mL av 10x PBS og Vortex før du bruker NaOH.
- Juster pH til 7 med 10 M NaOH sjekke pH med pH-indikator strimler.
Merk: Vortex hver gang NaOH legges til slik at bioink blandes grundig med de andre reagensene.
4. reologiske analyse
- Eksperimentell oppsett
- Klargjør 1,5% (w/v) av pdECM-bioink for å vurdere reologiske egenskaper.
- Etablere en 20 mm kjegle plate geometri (membran diameter på 20 mm med en 2 ° vinkel) i rate-kontrollerte modus av en rheometer.
- Opprett eksperimentelle sekvenser i den installerte programvaren (TRIOS) for å måle viskositet, gelation Kinetics og dynamisk modul for pdECM-bioink.
- Viskositet: Plasser pdECM-bioink på platen. Mål kompleks viskositet (pa · s) av pdECM bioink under en økende skjær hastighet fra 1 til 1 000 s-1 ved en konstant temperatur på 15 ° c.
- Gelation Kinetics: Plasser pdECM bioink på tallerkenen. Beregn den komplekse modulen (G *) ved å måle lager-og taps modulen til pdECM bioink ved 4-37 ° c med en trinnvis øknings hastighet på 5 ° c/min (tids feie modus).
- Dynamisk modul: Plasser pdECM-bioink på platen ved 37 ° c i 60 min. før måling. Mål frekvens avhengig lagrings modul (G ') og tap modul (G ' ') av pdECM bioink i området 0,1-100 rad/s ved 2% belastning.
5.3D celle utskrift av bukspyttkjertelen vev konstruerer ved hjelp av Holme
- Fremstilling av isolerte holmer
- Isoler primær holmer fra en rotte i henhold til protokollene beskrevet i et tidligere arbeid5.
- For å skille rusk og døde celler fra den isolerte Holmen, pass cellen suspensjon gjennom en 70 μm celle sil. Holmer med en diameter mindre enn 70 μm anses som døde eller unormale.
- Suspendere de isolerte holmer i RPMI-1640 medium og plassere dem på Petri parabolen. Fjern holmer som er større enn 300 μm i diameter ved hjelp av en P200 volum pipette under mikroskopet (4X objektiv linse) i biosafety skapet.
- Islet innkapsling i pdECM bioink
- Forbered pH justert pdECM bioink og isolerte Holme.
Merk: for å unngå gelation før pH-justering, skal denne prosessen utføres på is. - Bland forsiktig pdECM bioink og Media suspendert med holmer (ratio 3:1) ved hjelp av en positiv forskyvning pipette til jevnt blandet.
Merk: den endelige konsentrasjonen av pdECM-bioink er 1,5% og celle tettheten i pdECM-bioink er 3 000 IEQ/mL.
- Forbered pH justert pdECM bioink og isolerte Holme.
- 3D celle utskrift av bukspyttkjertelen vev konstruksjoner
- Klargjør en sterilisert sprøyte og 22 G munnstykke.
Merk: denne måleren ble valgt for utskrift holmer med en diameter på 100-250 μm. - Legg Holmen-Laden pdECM bioink inn i sprøyten.
- Skriv ut bioink med den optimale utskrifts betingelsen (fôr hastighet: 150 mm/min; pneumatisk trykk: 15 kPa) ved 18 ° c i form av et gitter.
- For å krysskobling bioink, plasser den trykte konstruksjonen i inkubator i 30 min.
- Dypp den trykte konstruksjonen inn i Holmen kultur Media som er RPMI-1640 medium supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 U/mL Streptomycin.
- Klargjør en sterilisert sprøyte og 22 G munnstykke.
6.3D celle utskrift av bukspyttkjertelen konstruere med mønstret struktur
- Utarbeidelse av to typer av bioink
- For å validere utskrifts allsidigheten ved hjelp av flere bioinks, klargjør du to sett med pdECM-bioinks og beis dem ved å legge til 0,4% Trypan Blue-og Rose Bengal-løsningen i hver pdECM-bioink i et forhold på 1:20, henholdsvis.
Merk: for å unngå gelation før pH-justering, bør denne prosessen gjennomføres på is. - Bland forsiktig pdECM bioink og Media suspendert med holmer (ratio 3:1) ved hjelp av en positiv forskyvning pipette til jevnt blandet.
Merk: den endelige konsentrasjonen av pdECM-bioink er 1,5% og celle tettheten i pdECM-bioink er 3 000 IEQ/mL.
- For å validere utskrifts allsidigheten ved hjelp av flere bioinks, klargjør du to sett med pdECM-bioinks og beis dem ved å legge til 0,4% Trypan Blue-og Rose Bengal-løsningen i hver pdECM-bioink i et forhold på 1:20, henholdsvis.
- 3D celle utskrift av multimaterial-basert bukspyttkjertelen vev konstruksjoner
- Forbered sterilisert sprøyter og en 25 G dyse.
- Legg hver bioink (blå og rød) i to forskjellige sprøyter, henholdsvis.
- Skriv ut bioink med optimal utskrifts tilstand (fôr hastighet: 150 mm/min; pneumatisk trykk: 15 kPa) ved 18 ° c i en form av et gitter med vekslende linjer med blått og rødt.
- For å krysskobling bioink, plasser den trykte konstruksjonen i inkubator i 30 min.
- Senk trykket konstruere til Holme kultur medier som er RPMI-1640 medium supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 U/mL Streptomycin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization av bukspyttkjertelen vev
Vi utviklet prosessen for å utarbeide pdECM-bioink for å gi bukspyttkjertel spesifikke microenvironments for å forbedre funksjonaliteten til holmer i en 3D-bioprinted vevs konstruksjon (figur 2a). Etter decellularization prosessen, 97,3% av dsDNA ble fjernet og representative ECM komponenter som kollagen og GAGs forble på 1278,1% og 96,9% sammenlignet med det av det opprinnelige bukspyttkjertelen vev, henholdsvis (figur 2B).
Bioink forberedelse
For å bruke pdECM i utskriftsprosessen, pdECM pulveret ble solubilized i svak syre med pepsin og nøytralisert ved hjelp av 10 M NaOH løsning. Den fordøyd pdECM løsningen kan deretter fortynnes gjennom miksing med en cellekultur medium eller 1x PBS. I denne studien forberedte vi pdECM bioink ved en endelig konsentrasjon på 1,5% for videre studier. PdECM-bioink opprettholdt en løsnings fase da den ble plassert under romtemperatur og umiddelbart omgjort til en gel-fase etter inkubasjons ved 37 ° c i 30 minutter. For å undersøke effekten av pdECM bioink på holmer ble isolerte holmer innkapslet i pdECM, alginat og kollagen bioinks ved en konsentrasjon på 1,5%. Resultatet av glukose-stimulert insulin sekresjon test viste holmer i pdECM bioink representerte den høyeste indeksen (ca 3,174) blant de eksperimentelle grupper, noe som indikerer høyere funksjonalitet over mye brukt hydrogeler for Holme innkapsling5.
Reologiske analyse
Viskositet er en av de kritiske egenskapene når du vurderer en utskriftsvennlig biomaterialet. Vi målte viskositet av pdECM bioink med en frekvens fra 1 til 1 000 Hz ved 15 ° c for utskrift av ulike dECM bioinks6,7,8. Den pdECM bioink viste skjær tynning atferd og verdien var ca 10 pa · s ved skjær hastighet på 1/s, indikerer pdECM bioink hadde hensiktsmessig reologiske egenskaper for ekstrudering gjennom en dyse (Figur 3a). Gelation Kinetics ved en temperatur fra 4 til 37 ° c indikerte den gelation atferden til pdECM-bioink ved fysiologisk relevante temperaturer. Den komplekse modulen begynte å øke når temperaturen nådde 15 ° c, og den økte raskt når temperaturen ble opprettholdt ved 37 ° c, noe som indikerer sol-gel overgangen til pdECM-bioink (Figur 3B). Den dynamiske G ' og G "av pdECM bioink ble undersøkt ved fysiologisk relevante temperaturer for å sikre sin stabilitet etter utskriftsprosessen, noe som resulterte i å ha en stabil modul under frekvens feie tilstand (Figur 3C).
3D-celle utskrift
3D celle-Laden bukspyttkjertelen vev konstruksjoner ble fabrikkert ved hjelp av en microextrusion-basert utskrift prosess. For å bygge en konstruksjon som inneholder minst 3 000 Holme ekvivalenter (IEQ), som tilsvarer vev volumet av en perfekt sfærisk Holme med en diameter på 150 μm9, utformet vi konstruksjonen med en dimensjon på 10 mm x 10 mm x 3 mm (Figur 4a). Prosessparametrene og betingelsene for trykking av bukspyttkjertelen ble valgt ut til kapsler holmer, som er store celle klynger i størrelser som spenner 100-250 μm i diameter (fig. 4B). Ved hjelp av en multi-Head utskrift system, ulike typer 3D konstruksjoner-for eksempel formen på gitteret har alternative linjer med blått og rødt-ble fabrikkert ved hjelp av utviklet pdECM (Figur 4C), indikerer allsidigheten til pdECM i den hensikt å 3D bioprinting å harmonisere to eller flere typer levende celler i en vev-lignende ordning.
Figur 1: skjematisk utvikling av decellularized bukspyttkjertelen vev, evaluering av pdECM bioink og fabrikasjon av 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative bilder av decellularization prosessen og biokjemiske karakterisering av pdECM. (A) oversikt over decellularization av svin bukspyttkjertel vev. (B) resultater av biokjemiske analyser av innfødte vev og pdECM. Feilfelt viser standardavvik. Opphavsrett (2019) Royal Society of kjemi5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: reologiske analyse av pdECM bioink. (A) viskositet av pdECM og kollagen bioinks som viste skjær tynning atferd. (B) gelation Kinetics av pdECM og kollagen bioinks under temperatur endring. (C) kompleks modul av krysskoblet pdECM og kollagen bioinks. Copyright (2019) av The Royal Society of kjemi5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:3D celle utskrift av celle-Laden pdECM bioink for 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner. (A) dimensjonene av 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner. (B) bukspyttkjertelen Holme-Laden og (C) multimaterial-baserte 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner. Copyright (2019) av The Royal Society of kjemi5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskrev utviklingen av pdECM bioinks og fabrikasjon av 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner ved hjelp av 3D-celle utskrift teknikker. For å recapitulate mikromiljøet av mål vevet i 3D utviklet vev konstruere, valg av bioink er kritisk. I en tidligere studie, validerte vi at vev-spesifikke dECM bioinks er gunstig for å fremme Stamcelle differensiering og spredning10. Sammenlignet med syntetiske polymerer, kan dECM tjene som en celle-gunstig miljø på grunn av vev-spesifikk sammensetning og arkitektur11. Derfor bør decellularization prosessen seriøst vurderes for høy oppbevaring av viktige komponenter i dECM.
Valg av forskjellige vaskemidler for decellularization av bukspyttkjertelen vev varierer gjenværende ECM-konstituerende12. I prosessen med decellularization, la vi merke til at bruk av natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS) kan påvirke tap av ECM proteiner13. Derfor endret vi vår forrige protokoll ved å eliminere trinnet for behandling av SDS løsning, som er en ioniske overflateaktivt middel som brukes i mange rengjøring og decellularization prosesser med relativt harde egenskaper i forhold til de andre som Trion-X 100, eller 3-[(3-cholamidopropyl) dimethyl-lammonio] -1-propanesulfonate (KARER). I denne protokollen, brukte vi 1% Triton-X 100-oppløsning for 84 t i stedet for SDS-løsning, som var i stand til å fjerne cellulære komponenter effektivt samtidig som GAGs og Collagenous proteiner bevares. I tillegg bemerket vi at fjerning av resterende lipider ved å behandle med IPA er også en svært viktig prosess for å indusere Cross Linking av pdECM bioink og det kan forstås i samme sammenheng som en tidligere publisert artikkel4. Behandling med peredikksyre bli syre løsning ble også brukt for sterilisering av decellularized vev. I tillegg er fjerning av de resterende vaskemidler og kjemikalier i decellularized vev et avgjørende skritt for å hindre inflammatorisk vert respons. Vi diskuterte imidlertid ikke dette problemet i denne protokollen. Protokoller som inkluderer en sanitization prosess ved slutten av decellularization, vil forbedre biokompatibilitet av det decellularized materialet. Videre bør standarder for evalueringskriterier vurderes for å sikre at vaskemidler og kjemikalier fjernes fullstendig.
Fordøyelsen av pdECM bioink med pepsin ble utført for å oppnå homogen blanding av pdECM pulver i den sure løsningen ved kløft av telopeptide regionen i Collagenous protein. I pH Justeringsprosessen, holde pdECM bioink på isen er avgjørende for bevaring av gelation. Etterpå kan vi produsere fysisk crosslinkable pdECM pre-gel bioinks som kan angi en gel stat ved incubating ved 37 ° c, som er en av de viktigste fordelene med dECM-baserte bioinks. Valg av riktig konsentrasjon av pdECM bioink er også viktig10. En ideell bioink bør beskytte celler fra ytre skade som oppstår under utskriftsprosessen, for eksempel pneumatisk trykk og temperatur endring. Det er kjent at den anvendte skjærkraft kan forårsake skade på cellene og redusere celle levedyktigheten i den trykte konstruksjoner10. Også forsterke konsentrasjoner av bioink kunne indusere celle død5. I kontrast, lave konsentrasjoner av bioink induserer lav viskositet som betyr dårlig utskriftsevnen og form-Fidelity under utskrift. Det er nødvendig å sjekke viskositet av bioink og optimalisere konsentrasjonen.
Tiden, forskere er aktivt studere utviklingen av ulike typer vev-avledet bioinks for utskrift 3D vev konstruksjoner14,15,16. Resultatene av disse studiene tyder på at bioink kan gi vevs spesifikke microenvironments for celler. Disse unike forhold kan fremme differensiering eller modning av stamceller og spredning av celler. Videre bruker multi-Head utstyrt 3D celle-utskrift systemet gjør det mulig å skrive ut flere typer bioinks med høy presisjon samtidig. Ved hjelp av denne teknikken, kan en struktur med et bestemt mønster produseres, og dermed viser design allsidighet. I tillegg er det mulig å kapsler inn forskjellige typer celler i hver bioink å etterligne native celle arrangement17. Disse mønstrede strukturene kan benyttes i induksjon av endometrial blodkar eller co-kultur effekt ved å forbedre celle-til-celle interaksjoner, som kan være viktige faktorer i den langsiktige overlevelse av spesifikke celler18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av bio & Medical Technology Development program for National Research Foundation (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT) (2017M3A9C6032067) og "IKT Consilience Creative program" (IITP-2019-2011-1-00783) tilsyn av IITP (Institutt for informasjons & Communications Technology Planning & evaluering).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
